香魚熱休克蛋白hsp70基因的克隆及生物信息學分析【畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　香魚熱休克蛋白HSP70基因的克隆及生物信息學分析 </p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 生物技術(shù) </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄

3、</b></p><p><b>　　摘要</b></p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p><b>　　1 引 言2</b></p><p><b>　　2 材料與方法2</b></p><

4、p>　　2.1 實驗材料2</p><p>　　2.1.1 香魚2</p><p>　　2.1.2 菌株和質(zhì)粒2</p><p>　　2.1.3 試劑和酶2</p><p>　　2.1.4 儀器與設(shè)備2</p><p>　　2.2 實驗方法2</p><p>　　2.2.1 香

5、魚肝臟總RNA的提取2</p><p>　　2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA3</p><p>　　2.2.3 PCR擴增HSP70基因核心序列3</p><p>　　2.2.4 PCR擴增產(chǎn)物的鑒定4</p><p>　　2.2.5 測序6</p><p>　　2.2.6 香魚HSP70基因的生物信息學分析

6、6</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析7</b></p><p>　　3.1 香魚HSP70基因cDNA片段的克隆7</p><p>　　3.2 香魚HSP70基因核苷酸序列比對10</p><p>　　3.3香魚HSP70基因編碼的氨基酸序列多重比對10</p><p>　　3.

7、4 香魚HSP70蛋白的特征分析15</p><p>　　3.5香魚HSP70蛋白二級結(jié)構(gòu)分析16</p><p>　　3.6 香魚HSP70蛋白三維結(jié)構(gòu)分析17</p><p>　　3.7 PaHSP70基因系統(tǒng)進化樹分析18</p><p><b>　　4 結(jié)論19</b></p><p

8、><b>　　致 謝19</b></p><p><b>　　參考文獻20</b></p><p>　　摘 要：熱休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）是一組在結(jié)構(gòu)上高度保守的多肽，廣泛存在于自然界原核、真核細胞中，參與細胞的損傷與修復。本實驗以香魚肝組織為實驗材料，提取香魚肝組織的總RNA，根據(jù) Gen

9、bank上HSP70同源基因序列，設(shè)計并合成引物，使用PCR擴增的方法，克隆得到了香魚的HSP70基因的核心片段序列，命名為paHSP70。該基因大小為1961bp，包括完整ORF框，編碼651個氨基酸和一個終止子。預(yù)測paHSP70蛋白的分子量大小為71.22kDa，等電點pI = 5.16。通過比對與生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，paHSP70蛋白與其他魚類HSP70蛋白同源性很高，因此認為該基因?qū)儆贖SP70基因家族。構(gòu)建paHSP70基因

10、系統(tǒng)進化樹，體現(xiàn)了鮭科種間的親緣關(guān)系與進化差異。</p><p>　　關(guān)鍵詞： HSP70；香魚；生物信息學分析</p><p>　　Abstract：Heat Shock Protein 70 is a group of peptides which highly conserved in the structure, widely found in prokaryotic and eu

11、karyotic cells. HSP70 also plays an important role in cell injury and repair. In this research, Plecoglossus altivelis was taken as the experiment material, and isolated the total RNA from liver. Pairs of primers were de

12、signed and synthesized according to the homologous genes of HSP70 in the Genbank. The ORF sequence of HSP70 gene from Plecoglossus altivelis was got by</p><p>　　Keywords: HSP70; Solanum tuberosum; Bioinforma

13、tical analysis</p><p><b>　　1 引 言</b></p><p>　　香魚（Plecoglossus altivelis）屬于香魚科(Plecoglossidae），有些學者并入鮭科(Salmonidae)，為味香美的河魚。其常見于日本及臺灣，上溯于清澈的河水中產(chǎn)卵。體淡黃或橄欖色，長約30公分(1尺)，外貌頗似小鱒[1]。因為香魚其肉醇厚

14、，肉質(zhì)細嫩味美并有殊香，猶如從香水中撈出來一般，并無其他魚腥味，所以評價很高，有“淡水魚之王”的美譽[2]。近二十年來，由于受外界環(huán)境的影響，野生資源量急劇減少，作為具有高經(jīng)濟價值的新興養(yǎng)殖品種，日益受到人們的關(guān)注。</p><p>　　熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）是一組在結(jié)構(gòu)上高度保守的多肽，廣泛存在于原核和真核細胞中，正常情況與應(yīng)激條件下都發(fā)揮重要的生理功能[3-6

15、]，但脅迫因子（包括熱激、物理、化學和生物等）能破壞蛋白的高級結(jié)構(gòu)、擾亂正常細胞狀態(tài)和損害機體[7-8]，都能誘導HSP70表達量顯著增加 [9-10]。HSP70作為一種分子伴侶，參與維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，保護細胞生命活動，折疊和跨膜運輸新生的蛋白[11-13]，修復錯誤折疊的蛋白，幫助降解變性的蛋白，穩(wěn)定細胞骨架和核骨架的等基本功能一旦細胞面臨脅迫狀態(tài)時[14]，生物體就會大量表達HSP70以阻止細胞內(nèi)變性蛋白質(zhì)的累積，修復變性蛋白質(zhì)

16、[15]，運送未成熟的蛋白質(zhì)至目標細胞器以完成最后的包裝、代謝或修復，增加細胞的抗逆能力以保護機體度過不良狀態(tài)由于熱休克蛋白重要的生物學功能，現(xiàn)已成為生命科學熱點研究領(lǐng)域之一[15-20]。近年來有研究將HSP70作為指示魚類健康的生物指標。不同魚類中HSP70基因的序列有所不同，到目前為止，香魚中完整的HSP70基因還沒有被報道。本文以香魚肝臟為材料，克隆其HSP70基因核心片</p><p><b>

17、;　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 實驗材料</b></p><p><b>　　2.1.1 香魚</b></p><p>　　香魚，購自寧波市寧海鳧溪漁場，其肝臟為本實驗材料。</p><p>　　2.1.2 菌株和質(zhì)粒</p><p&

18、gt;　　大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，pMD18T載體</p><p>　　2.1.3 試劑和酶</p><p>　　BIOZOL試劑盒，pMD18T-Vector試劑盒，AMV反轉(zhuǎn)錄酶，購于TaKaRa公司；DNA快速純化/回收試劑盒，購于北京鼎國生物公司；DNA連接試劑盒，購于Promega公司；RNA酶抑制劑，異丙醇，QQ水等。</p><p>　　2.1.4

19、 儀器與設(shè)備</p><p>　　離心機、高壓滅菌鍋、電泳儀、恒溫水浴鍋、PCR儀、紫外透射儀等。</p><p><b>　　2.2 實驗方法</b></p><p>　　2.2.1 香魚肝臟總RNA的提取</p><p>　　本實驗使用BIOZOL總RNA提取試劑盒（BioFlux，日本）提取香魚肝臟總RNA。<

20、;/p><p>　?、?在液氮條件下將100 mg香魚肝臟研磨成粉末，然后與1 ml BIOZOL混合。勻漿時組織樣品體積一般不要超過BIOZOL體積的10%。</p><p>　?、?分離：將勻漿樣品在室溫下孵育15 min，使樣品充分裂解至勻漿液，較透明且無顆粒。按照5：1（BIOZOL︰氯仿）的比例（v/v）加入氯仿。蓋緊管蓋，振蕩混勻并將其在冰上孵育15 min，于4 ℃，12,000

21、×g 離心15 min。離心后混合物分層：上清層，中間層，下層；RNA存在于上清層中。</p><p>　?、?RNA的沉淀：將上清層轉(zhuǎn)移到一干凈的離心管中，加入等體積冰浴的異丙醇，顛倒振蕩混勻，將混合的樣品在-20 ℃條件下孵育20 min以上，4 ℃，12,000×g 離心10 min。RNA沉淀通常形成片狀沉淀附著于管壁或管底。</p><p>　?、?RNA的洗

22、滌：棄去上清，用冰浴的75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次，按每1 ml的BIOZOL 至少加1 ml的75%乙醇的比例加入75%乙醇。顛倒洗滌離心管管壁，并旋渦振蕩樣品，盡可能讓沉淀懸浮，4 ℃，12,000×g 離心5 min，再次去除上清，晾干沉淀。</p><p>　?、?RNA的溶解：在操作的最后，適度干燥RNA 沉淀（避免過分干燥,那樣會降低它的可溶性）。用適量的無RNA酶水或TE溶液來溶解RNA

23、（一般可用50-100 μl無RNA酶的水或TE溶液溶解RNA）。抽提好的RNA，保存于-70 ℃。</p><p>　　2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA</p><p>　　使用AMV反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa，日本）進行cDNA第一鏈的合成，將反應(yīng)混和液在室溫下放至10 min后，42 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：</p><p>　　2.2.3 PCR擴增H

24、SP70基因核心序列</p><p>　　根據(jù)Genbank上已登陸虹鱒、大西洋鮭等鮭科魚類HSP70基因的保守片斷，設(shè)計并合成一對引物：</p><p>　　正義引物（FHSP70）：5'-ATGTCTA(A/C)GGGACCAGCAGTGG-3'</p><p>　　反義引物 (RHSP70)：5'-TTAGTCAACC(T/A)CCTC

25、AATGGT-3'</p><p>　　以香魚反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。PCR擴增反應(yīng)體系如下：</p><p><b>　　反應(yīng)程序設(shè)置如下：</b></p><p>　　2.2.4 PCR擴增產(chǎn)物的鑒定</p><p>　　2.2.4.1 目的片段回收<

26、/p><p>　　將含有目的片段的瓊脂糖凝膠切下，使用小量膠回收試劑盒（Elutefast，中國）進行回收。</p><p>　?、?切下目的膠塊，放入1.5 ml Eppendorf管中。</p><p>　?、?加入E1液450 μl，55-60 ℃水浴5-10 min至膠塊完全溶解。</p><p>　?、?加入E2液10 μl，混勻立即吸

27、入內(nèi)套管中，8000 rpm離心2 min。</p><p>　　⑷ 棄去外套管中液體，在內(nèi)套管中加入500 μl洗液（Wash Buffer），8000 rpm離心1 min，重復一次。</p><p>　　⑸ 棄去外套管中的液體，直接套回，8000 rpm離心1 min。</p><p>　?、?取出內(nèi)套管放入新的Eppendorf管中，在內(nèi)套管膜中央加入20-

28、50 μl洗脫液（Elute Buffer）。</p><p>　?、?60 ℃水浴5 min。</p><p>　?、?12000 rpm離心1 min，得到回收產(chǎn)物，-20℃貯存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　2.2.4.2 連接</p><p>　　使用pMD18T-Vector（TaKaRa，日本）進行連接反應(yīng)，16 ℃連接過夜。反應(yīng)體系

29、如下：</p><p>　　2.2.4.3 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞的制備</p><p>　?、?取-70 ℃甘油保存的DH5α菌種20 μl，接種于20 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃下220-250 rpm振蕩過夜。</p><p>　　⑵ 取上述菌液20 μl，接種于20 ml LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下220-250 rpm振蕩2.5-4 h，至OD8

30、00=0.5-0.6。</p><p>　?、?取上述菌液1 ml于無菌Eppendorf管中，蓋上蓋，4 ℃下5000 rpm離心5 min。</p><p>　　⑷ 去上清，吸干管底殘留的LB培養(yǎng)基，用4 ℃冰浴預(yù)冷的CaCl2（0.1 M）溶液400 μl重懸菌體， 用移液槍混勻。</p><p>　?、?置于4 ℃培養(yǎng)箱，冰浴30 min。</p>

31、;<p>　　⑹ 4 ℃下4000 rpm離心10 min，徹底去上清，用200 μl CaCl2（0.1 M，預(yù)冷）重懸菌體，用移液槍輕輕混勻。</p><p>　　⑺ 置于冰浴2-7 h可用于轉(zhuǎn)化。</p><p>　　2.2.4.4 轉(zhuǎn)化</p><p>　　使用自制的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化。</p><p>

32、　?、?無菌條件下，取10 μl連接產(chǎn)物，加入200 μl大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，用槍頭輕輕混勻（冰上操作）。</p><p>　?、?4 ℃冰浴30 min。</p><p>　　⑶ 42 ℃精確熱激90 s。</p><p>　　⑷ 立即轉(zhuǎn)入冰水中冰浴1-2 min后，恢復到室溫。</p><p>　?、?加入800 μl無抗生素L

33、B培養(yǎng)基，混勻。</p><p>　　⑹ 將Eppendorf管置于三角瓶中，37 ℃恒溫搖床180 rpm振蕩培養(yǎng)2 h。</p><p>　?、?室溫下5000 rpm離心4 min，吸去上清900 μl，余下100 μl液體重懸菌體。</p><p>　　⑻ 將菌液加入37 ℃預(yù)熱的LB固體培養(yǎng)基（100 μg / ml CAB），涂布至干。</p>

34、;<p>　?、?將培養(yǎng)基倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12-24 h。</p><p>　　2.2.4.5 重組子的篩選與鑒定</p><p>　　⑴ 無菌條件下，隨機挑取4個單菌落分別接種于4個裝有1 ml LB液體培養(yǎng)基（100 μg / ml CAB）的Eppendorf管中。</p><p>　?、?置于37 ℃恒溫搖床，250 rpm振蕩

35、培養(yǎng)4 h，至對數(shù)生長期。</p><p>　?、?進行菌液PCR鑒定，擴增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。建立PCR反應(yīng)體系如下：</p><p><b>　　反應(yīng)程序如下：</b></p><p><b>　　2.2.5 測序</b></p><p>　　實驗中的測序工作委托上海英俊生物工程有限

36、公司（中國）完成。</p><p>　　2.2.6 香魚HSP70基因的生物信息學分析</p><p>　　本文中的序列比對均使用Vector NTI Suite 7.0軟件和BLAST工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）進行分析，ORF的查找和核苷酸的翻譯在http://www.ncbi.nlm.nih.gov 網(wǎng)站的ORF Finder上完成。對香魚HSP70

37、基因編碼的氨基酸序列與其它魚類HSP70基因編碼的氨基酸序列進行多重比對（表1）。蛋白質(zhì)基本性質(zhì)的分析以及蛋白質(zhì)三維模型的同源建模均使用http://www.expasy.org 網(wǎng)站提供的相關(guān)生物信息學分析軟件和WLViewLite40軟件進行。使用ClustalX軟件對序列進行多重比對以后，再使用MEGA4軟件中的鄰位相連法完成系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建。系統(tǒng)進化樹以香魚以及其他魚類的HSP70氨基酸序列（表2）作為分析對象。</p&g

38、t;<p>　　表1. 分析PaHSP70蛋白用到的其他魚類HSP70蛋白信息</p><p>　　Tab.1 Analysis PaHSP70 proteins with HSP70proteins information from other fish species</p><p>　　表2. PaHSP70系統(tǒng)進化樹分析所用氨基酸序列</p><p

39、>　　Tab.2Amino acid sequences used in Phylogenetic tree of PaHSP70</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 香魚HSP70基因cDNA片段的克隆</p><p>　　根據(jù)Genbank上已登陸虹鱒、大西洋鮭等鮭科魚類HSP70基因的保守

40、片段設(shè)計引物。用該引物，以從香魚肝臟中提取得總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA單鏈為模板，進行PCR擴增，得到了大小約為1800-2000 bp的片段（圖1），與預(yù)期DNA片段長度一致，將其命名為paHSP70。</p><p>　　DL2000 Maker PCR產(chǎn)物</p><p>　　圖1. 香魚HSP70基因核心片段擴增電泳圖譜</p><p>　　Fig.1

41、Amplification profiles of HSP70 core fragment from </p><p>　　Plecoglossus altivelis</p><p>　　Left: DL2000 Maker Right: PCR product </p><p>　　從擴增產(chǎn)物DH5α感受態(tài)細胞中，隨機挑取轉(zhuǎn)化子，進行PCR鑒定。電泳檢測得

42、到了與擴增PCR大小一致的條帶。初步表明擴增的PCR產(chǎn)物已轉(zhuǎn)入大腸桿菌中。將陽性克隆送公司測序。測序結(jié)果表明：PCR擴增產(chǎn)物大小為1956 bp，包括完整ORF框，編碼651個氨基酸和一個終止子（圖2）。起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。</p><p>　　圖2. paHSP70基因核心片段序列及編碼的氨基酸序列</p><p>　　起始密碼子與終止密碼子用方框標出，下劃線部分為引

43、物序列</p><p>　　Fig.2 Nucleotide sepuence and the deduced amino acid sequence of paHSP70.</p><p>　　The start code and the stop code were boxed. Primer sequence was underlined.</p><p>　

44、　3.2 香魚HSP70基因核苷酸序列比對</p><p>　　登陸http://www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站，進行核苷酸序列比對（Nucleotide BLAST），結(jié)果顯示：香魚HSP70基因與大西洋鮭HSP70基因（序列號：BT058774.1）同源性高達87 %，與虹鱒（Oncorhynchus mykiss，序列號：NM 001124232.1）相似度87 %，與紅笛鯛（Lutjanus

45、 sanguineus，序列號為：HM159272.1）相似度86 %，與五條鰤（Seriola quinqueradiata，序列號為：AB436468.1）相似度86 %，與牙鲆（Paralichthys olivaceus，序列號為：AF053059.1）相似度86%，與大菱鲆（Psetta maxima，序列號為：EF191027.1）相似度86 %。這表明實驗獲得的核苷酸片段正是香魚的HSP70基因，并且說明HSP70基因在不

46、同魚類之間序列差異不大，比較保守。</p><p>　　3.3香魚HSP70基因編碼的氨基酸序列多重比對</p><p>　　使用Vector NTI Suite 7.0軟件，對香魚HSP70基因編碼的氨基酸序列與其它魚類HSP70基因編碼的氨基酸序列進行多重比對（圖3，表1）。結(jié)果顯示，香魚HSP70基因編碼的氨基酸序列具有典型的HSP70家族簽名基序：IDLGTTYS序列、IFDLGG

47、GTFDVSIL特征基序、IVLVGGSTRIPKIQK特征基序。250a至262a處為定位序列KKDISDNKRAVRR。在C-端具有兩個重復GGMP, 以及細胞質(zhì)特異性調(diào)控序列EEVD，并在N-端有高度保守的約為44KDa的三磷酸腺苷酶（ATPase）功能域，基本可以確定其屬于HSP70家族。</p><p>　　圖3. PaHSP70蛋白的氨基酸序列與其它魚類HSP70蛋白序列多重比較。完全相同的氨基酸位點

48、用白色的字體和黑色的背景表示。保守的氨基酸位點用白色的字體和深灰色的背景表示，相似氨基酸的位點用白色的字體和灰色的背景表示，弱相似的氨基酸用黑色的字體和淺灰色的背景表示。非相似的氨基酸用黑色字體和白色的背景表示。方框Ⅰ，方框Ⅱ和Ⅳ表示HSP70的簽名序列：IDLGTTYS特征基序、IFDLGGGTFDVSIL特征基序、IVLVGGSTRIPKIQK特征基序。方框Ⅲ表示HSP70的定位序列：KKDISDNKRAVRR。方框Ⅴ表示GGMP4

49、肽特征基序。方框Ⅵ表示細胞質(zhì)特異性調(diào)控序列EEVD。</p><p>　　Fig.3 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of PaHSP70 with HSP70 proteins from other fish species. </p><p>　　3.4 香魚HSP70蛋白的特征分析</p>&

50、lt;p>　　應(yīng)用Computer pI/Mw Tool 軟件（http://www.expasy.org）預(yù)測香魚HSP70蛋白的分子量大小為71.22kDa，等電點pI = 5.16。使用BLAST軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）以及Vector NT I Suite 7.0 軟件的分析表明，，PaHSP70與其它魚類的HSP70有很高的相似性（>94 %）（表3）。PaHSP70與大西洋鮭

51、（Salmo salar）、紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、團頭魴（Megalobrama amblycephala）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、草魚(Ctenopharyngodon idella)、斑馬魚（Danio rerio）HSP70蛋白的相似性均在94%以上，從而推測PaHSP70屬于HSP70家族。</p>

52、;<p>　　表3. PaHSP70蛋白與其他魚類HSP70蛋白同源性比較</p><p>　　Tab.3 Homology comparison of PaHSP70 protein with HSP70 proteins from other fish species</p><p>　　3.5香魚HSP70蛋白二級結(jié)構(gòu)分析</p><p>　　用

53、http://www.expasy.org網(wǎng)站的Secondary structure tools進行PaHSP70蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖4）。PaHSP70二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，有275個氨基酸參與形成α-螺旋（alpha helix），占所有氨基酸的41.63%，有180個氨基酸參與形成伸展鏈（extended strand），占總氨基酸的27.65%，有89個的氨基酸參與形成β轉(zhuǎn)角（beta turn），占總氨基酸的13.67%，另有2

54、15個氨基酸參與形成無規(guī)卷曲（random coil），占總氨基酸的33.03%。</p><p>　　10 20 30 40 50 60 70</p><p>　　| | | | | | |</p>

55、<p>　　MSKGPAVGIDLGttYScVGVFQhGKVeIIANDQGNRttPSYVAFtDSeRLIGDAAKNQLAMNPtNtVFDA</p><p>　　cccceeeeeecccccheeeeecttceeeeeccccccccceeeeecttceeehhhhhhhhcccttcheehh</p><p>　　KSLIGRRFDDGVVQSDMKhWP

56、FeVINDNtRPKVQVeYKGetKSFYPeeISSMVLVKMKeIAeAYLGKtVN</p><p>　　hhhhtcccccchhhhhhtccceeeeccccceeeeeccccccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh</p><p>　　NAVVtVPAYFNDSQRQAtKDAGtISGLNVLRIINePtAAAIAYGLDKKVGAeRNV

57、LIFDLGGGtFDVSIL</p><p>　　heeeecccccctthhhhhhhhhhhhhheeeeeecccchhhhhhhccccccccceeeeeeettcceeeeee</p><p>　　tIeDGIFeVKStAGDthLGGeDFDNRMVNhFIAeFKRKYKKDISDNKRAVRRLRtAceRAKRtLSSStQA</p><p&g

58、t;　　eectteeeeeecttcceeccccchhhhhhhhhhhhhhtcccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhcccc</p><p>　　SIeIDSLYeGVDFYtSItRARFeeLNADLFRGtLDPVeKSLRDAKMDKGQVhDIVLVGGStRIPKIQKLL</p><p>　　heeehhhccccchhhhhhhhhhhhhhhhhh

59、hhhhhhhhhhhhhttcchtccceeeeetcccccchhhhhh</p><p>　　QDFSNGKeLNKSINPDeAVAYGAAVQAAVLSGDKSeNVQDLLLLDVtPLSLGIetAGGVMtVLIKRNttI</p><p>　　hhhhttcccccccctthhhhhhhhhhhhhhhtcccccccheeeeeccccceeeeccccheeeee

60、cttccc</p><p>　　PtKQtQtFttYSDNQPGVFIQVYeGeRAMtKDNNLLGKFeLtGIPPAPRGVPQIeVtFDIDANGIMNVSA</p><p>　　ccccceeeeeccttcceeeeeeettcccccccchhhceeeeecccccccccceeeeeeeecttteeeeee</p><p>　　VDKSt

61、GKeNKItItNDKGRLSKeDIeRMVQeAeKYKAeDDVQRDKVSSKNSLeSYAFNMKStVeDeKLtG</p><p>　　hcccccccceeeeeccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh</p><p>　　KISeeDKtKILeKcNeVISWLDKNQtAeKeeYehQQKeL

62、eKVcNPIItKLYQGAGGMPGGMPeGMPGGFP</p><p>　　hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhcccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhtttccccccccccccccc</p><p>　　GAGGAAPGAGGSSGPtIeeVD</p><p>　　ccccccttttccccceeehhh</p&g

63、t;<p>　　Sequence length : 651</p><p>　　圖4. PaHSP70蛋白二級結(jié)構(gòu)</p><p>　　h表示α螺旋，e表示延伸鏈，t表示β轉(zhuǎn)角，c表示無規(guī)卷曲</p><p>　　Fig.5 Secondary structure of PaHSP70</p><p>　　3.6 香魚HSP

64、70蛋白三維結(jié)構(gòu)分析</p><p>　　為了進一步了解PaHSP70蛋白的特征，通過使用SWISS-MODEL(Schwede et al.2003)同源建模的方法，得到了香魚PaHSP70蛋白的三維模型（圖5）。發(fā)現(xiàn)它具有酶的典型三級結(jié)構(gòu)特征，為EF型，又稱手型結(jié)構(gòu)。中間形成一個裂溝（cleft）用以結(jié)合底物和發(fā)生催化反應(yīng)，是酶的重要結(jié)構(gòu)特點。典型的HSP70由兩部分結(jié)構(gòu)組成：一部分主要由一個N-端高度保守的

65、約為44 kDa的三磷酸腺苷酶（ATPase）功能域；另一部分由一個分子量約為25 kDa的C端區(qū)域組成。N端ATPase功能域的結(jié)構(gòu)類似于凝聚素和己糖激酶，主要由兩個大的球形亞功能域I和II組成，其間被一個深的中央裂縫分開，并通過2個交叉的A螺旋相連接；亞功能域和連接的A螺旋和裂縫的底部形成一個核苷酸及所需的Mg2+和K+的結(jié)合區(qū)域，核苷酸經(jīng)過與兩個磷酸結(jié)合環(huán)和一個疏水腺苷的相互作用而定位在活性部位。C端區(qū)域分為一個保守的15 kDa

66、多肽結(jié)構(gòu)功能域，一個不保守的靠近C端的10 kDa可變區(qū)功能域和C-端最末端的基序[21]。</p><p>　　圖5. PaHSP70蛋白三維結(jié)構(gòu)模型</p><p>　　Fig. 5 Tertiary structure of PaHSP70 protein</p><p>　　3.7 PaHSP70基因系統(tǒng)進化樹分析</p><p>　

67、　使用ClustalX軟件和MEGA4軟件，通過Neighbor-joining(N-J)的方法構(gòu)建了香魚HSP70蛋白的系統(tǒng)進化樹（圖6）。香魚與大西洋鮭（Salmo salar）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）形成一個分支，鯛科形成了一個分支，鯉科組成了一個分支，值得注意的是屬于鯉科的草魚(Ctenopharyngodon idella)卻獨立出一支。</p><p>　　圖6 . PaHSP

68、70基因系統(tǒng)進化樹</p><p>　　Fig.6 Phylogenetic tree of PaHSP70</p><p>　　分支旁的數(shù)字為Bootstrap Test 1000 次的置信度(%); 標尺表示2%的核苷酸序列差異Numbers near the branches are bootstrap probability values (%) with 1000 repli

69、cates; Scale bar corresponds to 2% difference in nucleotide sequence</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　?、?用PCR擴增的方法，克隆得到了香魚的HSP70基因。該基因大小為1956bp，包括完整ORF框，編碼651個氨基酸和一個終止子。起始密碼子為ATG，終止密碼子為

70、TAA。將其命名為PaHSP70。PaHSP70與其它魚類HSP70基因同源性達到87%以上，與其他魚類HSP70蛋白同源性也很高，證明該序列為香魚HSP70基因序列。</p><p>　　⑵ 獲得的PaHSP70序列推斷的氨基酸序列具有HSP70的簽名序列：IDLGTTYS特征基序、IFDLGGGTFDVSIL特征基序、IVLVGGSTRIPKIQK特征基序；HSP70的定位序列：KKDISDNKRAVRR；靠

71、近C端的GGMP4肽特征基序，細胞質(zhì)特異性調(diào)控序列EEVD。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 王鳳昀. 香魚的生物學特性和養(yǎng)殖技術(shù)[J]. 河北漁業(yè), 2000, 100(2): 13-14.</p><p>　　[2] 李明云, 丁夭喜, 竺俊全, 等. 我國香魚的研究現(xiàn)狀及增養(yǎng)殖前景[J]. 寧波大

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