曼氏無針烏賊hsp70克隆及序列分析【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　水產(chǎn)養(yǎng)殖</b></p><p>　　曼氏無針烏賊Hsp70克隆及序列分析</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><

2、p>　　熱休克蛋白是生物體內(nèi)與抗逆相關(guān)的一類十分重要的蛋白。除高溫誘導外，許多損傷因素、應(yīng)激刺激（如缺血、缺氧、重金屬離子、氨基酸類似物、病毒感染、DNA損傷、自由基等）作用后，都可以導致細胞發(fā)生熱休克反應(yīng)（谷文萍, 1999），誘導熱休克蛋白的合成。在不同條件引起的熱休克反應(yīng)中，熱休克蛋白發(fā)揮著多方面的作用（Martin, 1999）。熱休克蛋白超家族(Heat shock protein superfamily)是一類進化上高

3、度保守的蛋白。這個家族包括至少6個亞家族：Hsp110家族，Hsp90家族，Hsp70家族，Hsp60家族，Hsp20家族（小熱休克蛋白家族），泛素（Ubiquitin）等。</p><p>　　熱休克蛋白70（Hsp70）家族是熱休克蛋白超家族的重要成員，分子量約為68KD~74KD。熱休克蛋白70除了具有分子伴侶的功能以外，在消除重金屬污染對機體造成的損傷（Urani, 2001; Ward, 2001），調(diào)

4、節(jié)受體數(shù)量（Helen, 2001），調(diào)理細胞凋亡（Chen, 2001）等方面都具有重要的作用。近年的研究表明Hsp70還能促進抗原提呈，參與機體的免疫反應(yīng)。在胚胎發(fā)育初期，Hsp70對胚胎也有一定的保護作用。隨著分子生物學技術(shù)和生物信息學技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，Hsp70基因不斷從不同種類的生物中被克隆出來，從而為深入研究Hsp70基因的功能及其表達調(diào)控規(guī)律奠定了基礎(chǔ)。</p><p>　　通過對大量生物的熱休

5、克蛋白70氨基酸序列進行研究表明，熱休克蛋白70家族成員無論在一級結(jié)構(gòu)上，還是在高級結(jié)構(gòu)上都是高度保守的。</p><p>　　因此本課題擬通過曼氏無針烏賊Hsp70基因5’端的克隆研究，然后合并分析已知的核苷酸序列，進一步進行多序列比對和等電點進化分化。為曼氏無針烏賊Hsp70基因提供分子生物學方面的參考數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：<

6、/p><p><b>　　研究的基本內(nèi)容：</b></p><p>　　1. 以cDNA為模板，通過PCR擴增和瓊脂糖凝膠純化，連接轉(zhuǎn)化提取質(zhì)粒鑒定后送去生物公司測序。</p><p>　　2. 測序的序列與已知序列合并，對該核苷酸序列進行分析。</p><p>　　3. 對已知的核苷酸序列進行多序列比對和糖基化位點分析。&

7、lt;/p><p>　　4. 對已知的核苷酸序列進行進化分析，并構(gòu)建進化樹。</p><p><b>　　擬解決的問題：</b></p><p>　　克隆出曼氏無針烏賊Hsp705’端的基因，并對其進行分析，為曼氏無針烏賊Hsp70基因研究提供科學數(shù)據(jù)與理論依據(jù)。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p&

8、gt;<p><b>　?。ㄒ唬┭芯糠椒?lt;/b></p><p><b>　　1 RNA提取</b></p><p>　　Trizol法提取RNA：取肌肉組織，液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。采用Trizol一步法提取RNA，在紫外分光光度計上測定純度和濃度，并用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳/EB染色檢測所提RNA的質(zhì)量。

9、具體步驟如下：</p><p>　?。?）在1.5 ml RNase-free離心管中加入1 ml Trizol，同時將其中少許Trizol留在離心管蓋內(nèi)；取50 mg左右動物組織置于離心管蓋內(nèi)，用烘烤過的手術(shù)剪將組織徹底剪碎；</p><p>　?。?）冰上放置5 min，以使核蛋白質(zhì)裂解徹底；</p><p>　　（3）每1 ml Trizol加入0.2 ml氯

10、仿，劇烈振蕩混勻30 s，冰上放置3 min；</p><p>　?。?）臺式高速冷凍離心機上，12000 rpm 4 ℃離心15 min（離心后，混合物分為淡紅色的酚仿相、中間相和無色的上層水相，RNA就存在于水相中，水相大約占60%）；</p><p>　?。?）將上清液小心轉(zhuǎn)移到RNase-free 1.5 ml離心管里，加入0.5 ml的異丙醇，冰上放置10 min；&l

11、t;/p><p>　　（6）臺式高速冷凍離心機上，12000 rpm 4 ℃離心10 min（離心后，管底看見膠狀RNA沉淀）；</p><p>　?。?）棄上清，用1 ml 75% 酒精洗滌RNA沉淀，7500 rpm 4 ℃離心5 min；</p><p>　?。?）棄上清，室溫下放置5~10 min，使酒精揮發(fā)；</p><

12、p>　?。?）加20 µl DEPC-H2O溶解，-80 ℃保存。</p><p><b>　　2 cDNA合成</b></p><p>　　cDNA第一鏈的合成使用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，操作步驟如下：</p><p>　　（1）在Microtube中配制下列混合液：</p><p>　?。?）

13、將Microtube置于PCR儀或水浴鍋中，72 ℃變性2 min，迅速冰浴退火2 min；</p><p>　?。?）在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：</p><p>　　將上述Microtube管置于PCR儀或水浴鍋中，經(jīng)42 ℃10min，然后加入SMARTⅢ、SMARTⅢ2、SMARTⅢ3各1μl混合后取2μl，經(jīng)42℃90min及75℃10

14、min的反應(yīng)后將其置于-20 ℃保存。</p><p>　　3 聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)</p><p>　　根據(jù)已獲得的部分核心序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件，設(shè)計一對跨內(nèi)含子的曼氏無針烏賊Hsp70基因的特異性引物SMARTⅢ/A和Hsp5t（-）。</p><p>　　曼氏無針烏賊cDNA擴增采用TaKaRa公司的LA T

15、aqTM PCR system，25 μL反應(yīng)體系成分如下：</p><p>　　檢測采用TaKaRa公司的r TaqTM DNA聚合酶體系，反應(yīng)體系如下：</p><p>　　PCR流程如下：94 C變性2 min后，作30個循環(huán)的擴增，每一循環(huán)包括94C變性2min、94C變性30s，54℃退火30s和72C合成0.5~2min。循環(huán)結(jié)束后72℃延伸反應(yīng)10min以保證獲得全長產(chǎn)物。P

16、CR擴增產(chǎn)物經(jīng)1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離。</p><p>　　4 DNA克隆 </p><p>　　4.1 DNA片段切膠純化

17、 </p><p>　　將25μl PCR產(chǎn)物與10×Laoding Buffer混合，并在1%(w/v)瓊脂糖凝膠中電泳(120V)，EB染色后漂洗，紫外燈下觀察。切下預期大小的目的片段，用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit(OMEGA)純化，具體方法如下：</p><p>　　（1）將目的

18、膠條置Eppendorf管，加300μL Binding Buffer后置55~60℃水浴10 min，每2~3min顛倒混勻一次；</p><p>　?。?）將混合液混勻后轉(zhuǎn)入藍管，10000g離心1min；</p><p>　　（3）加300μL Binding Buffer，10000g離心1min；</p><p>　?。?）棄濾液，加700μl Wash

19、Buffer于藍管中，10000g離心1min；</p><p>　?。?）棄濾液，另加700μl Wash Buffer于藍管中，10000g離心1min；</p><p>　　（6）棄濾液，13000g離心2min以徹底去除藍管中的Wash Buffer殘留；</p><p>　?。?）加入30μl Elution Buffer于藍管，室溫靜置1min，1300

20、0g離心1min，收集產(chǎn)物-30℃保存。 </p><p><b>　　4.2 T-A連接</b></p><p>　　由于LA TaqTM DNA，r TaqTM DNA及聚合酶進行PCR時，會在產(chǎn)物DNA的3’末端形成一個游離的A，pMD19-T-Simple Vector載

21、體5’端具有與之配對的單個T，可與PCR產(chǎn)物直接連接。連接體系及反應(yīng)如下，連接產(chǎn)物可直接用于轉(zhuǎn)化。</p><p>　　4.3 感受態(tài)細胞制備(CaCl2法)</p><p>　　（1）接種-80℃長期保存的大腸桿菌菌株到5ml LB(每升含10g Tryptone，5g Yeast Extract，10g NaCl，pH 7.0)液體培養(yǎng)基中，37℃搖床，200rpm，培養(yǎng)過夜(12h左

22、右)；</p><p>　?。?）按1:100稀釋到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃搖床，200rpm，培養(yǎng)2 h；</p><p>　?。?）取出菌液置冰上冷卻10min，將冰冷的菌液1ml每管分裝到1.5mL的Eppendorf管，8000g離心1min，棄上清；</p><p>　?。?）沉淀用200μl預冷的0.1mol/L CaCl2懸浮，冰浴30min

23、后，8000g離心1min，棄上清；</p><p>　?。?）沉淀再用100μl 0.1mol/L CaCl2重懸浮，冰浴放置5~24h備用。</p><p><b>　　4.4 轉(zhuǎn)化和篩選</b></p><p>　?。?）將10μl連接產(chǎn)物加到100μl感受態(tài)細胞中，冰浴放置30min；</p><p>　?。?）

24、在42℃水浴熱激90s，立即轉(zhuǎn)移到冰上冷卻數(shù)分鐘；</p><p>　?。?）加入冰預冷的LB培養(yǎng)液890μL后，37℃搖床低速(170~180rpm)培養(yǎng)1 h；</p><p>　?。?）在預先涂布X-gal和IPTG的LB平板上(液體LB培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂粉)，取100μl轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)菌液，涂布于含氨卞青霉素(50~100μg/mL)，37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)(10~14 h)；&

25、lt;/p><p>　　（5）篩選白色菌落置5ml含氨卞青霉素(50~100mg/mL)LB培養(yǎng)液，37℃搖床，200rpm，培養(yǎng)8~12 h。</p><p><b>　　4.5 質(zhì)粒提取</b></p><p>　　根據(jù)不同目的，本文采用兩種方法提取質(zhì)粒，其中粗提采用堿裂法小量制備質(zhì)粒，用于檢測。采用E.Z.N.A.Plasmid Mini K

26、it I試劑盒(OMEGA)，用于雙酶切。</p><p>　　a. 裂解法(粗提質(zhì)粒)：</p><p>　　（1）取1ml菌液于1.5 ml的Eppendorf管中，離心8000 g，1min，棄去上清；</p><p>　　（2）加入溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl pH 8.0)100μl，劇烈震蕩

27、使細胞懸?。?lt;/p><p>　?。?）加新鮮配制溶液II(0.2mol/L NaOH，1%SDS)200μL，輕柔顛倒數(shù)次，待菌懸浮液澄清；</p><p>　?。?）加入150μL溶液III(3mol/L Kac，2mol/L HAc)，混勻后離心13000g，10 min；</p><p>　?。?） 將380μl上清轉(zhuǎn)移至新Eppendorf管中，加異丙醇7

28、20μl，顛倒數(shù)次后離心13000 g，10 min；</p><p>　　（6）棄上清，沉淀自然干燥后加50μl無菌水溶解(Sambrook et al，1989)。</p><p>　　b. E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I試劑盒(OMEGA)法：</p><p>　?。?）取30~50ml的菌液，于室溫下5000g，離心10 min，沉淀菌

29、種； </p><p>　?。?）倒出或吸掉培養(yǎng)基，往沉淀中加入2.5ml的SolutionⅠ/RNaseA混和液，漩渦振蕩使細胞完全重新懸??； </p><p>　?。?）轉(zhuǎn)移細胞懸溶液到30~50ml的離心管中，往重懸混和液中加入2.5ml SolutionⅡ，蓋上蓋子，輕輕的但要徹底混勻，顛倒10~15次以獲得澄清裂解物。如有必要，可把裂解液置于室溫靜置2min；</p>

30、<p>　?。?）往上述混和液中加入3.5ml SolutionⅢ，蓋好蓋子，并溫和地上下顛倒離心管數(shù)次，直至形成白色絮狀沉淀，于室溫(最好4℃)下12000g，離心10min；</p><p>　　（5）小心吸取3.7ml上清液到中量結(jié)合柱，結(jié)合柱套上15ml的收集管，確保轉(zhuǎn)至柱內(nèi)的上清中沒有細胞雜質(zhì)沉淀。于室溫下5000g離心3~5min，使裂解液完全流過柱子。棄去收集管中濾液并把柱子重新裝在1

31、5ml收集管中。重復這一步，直至將全部樣品通過柱子，棄去流出液（收集管重復使用）。 </p><p>　?。?）加入3ml Buffer HB到中量柱子中，室溫下5000g離心3~5min，棄去收集管中的濾液，在下一步中重復使用收集試管；</p><p>　　（7）加入3.5ml DNA Wash Buffer(用無水乙醇稀釋的)洗滌柱子，室溫下5000g離心3~5min，棄去洗滌液； &

32、lt;/p><p>　?。?）重復步驟8，再用3.5ml的DNA Wash Buffer洗滌柱子一次； </p><p>　?。?）室溫下5000g離心空柱10~15min以甩干柱子基質(zhì)。 </p><p>　?。?0）進一步干燥柱子，在65℃烘箱中處理10 min，移走柱子； </p><p>　?。?1）把柱子置于一干凈的15ml小離心管上，

33、直接加入0.5~1ml Elution Buffer到柱子基質(zhì)上，室溫下靜置2min，5000g離心5min，洗脫出DNA，純化的質(zhì)粒于-30℃保存。</p><p><b>　　5 檢測</b></p><p>　　5.1 重組質(zhì)粒的鑒定</p><p>　　將堿裂法抽提的質(zhì)粒與10×上樣緩沖液混勻后，1%瓊脂糖凝膠電泳，選擇大小合

34、適的重組質(zhì)粒進行PCR檢測，PCR檢測體系如前。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離。鑒定為目的重組質(zhì)粒后，將目的菌株的菌液加10%甘油混勻后置于-80℃保存。</p><p>　　5.2 序列測定和分析

35、 </p><p>　　取一部分菌液用封口膜封好后寄出測序，測序由上海華大公司測定, 采用ABI PRISMTM 3770 DNA自動測序儀雙向測序。序列分析采用BLASTP分析軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov /BLAST/)，多重序列比對采用DDBJ軟件ClustalW程序(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/)，系統(tǒng)進化分析由MEG

36、A 3.0版程序完成。 </p><p><b>　?。ǘ┘夹g(shù)路線：</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進度</p><p>　　2010.01-2010.02 畢業(yè)論文選題。</p><p>　　2010.02-2010.03 進行文獻查閱和資料收集，制定具體研究計劃和試驗方案。</

37、p><p>　　2010.03-2010.04 材料整理、分析，開始進行綜述撰寫。</p><p>　　2010.04-2010.05 開題答辯與綜述。</p><p>　　2010.04-2010.07 進行曼氏無針烏賊Hsp70基因5’端的克隆實驗。 </p><p>　　201

38、0.08-2010.11 數(shù)據(jù)和材料整理、分析。</p><p>　　2010.12-2011.02 完成2篇外文翻譯。</p><p>　　2011.02-2011.05 論文撰寫、提交并答辯。</p><p><b>　　五、主要參考文獻：</b></p><p>　　[1] 陳勁松, 夏雙印, 楊大平.

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64、p><p><b>　　水產(chǎn)養(yǎng)殖</b></p><p>　　HSP70的研究概論</p><p>　　摘要：熱休克蛋白（Hsp）是生物細胞在受熱、生物應(yīng)激、理化因素等應(yīng)激原刺激后所產(chǎn)生的一類在生物進化中最保守的蛋白。Hsp70具有多種生物學功能，包括分子伴侶功能，抗熱性功能，參與細胞免疫調(diào)節(jié)，抗細胞凋亡功能等等，隨著研究的深入，在生物學的功能不斷

65、被發(fā)現(xiàn)的同時，Hsp70的應(yīng)用前景也變得越來越廣泛。</p><p>　　關(guān)鍵詞：Hsp70；分子伴侶；抗熱性；免疫調(diào)節(jié)</p><p>　　應(yīng)激蛋白也被稱為熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp），是生物細胞在應(yīng)激原刺激后，發(fā)生熱休克反應(yīng)時所產(chǎn)生的在生物進化中最保守并由熱休克基因所編碼的伴隨細胞的一類蛋白。Hsps又稱為“看家蛋白”（Getting M J et al,

66、 1992），因為它是一種保護機體的蛋白，還發(fā)現(xiàn)Hsps可使細胞非特異性抗損傷能力增加。Conroy等人（1996）根據(jù)其分子量大小分為：Hsp27、Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp110家族。熱休克家族（Hsps）是到現(xiàn)在為止發(fā)現(xiàn)最為保守的家族（Hugh R B Pelham et al, 1982）。Hsps中最保守和最重要的一族是Hsp70，生物中含量也是最多的，在應(yīng)激反應(yīng)中最為敏感以及在臨床實踐中的各種作用，因此成為現(xiàn)

67、在研究領(lǐng)域中最受關(guān)注、研究最深入的一種。</p><p>　　1Hsp70的發(fā)現(xiàn)歷史</p><p>　　早在50多年以前，病理生理學家Selye就提出了全身適應(yīng)性和應(yīng)激學說，適應(yīng)綜合癥（adaptation syndrome）就是當機體在緊急情況下，為了適應(yīng)突然的刺激而產(chǎn)生的一系列的非特異性的改變。</p><p>　　19世紀70年代，研究發(fā)現(xiàn)將培養(yǎng)溫度提高至3

68、0℃時，果蠅幼蟲的唾液腺染色體上某一部位會出現(xiàn)“蓬松”現(xiàn)象，而溫度恢復到正常時，其他部位才會出現(xiàn)類似的蓬松，說明熱休克蛋白是熱誘導基因蓬松的活化產(chǎn)物（Ritossa et al, 1962）。</p><p>　　19世紀80年代，發(fā)現(xiàn)熱休克反應(yīng)中轉(zhuǎn)錄合成的一組特殊蛋白，而伴隨著這類蛋白的合成，細胞的其他蛋白合成受到抑制，因為這類蛋白的合成與熱休克反應(yīng)有關(guān)，故稱為熱休克蛋白（Tissieres et al, 19

69、74）。</p><p>　　Hsp70家族是最重要和最保守的家族，大多數(shù)生物中Hsp70的含量是最多的，在細胞應(yīng)激反應(yīng)后合成的也是最多的，家族成員共有20多種蛋白質(zhì)。其中Hsp70是最為重要的一種蛋白質(zhì)，其相關(guān)研究也最多、最深入。根據(jù)其功能和分布分型包括應(yīng)激誘導型、結(jié)構(gòu)型、線粒體型以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型等（Shin B K et al, 2003）。</p><p>　　2Hsp70的生物學特性&

70、lt;/p><p>　　2.1 Hsp的概念</p><p>　　熱休克蛋白也稱應(yīng)激蛋白，是生物細胞在熱刺激、缺血、缺氧、過氧化、低血糖、紫外線、外傷、病原微生物的感染、乙醇、亞砷酸鈉、砒霜和重金屬（Todryk S M et al, 2003; Gross C et al, 2003）等應(yīng)激源刺激下，發(fā)生熱休克反應(yīng)所產(chǎn)生的、由熱休克基因編碼、在進化上高度保守的伴隨細胞蛋白。生物體在各種應(yīng)激狀

71、態(tài)下所表現(xiàn)出來的以基因表達變化為特征的防御性適應(yīng)反應(yīng)稱為熱休克反應(yīng)。</p><p>　　2.2 Hsp70的功能域</p><p>　　以氨基酸的一級結(jié)構(gòu)為依據(jù)，可將Hsp70分為三個功能域：近N端為45kD大小在結(jié)構(gòu)上高度保守的氨基酸序列，有ATPase活性區(qū)，緊接著為分子量18kD大小相對保守的氨基酸序列，是多肽的結(jié)合部位；近C端有約為10kD結(jié)構(gòu)多變的氨基酸序列，其功能尚不明確，可

72、能與某種特定的蛋白底物相互作用有關(guān)（陳勁松, 2001）。熱應(yīng)答元件是指Hsp70基因5’上游中多個nGAAn同時存在時，高水平活化轉(zhuǎn)錄，熱應(yīng)激應(yīng)答中必不可少的功能區(qū)，具有增強子的一些特性。當把這類HSE接在其它基因5’上游時，該基因同樣可以獲得熱應(yīng)激蛋白的誘導性（Hugh R B Pelham et al, 1982; Roy H et al, 1986）。</p><p>　　2.3 Hsp70的同源性<

73、;/p><p>　　Hsp70基因沒有內(nèi)含子，這使得開始啟動轉(zhuǎn)錄就可產(chǎn)生成熟的mRNA以適應(yīng)Hsp70大量快速表達的需要，阻止應(yīng)激源對其mRNA前體的影響。進化過程中Hsp70基因具有高度相似性，大鼠的Hsp70氨基酸序列與人類的相似性約為95%，與小鼠的相似性約為98%；人類Hsp70氨基酸序列與果蠅的相似性為73%，與大腸桿菌誘導型Hsp70的相似性為47%，果蠅的Hsp70基因與大腸桿菌的Dnak基因的核苷酸序

74、列相似性在50%以上（S Lindguist et al, 1988）。</p><p>　　2.4 Hsp70的生化特性</p><p>　　Hsp70都有較弱的ATPase活性和較高的ATP親和性，結(jié)合ATP后促使靶蛋白與之解離，ATP-Hsp70對靶蛋白具有很高的親和力，形成穩(wěn)定的Hsp70蛋白復合體；選擇性結(jié)合各種特殊蛋白或多肽參與蛋白穩(wěn)定構(gòu)象的形成、跨膜運輸或降解；其它Hsp或細

75、胞因子的輔助才能形成Hsp70復合體；Hsp70家族可以保護各種酶免受熱損傷，使聚合的蛋白質(zhì)解聚（Burdon R H, 1993）。</p><p>　　3Hsp70的生物學功能</p><p>　　Hsp70具有多種生物學功能，包括分子伴侶功能，參與免疫反應(yīng)，抗細胞凋亡功能，抗熱性功能，促進細胞增殖等等，廣泛的生物學功能使其成為當今生命科學研究領(lǐng)域中的熱點（Juliann G K et

76、 al, 1998）。</p><p>　　3.1 Hsp70的分子伴侶功能</p><p>　　分子伴侶是能夠穩(wěn)定和結(jié)合其它蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，通過控制有效的結(jié)合和釋放，促進新生多肽鏈折疊、多聚體的裝配或降解及細胞器蛋白的跨膜運輸?shù)鹊囊活惖鞍踪|(zhì)（Hendrick J P et al, 1993）。蛋白質(zhì)家族中分子伴侶是在進化上是非常保守，存在于各種生物體內(nèi)，分子伴侶能夠防止未折疊的蛋白質(zhì)

77、變性和促進聚集的蛋白質(zhì)溶解復性，所以在細胞受到不利環(huán)境脅迫時特別重要，因而許多分子伴侶在生物體內(nèi)首次以Hsp形式被鑒定出來（Georgopoulos C et al, 1993; Boston R S et al, 1996）。</p><p>　　Hsp70的ATP酶結(jié)構(gòu)域或與肽鏈結(jié)合過程中起重要作用的C2末端的EEVD序列決定其分子伴侶作用。Hsp家族可以幫助其他蛋白在細胞內(nèi)折疊、成熟，值得關(guān)注的是不是所用的

78、Hsps都是分子伴侶，分子伴侶也并不全是Hsps（Maciej Z et al, 2001）。Hsp的分子伴侶功能是十分復雜的。</p><p>　　3.2 Hsp70的抗熱性功能</p><p>　　細胞或生物體在預先受到亞致死溫度時，對后來的熱脅迫產(chǎn)生抗性的能力稱之為生物的耐熱性。</p><p>　　生存能力隨著熱耐力提高而提高，Hsp介導應(yīng)激耐受力的產(chǎn)生，且

79、耐受力的高低與Hsp的表達水平呈正相關(guān)關(guān)系（Marber M S et al, 1994）。但不同條件下的Hsp70對機體的保護作用是不一樣的（Rakonczay Z J et al, 2002）研究表明，雖然熱休克處理和亞砷酸鹽誘導都產(chǎn)生了大量的Hsp70，但是熱休克處理誘導的Hsp70具有保護作用，而亞砷酸鹽誘導的沒有，說明熱休克處理后Hsp70對機體的應(yīng)激能力增加不只是Hsp70的作用。</p><p>　

80、　熱耐力提高后，可以提高機體在致死高溫下的生存能力（Lindquist S, 1986）。實驗表明（Wang T T et al, 1998），預先處理的生物體細胞，當再次置于更高的甚至是致死溫度的環(huán)境下時，生物體細胞的生存能力得到明顯提高。細胞如果一直暴露于高溫環(huán)境中，將使細胞分化功能喪失；而這些細胞間歇性的暴露于熱環(huán)境中時，將會產(chǎn)生耐熱性（Cao Y et al, 1998）。</p><p>　　生物對熱環(huán)

81、境的抵抗能力可以通過溫度馴化得到。如蠑螈經(jīng)過一段時間的溫度馴化，能明顯提高抗熱性?，F(xiàn)在有許多研究結(jié)果表明細胞的Hsp可以通過熱馴化誘導，以減輕高溫對細胞的損害。Hsp有提高微生物耐熱能力的作用已得到很多學者的證實。</p><p>　　3.3 Hsp的免疫調(diào)節(jié)功能</p><p>　　現(xiàn)在，Hsp在機體免疫調(diào)節(jié)中的作用越來越重要。Hsp70在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著許多令人矚目的功效。病原體侵入

82、宿主后會合成Hsp，而宿主細胞通過改變基因表達方式，誘導其Hsp的產(chǎn)生。這時宿主其他基因表達受抑制，相應(yīng)蛋白質(zhì)合成減少。病原體和宿主細胞產(chǎn)生的Hsp大多有抗原決定簇，可使宿主細胞發(fā)生體液和細胞免疫反應(yīng)。</p><p>　　長久以來，癌癥一直是醫(yī)學界乃至與生物界無法攻克的難題，但Hsps具有激活抗原的作用，如果用病人自己腫瘤的多肽加工制備成Hsps-肽復合物疫苗，再注射回病人就能產(chǎn)生免疫反應(yīng)。</p>

83、<p>　　研究發(fā)現(xiàn)由于HspBP1在腫瘤中的高表達使其可能成為一個新的癌癥標志（Deborah et al, 2003）。Udono等的研究表明，從腫瘤組織中獲得的Hsp70和小分子肽復合物具有腫瘤特異性免疫原性，產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)。一旦分離，單獨的Hsp70無此作用，而小分子肽大部降解，含量甚微。因此，利用Hsp70結(jié)合肽鏈這一特性獲得特異性免疫原性和免疫抗性，可能為腫瘤的治療提供一條新的途徑。</p>

84、;<p>　　3.4 Hsp的抗細胞凋亡功能</p><p>　　細胞的程序性死亡即凋亡指各種各樣有害的應(yīng)激因素如熱暴露、缺血、缺氧氧化應(yīng)激等可以引起細胞損傷。細胞收縮、膜排空、核破裂和DNA破碎是凋亡的主要特征。在應(yīng)激情況下Hsp70基因表達增加，可抑制應(yīng)激激酶激活及凋亡激活基因的表達，防止細胞凋亡。</p><p>　　當細胞與氨基酸類似物一起孵育時，細胞內(nèi)出現(xiàn)異常蛋白積

85、聚，導致P38、JNK等應(yīng)激激酶的激活，此現(xiàn)象可能被Hsp72的過量表達所阻斷。因此，在應(yīng)激狀態(tài)下，細胞內(nèi)Hsp70家族基因表達水平的增加，可抑制應(yīng)激激酶激活，防止細胞凋亡（鄭磊等, 1999）。這種現(xiàn)象的機理到現(xiàn)在為止還不清楚，但在小鼠的胚胎F9細胞里，同種蛋白的過度表達加強過氧化介導的凋亡（Yamagishi N et al, 2002）。</p><p>　　研究表明，細胞內(nèi)Hsp72水平的增加會阻斷信號通

86、路，抑制JNK激活，從而減少細胞的凋亡（Gabai V L et al, 1997）。還發(fā)現(xiàn)，在溫度為42℃情況下對克隆的小鼠BC-8細胞進行30min的熱應(yīng)激后，BC-8細胞不能產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，不產(chǎn)生Hsp70，卻可在細胞內(nèi)觀察到細胞凋亡小體和DNA碎片（Sreedhar A S et al, 1999）。</p><p><b>　　3.3展望</b></p><p&g

87、t;　　現(xiàn)在，盡管Hsp70的分子生物學研究仍然處在初級階段，但大量的研究數(shù)據(jù)正在被收集，正在逐步嘗試功能基因的研究。不同的受試物種和研究組織，不同的應(yīng)激源，Hsp70的合成規(guī)律明顯有不同程度差異。而對Hsp70在應(yīng)激反應(yīng)過程中的合成原理仍然不清楚，這主要是因為，對Hsp70合成機制研究數(shù)量到目前為止還很少，另外，在有限的實驗研究中，受試物種的不一樣，實驗方案的設(shè)計以及Hsp70的檢測方法不同，造成數(shù)據(jù)之間缺乏可比性。所以，還需要得到更

88、多Hsp70基因信息，來更深層次的研究表明Hsp70誘導因素、生物適應(yīng)原理及合成表達的調(diào)控機制。</p><p>　　另外，雖然現(xiàn)在有多種腫瘤免疫治療方法應(yīng)用于臨床，但有些因為抗原呈遞效果差，有些因為毒副作用大，效果不是很理想。Hsp具有抗原的載體和佐劑的雙重作用，可大大提高腫瘤抗原多肽的呈遞效率，并且廣泛參與腫瘤免疫。隨著Hsp的免疫學和生物學機制研究的不斷加深，其在腫瘤治療方面的作用被越來越多的人所關(guān)注，應(yīng)用

89、前景無疑是非常誘人的。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 陳勁松, 夏雙印, 楊大平. Hsp70在鼠背軸型皮管IPC后的保護作用的實驗研究[J]. 中國急救醫(yī)學, 2001, 21(3): 139-141</p><p>　　[2] 鄭磊, 顏曉慧, 鄒飛, 等. 熱應(yīng)激時熱休克蛋白70及其細胞保護作用

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