nac對壇紫菜高溫脅迫下hsp70基因表達的影響【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　生物技術</b></p><p>　　NAC對壇紫菜高溫脅迫下hsp70基因表達的影響</p><p>　　一、選題的背景與意義</p>

2、<p>　　紫菜，英文名：laver，是紅藻門(Rhodophyta)原紅藻綱(Protoflorideophyceae)紅毛菜目(Bangiales)紅毛菜科(Bangiaceae)紫菜屬(Porphyra)的統(tǒng)稱。紫菜營養(yǎng)價值高，是重要的食品、藥物、工業(yè)化工原料的來源。廣泛分布于世界各地，但以溫帶為主。自然生長的紫菜數(shù)量有限，產(chǎn)量主要來自人工養(yǎng)殖。壇紫菜(Porphyra haitanensis)、條斑紫菜(P. ye

3、zoensis) 和甘紫菜(P. tenera)是主要的養(yǎng)殖種類。近年來由于環(huán)境惡化而導致的全球海洋溫度升高已經(jīng)嚴重威脅著藻類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。紫菜生活的特殊的環(huán)境使其有著獨特的抗逆機制。深入了解紫菜的抗逆機理對全面紫菜健康養(yǎng)殖并進行紫菜抗逆品種培育有重要意義（楊銳等，2007）。另外，紫菜抗逆性的應用研究也有待深入，開發(fā)和研制適用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高效自由基清除劑，以減輕活性氧在逆境脅迫中對紫菜的傷害而提高其抗逆性，有著廣泛前景。</

4、p><p>　　環(huán)境脅迫能誘導植物抗逆蛋白：熱激蛋白、抗氧化酶等活性的變化，究其本質是逆境誘導植物抗逆基因表達變化的結果，檢測不同環(huán)境脅迫導致不同的抗逆基因的表達有助于了解植物抗逆本質。mRNA水平上的定量檢測是反映某個抗逆蛋白合成、調控的最直接可靠及靈敏的途徑，不但可彌補傳統(tǒng)酶活性測定精確度不高的缺陷，而且有助于準確和全面了解其各種同工酶表達和發(fā)揮功能的差異。</p><p>　　以往的研究

5、中，檢測基因表達水平的方法有Northern雜交、RNase保護分析、原位雜交等多種方法，但這些方法無法對mRNA進行精確定量，上世紀90年代中期誕生的實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR）技術解決了這些問題，實現(xiàn)了mRNA從定性到定量的飛躍，使得從轉錄產(chǎn)物水平上精確研究基因的表達成為了可能。并且以其定量準確、檢測范圍寬（1～1011拷貝）、敏感度高（<5拷貝）、精確度

6、高（CV< 2%）、無PCR后處理步驟、產(chǎn)出率高、可進行多重檢測等優(yōu)點，使其在基礎研究和分子診斷領域廣受青睞。</p><p>　　N-乙酰半胱氨酸(N-acelylcysteine，NAC) 是L-半胱氨酸的乙酰化合物，它是一種含巰基的廣譜型抗氧化物，在細胞內(nèi)去乙?；笊砂腚装彼?，提供合成細胞內(nèi)重要的非酶類抗氧化物質谷胱甘肽( GSH) 的底物，維持細胞內(nèi)GSH水平，穩(wěn)定細胞膜，保護細胞活性。NAC 也

7、可通過形成巰中心自由基及其后的繼發(fā)反應，有效清除自由基，保護細胞免受ROS損害（于敏，李永春，2010）。此外，NAC由于在體內(nèi)能激活體內(nèi)鳥苷酸環(huán)化酶，升高血漿環(huán)磷酸鳥苷酸(cGMP)水平（潘紅英，2004），故能作為NO分子載體 增加體內(nèi)NO的生物利用度，發(fā)揮NO生理效應，促進收縮的微循環(huán)血管擴張，有效增加血液對組織氧輸送和釋放，糾正組織缺氧，防止細胞進一步壞死。目前，NAC在呼吸、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)和AIDS的臨床和實驗研究中均有廣泛

8、應用（鮑紅榮，童立力，2008）。</p><p>　　已有研究報道，NAC作用于一些動物組織或器官后能夠明顯增強其抗氧化能力，表現(xiàn)為體內(nèi)毒性物質減少、SOD活性增強等?？梢栽O想，NAC作為一種廣譜型的抗氧化劑氧化作用的研究卻很少有報道，至于其作用機理及效果均未了解。</p><p>　　HSP70和SOD是重要的抗逆蛋白，重金屬（鎘和銅）、溫度、pH、光照、除草劑等都可能誘導它們差異的表

9、達，來適應其環(huán)境條件的變化。在本研究中，應用實時定量PCR技術研究NAC對壇紫菜高溫脅迫下hsp70或Mn-sod基因表達的影響，旨在為從分子水平上研究NAC對紫菜抗逆性的影響及作用機理，為進一步研究紫菜耐高溫脅迫機理及NAC在紫菜養(yǎng)殖方面的應用提供基礎。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　研究的基本內(nèi)容：</b>

10、</p><p>　　本課題擬應用實時熒光定量PCR技術研究NAC對壇紫菜高溫脅迫下hsp70或Mn-sod基因表達的影響，從分子水平上探討NAC對紫菜抗逆性的影響及作用機理。</p><p><b>　　擬解決的主要問題：</b></p><p>　　實時定量PCR 條件優(yōu)化</p><p>　　NAC 對紫菜熱激條件

11、下hsp70或Mn-sod基因表達的影響</p><p><b>　　紫菜熱激條件</b></p><p>　　NAC 作用濃度篩選</p><p>　　NAC保護下hsp70或Mn-sod基因的表達</p><p>　　三、研究的方法與技術路線：</p><p><b>　　（一）研究

12、方法：</b></p><p>　　采用試劑盒提取壇紫菜總RNA、RT-PCR成cDNA；</p><p>　　設計引物PCR擴增目的基因并連接、轉化至大腸桿菌，用PCR、測序等方法鑒定陽性克隆。</p><p>　　制備質粒標準品，建立SYBR Green Real Time PCR方法，優(yōu)化Real Time PCR條件。</p>&l

13、t;p>　　對壇紫菜進行熱激（35℃）及NAC（濃度5mmol/L）處理后提取總RNA進行實時熒光定量PCR檢測。</p><p>　　根據(jù)實驗數(shù)據(jù)分析hsp70或Mn-sod基因的相對表達及NAC作用結果。</p><p><b>　　（二）技術路線：</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進度：</p><

14、;p>　　2010.08-2010.09 查閱文獻，熟悉實驗操作。進行預實驗。</p><p>　　2010.10-2010.11 完成開題報告及任務書，制定具體研究計劃和試驗方案。</p><p>　　2010.12-2011.02 建立SYBR Green Real Time PCR方法、提取各處理樣品總RNA并進行實時熒光定量PCR檢測。</p><p>

15、;　　2011.02-2011.03 實驗數(shù)據(jù)和材料整理、分析及對整個試驗的補充、完善。</p><p>　　2011.04-2011.05 完成2篇外文翻譯，撰寫論文，結題、答辯。</p><p><b>　　五、主要參考文獻：</b></p><p>　　[1] 鮑紅榮,童立力. N一乙酰半胱氨酸的藥理作用及其臨床應用[J].浙江臨床醫(yī)學，

16、2008，10（9）：1274-1275.</p><p>　　[2] 杜秀敏, 殷文璇, 趙彥修等. 植物中活性氧的產(chǎn)生及清除機制[J]. 生物工程學, 2001, 3: 121-125.</p><p>　　[3] 郝林華,孫丕喜,王能飛等. 南極冰藻Chlorophyceae L4 抗氧化酶活性對溫度升高的響應[J].漁業(yè)科學進展,2009.30（3）：97-102.</p&g

17、t;<p>　　[4] 姜國忠,許培榮,牛向麗,等. 鹽藻胞漿hsp70 cDNA 的克隆及其mRNA的誘導表達[J ] . 海洋科學,2005 ,5: 43-49.</p><p>　　[5] 馬旭俊, 朱大海. 植物超氧化物歧化酶(SOD)的研究進展[J]. 遺 傳HEREDITAS(Beijing), 2003, 25(2): 225-231.</p><p>　　[6

18、] 王榮,劉濤,周曉君,等. 條斑紫菜錳超氧化物歧化酶基因克隆與序列分析[J ] . 高技術通訊,2006 ,16 (5) :522-528.</p><p>　　[7] 王悠,唐學璽. 不同海帶品系抗氧化系統(tǒng)活性與耐熱性的相關性研究[J ] . 應用生態(tài)學報, 2005 , 16 (8) :1507-1510.</p><p>　　[8] 夏快飛,梁承鄴,葉秀粦. 鈣調素及鈣調素相關蛋白

19、在植物細胞中的研究進展[J ] . 廣西植物, 2005 , 25 (3) : 269-273.</p><p>　　[9] 謝榮,唐學璽,李永祺,等. 活性氧對3種海洋微藻生長的影響[J ] . 海洋學報,2001 ,23 (1) :94-101.</p><p>　　[10] 楊銳,張曉龍,徐麗寧等. 壇紫菜耐高溫脅迫機理之初步研究[ EB/ OL ] . http://epub. c

20、nki.net/grid 2008/detail. aspx ? filename = ZGHI200708001174 & dbname = CPFD2007.</p><p>　　[11] 于敏，李永春.氧化應激對COPD 大鼠膈肌影響N－乙酰半胱氨酸的作用[J],廣東醫(yī)學，2010，31（19）：2246-2248.</p><p>　　[12] Apel K,Hirt H．

21、Reactive oxygen species：Metabolism,oxidmive stress,and signal transduction．Annu Rev Plant Biol, 2004．55：373-399.</p><p>　　[13] Dat J F,Pellinen R,Beeckman T,et a1．Changes in hydrogen peroxide homeostasis tri

22、gger an active cell death process in tobacco[J]．P1ant J, 2003, 33(4)：621-632.</p><p>　　[14] Halliwell B, Gutteridge J M C. Free Radicals in Biology and Medicine[M]. 4rd edition, Oxford,Clarendon Press, 2006.

23、</p><p>　　[15] Mahalingam R , Fedoroff N. Stress response, cell death and signalling: the many faces of reactive oxygen species[J]. Physiologia Plantarum, 2003, 119: 56-68.</p><p>　　[16] Mittler

24、 R, Vanderauwera S, Gollery M, et al. Reactive oxygen gene network of plants[J]. Trends in Plant Science, 2004, 10: 490-496.</p><p>　　[17] Nitta K,Suzuki N ,Honma D ,et al . Ultrastructural Stability under H

25、igh Temperature or Intensive Light Stress Conferred by a Small Heat Shock Protein in Cyanobacteria[J ]. FEBS Letters ,2005 ,579 :1235-1242.</p><p>　　[18] Sachin K, Jane L,Ung L, et al. Complexity of the heat

26、 stress response in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2007, 10:310-316.</p><p>　　[19] Schulz-Raffelt M ,Lodha M , Schroda M. Heat Shock Factor 1 Is a Key Regulator of the Stress Response in Chlamy

27、 domonas [ J ] . The Plant Journal , 2007 , 52(2) :286-295.</p><p>　　[20] Xu S C, Ding H D, Sang J R. Reactive Oxygen Species , Metabolism , and Signal Transduction in Plant Cells[J ] . Acta Botanica Yunn

28、anica ,2007 ,29 (3) :355-365. </p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　生物技術</b></p><p>　　藻類耐高溫脅迫分子機理的研究進展</p><p>　　摘要：藻類生活的特殊的水體環(huán)境使其有著獨特的抗逆機制。近年來由于

29、環(huán)境惡化而導致的全球海洋溫度升高已經(jīng)嚴重威脅著藻類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本文從活性氧脅迫及抗氧化系統(tǒng)、信號轉導系統(tǒng)和熱激蛋白三個方面對藻類耐高溫脅迫的分子機理做了綜述，并介紹了相關方面的最新研究成果，以期為今后關于這方面的研究提供參考。</p><p>　　關鍵詞：藻類；高溫脅迫；活性氧（ROS）；分子機理</p><p>　　以紫菜、海帶為代表的大型經(jīng)濟海藻不但維持著海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡，而且

30、是重要的食品、藥物、工業(yè)化工原料的來源，藻類栽培業(yè)作為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的支柱之一，近年來由于環(huán)境惡化而導致的全球海洋溫度升高已對其健康發(fā)展造成了嚴重威脅。究其本質，是由于高溫脅迫引發(fā)了藻類一系列生理生化變化，最后導致整個植株質變，并走向死亡。深入了解藻類的耐高溫機理對全面藻類健康養(yǎng)殖并進行抗逆品種培育有著重要意義。</p><p>　　在植物中的大量研究表明，活性氧脅迫及抗氧化系統(tǒng)、信號轉導系統(tǒng)、熱激蛋白等在植物高

31、溫脅迫應答過程中起重要作用，藻類中也有相關研究報道，楊銳等（2007）研究了壇紫菜的耐高溫機理，推測其對熱脅迫應答的可能模式為:熱脅迫→活性氧(ROS)上升→細胞感受到過量的ROS信號，并傳遞、轉導→滲透壓調節(jié)系統(tǒng)和自由基清除非酶促保護系統(tǒng)迅速反應，并伴隨hsp70等功能基因的表達。</p><p>　　1 活性氧脅迫及抗氧化系統(tǒng)</p><p>　　有氧代謝是大多數(shù)植物生存所必須的，植物

32、將氧氣還原成水，為植物的生長和發(fā)育提供能量。但還原過程不完全時，就會產(chǎn)生一類化學性質活潑，氧化能力極強的含氧物質：H2O2、單線態(tài)氧和羥自由基等，即通常說的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）。ROS是所有需氧生物代謝過程中不可避免的產(chǎn)物。在正常生長條件下，植物細胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。當外界條件如溫度、鹽度等急劇變化時，這種平衡就會被破壞，致使活性氧自由基大量積累，進一步形成氧化損傷，

33、隨著脅迫時間的延長，有可能導致植株死亡。從本質上講，活性氧代謝的失調是植物逆境傷害的共同機理之一（Mahalingam and Fedoroff, 2003）。在長期的進化過程中，植物自身形成了一整套完備的ROS防護機制，從而免于被ROS傷害，這就是植物抗氧化系統(tǒng)，包括酶促和非酶促兩類。在植物的抗逆研究中，越來越多的學者將目光轉移到抗氧化系統(tǒng)的研究。</p><p>　　1.1 酶促抗氧化系統(tǒng)</p>

34、<p>　　植物體內(nèi)酶促抗氧化系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、還原型抗壞血酸過氧化物酶（ASP）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽還原酶（GR）等。SOD在ROS的清除系統(tǒng)中發(fā)揮著特別重要的作用，是植物體內(nèi)清除ROS系統(tǒng)的第一道防線，在保護系統(tǒng)中處于核心的地位（馬旭俊，朱大海，2003）。其主要功能是清除O2－，催化反應為：2O2－+2H→ H2O2 +O2。CAT和PO

35、D清除生物體內(nèi)的H2O2，其催化反應為：2 H2O2→2 H2O+O2。GPX構成了利用谷胱甘肽來減少H2O2、脂質氫過氧化物和其他氫過氧化物的另一個酶家族?？箟难徇^氧化物酶（APX），脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reduce tase，MDAR），單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDAR）和谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）

36、，以及2種小分子量的物質（AsA和谷胱甘肽）共同組成葉綠體中的抗壞血酸（AsA）/谷胱甘肽循環(huán)，是清除活性氧的主要系統(tǒng)。此外，還有硫氧還蛋白和硫氧</p><p>　　1.2非酶促抗氧化系統(tǒng)</p><p>　　非酶促抗氧化系統(tǒng)主要是指植物體內(nèi)所含的抗氧化物質。目前，發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)抗氧化物質主要包括抗壞血酸（ASA），α-生育酚（VE）、維生素C、甘露醇、還原性谷胱甘肽（GSH）、類胡蘿卜素

37、等。這些物質既可直接同ROS反應，將其還原，又可作為酶的底物在ROS的清除中發(fā)揮重要作用（杜秀敏等，2001）?？箟难岷凸入赘孰膮⑴c了植物細胞中抗氧化劑的再生過程。還原型谷胱甘肽作為還原劑參與抗壞血酸的再生，產(chǎn)生的氧化型谷胱甘肽可以通過谷胱甘肽還原酶得到還原?？箟难釀t在α-生育酚和玉米黃質的再生循環(huán)中充當還原劑。維生素C能有效地清除O2H和H2O2，提高SOD和POD活性，類胡蘿卜素是植物體內(nèi)最重要的O2-猝滅劑，從而保護細胞膜系統(tǒng)

38、，特別是葉綠體光合膜系統(tǒng)。</p><p>　　1.3藻類抗氧化系統(tǒng)研究進展</p><p>　　由于目前的研究多集中在高等植物上，對海藻的研究則相對較少，但是，藻類的活性氧清除機理和高等植物極其相似，因此，高等植物的抗氧化研究同樣適用于藻類。謝榮等（2001）檢測了ROS對3種海洋微藻生長的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度的ROS可以提高藻細胞的SOD活性，說明其可能試圖通過增加SOD等抗氧化系統(tǒng)成分來

39、削弱ROS的影響。王悠等（2005）比較了兩個海帶品系耐高溫海帶901和熱敏感海帶榮成1號的抗氧化系統(tǒng)與耐熱性的關系，發(fā)現(xiàn)901（耐高溫海帶）的抗氧化系統(tǒng)能對高溫脅迫做出積極響應，從而提高其耐熱性。王榮等（2006）克隆了條斑紫菜Mn-SOD的cDNA和基因序列，經(jīng)系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)其與萊茵衣藻和海鏈藻的親緣關系較近，并推測其可能在紫菜抗逆過程中起重要作用。郝林華等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，南極冰藻Chlorophyceae L4在環(huán)境溫度高

40、于最適生長溫度時各種與代謝相關的抗氧化酶系統(tǒng)的活性大幅度提高，顯示出較高的抗高溫脅迫能力。</p><p>　　2 信號轉導系統(tǒng)與高溫脅迫</p><p>　　2.1 ROS信號轉導</p><p>　　ROS除了導致細胞的傷害以外， 還可以在植物細胞中作為一種普遍存在的信號分子起作用。ROS信號傳遞是通過其產(chǎn)生和清除實現(xiàn)的。誘導產(chǎn)生ROS的酶定位于細胞的不同區(qū)室，

41、而酶的激活由刺激物的特點及感知路線決定。ROS爆發(fā)的最初部位、持續(xù)時間及強度差異會導致次級信號的化學性質、亞細胞定位、壽命及強度的不同（Mahalingam and Fedoroff, 2003）。質膜NADPH氧化酶(NADPH oxidase)被認為是是植物產(chǎn)生ROS的關鍵酶。ROS作為一種信號轉導因子，啟動了ROS清除系統(tǒng)以及抗脅迫基因系統(tǒng)的表達（Xu等，2007）。研究表明，植物在熱脅迫下，ROS作為信號分子能夠誘導熱激蛋白（H

42、SP）的合成，但是ROS如何調控HSP的表達目前并不清楚（Sachin等，2007）。</p><p>　　ROS作為通用信號分子可能源于它們被用來感知脅迫。大部分生物及非生物脅迫擾亂了細胞中的代謝平衡，導致產(chǎn)生過量ROS。不同發(fā)育或是環(huán)境信號流入ROS信號轉導網(wǎng)絡并擾亂ROS的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。ROS信號的改變被各種蛋白質、酶或受體感知，進而調節(jié)相應的發(fā)育、代謝及防御途徑。近年來，對擬南芥的研究揭示了ROS信號轉導途徑中

43、的一些關鍵組分。雖然目前感知ROS的受體尚未發(fā)現(xiàn)，但人們推測植物細胞至少存在三種不同的機制感知并轉導ROS信號：（i）未被鑒定的受體蛋白；（ii）對氧化還原反應敏感的轉錄因子，例如NPR1或者HSFs；（iii）被ROS直接抑制的磷酸酶。（Mittler等，2004；Apel and Hirt, 2004）。藥理學及遺傳學研究表明，ROS信號轉導中可能存在另一條由NADPH氧化酶介導的正放大回路（Dat等，2003）。這一回路可被低水平

44、的ROS激活，導致細胞特定部位ROS信號的產(chǎn)生和放大；而細胞中ROS過量積累又會激活ROS清除路徑，從而降低細胞特定部位或整個細胞的ROS水平，這是一條反饋抑制回路。目前對ROS信號途徑的了解還很有限，也是研究熱點。</p><p>　　2.2 Ca2 +信號轉導</p><p>　　Ca2 + 是植物細胞中的主要胞內(nèi)信使，許多外界信號(包括各種環(huán)境刺激、胞間化學信號、物理信號等) 經(jīng)其受

45、體進行跨膜信號轉導， 調節(jié)Ca2 + 的分布及其在特定部位的瞬間變化而產(chǎn)生鈣離子信號，鈣離子信號進而影響其靶蛋白活性，從而調控基因表達及生理反應（林忠平，2000）。Torrecilla等（2000）檢測了魚腥藻( Anabaena sp . PCC7120) 細胞內(nèi)的游離Ca2 + 濃度，發(fā)現(xiàn)熱激20 min細胞內(nèi)的游離Ca2 + 濃度達到最大值，升高的Ca2 + 既來自于細胞外又來自于細胞內(nèi)。CaM 是植物細胞中Ca2 +最重要的受

46、體蛋白，是Ca2 + 參與的信號轉導途徑中的重要成員。CaM結合Ca2 +后分子構象發(fā)生改變，其疏水區(qū)呈激活態(tài)后能與多種靶蛋白結合，進而調節(jié)靶蛋白的活性。CaM在具有高度保守性，目前已鑒定的植物鈣調素與藻類的相似性為84 %～100 %（夏快飛，梁承鄴，葉秀粦，2005） 。 </p><p>　　2.3 HSF信號轉導</p><p>　　熱激轉錄因子( HSF) 是細胞內(nèi)的一種轉錄調節(jié)

47、因子，在熱激條件下可以激活熱激基因的表達。HSF在本質上是具有轉錄調節(jié)活性的蛋白質，其在熱應激反應中的主要功能，是在熱激基因的表達過程中與相應啟動子結合，啟動基因的轉錄過程，最終促進熱激蛋白(HSP)的表達。在熱激基因的啟動子中有一小段特異的DNA識別序列，它是HSF的結合位點，被稱為熱激元件( HSE)，HSF被激活后與HSE結合會啟動熱激基因的表達。HSE是一種順式元件，包括TATA盒近端HSE和TATA盒遠端的HSE。實驗表明，不

48、同種類的HSF受到激活的信號不同，但其中的機制還有待研究。植物中存在多種HSF，在藻類中，發(fā)現(xiàn)綠藻Ostreococcus tauri 中有1種HSF，萊茵衣藻中有2種HSF，單細胞紅藻Cyanidioschyzon merolae中有3種HSF，其中萊茵衣藻中的HSF1已被證實受高溫誘導，通過RNAi抑制HSF1基因的藻株對熱敏感，而且熱激蛋白HSP70、HSP90、 HSP100等的表達都受到抑制（Schulz-Raffelt等，2

49、007）。</p><p>　　2.4 MAPKs信號轉導</p><p>　　蛋白質的磷酸化與去磷酸化過程是包括植物在內(nèi)的生物體中普遍存在的一種重要調節(jié)機制。幾乎涉及所有的生理和病理過程，它在細胞信號傳導中起重要作用。MAPKs (mitogen-activited protein kinases) 是一類存在于各種真核生物體中的絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，它與MAPKK (mitogen

50、-activated protein kinase kinase,MAPKK)和MAPKKK (mitogen-activated protein kinase kinase kinase. MAPKKK)組成MAPK級聯(lián)信號通路，接受外界刺激信號，將信號轉入細胞內(nèi)，影響特定基因的表達，從而影響植物的生長、發(fā)育、分化和凋亡等多方面生理過程。當生物體遭遇脅迫(如高溫、鹽堿等) 時，MAPK會被上游信號分子激活，再通過對下游分子絲氨酸、蘇氨

51、酸殘基部位的磷酸化作用，將外界信號傳遞給細胞核，調節(jié)特異基因的表達（Kovtun等，2000）。Jiménez 等（2004）從高溫、高滲透壓等脅迫條件下的杜氏藻Dunaliella viridis 中分離到了一種大小為57×103的蛋白，經(jīng)驗證為</p><p>　　3 熱激蛋白與高溫脅迫</p><p>　　熱激蛋白HSP(Heat Shock Proteins)，

52、最初被定義為是生物有機體受熱脅迫下誘導合成的一類應激蛋白（Sachin等，2007）。當生物體受到高溫脅迫時，會新合成或增強合成熱激蛋白，參與生物體內(nèi)新生肽的運輸、折疊、組裝、定位以及變性蛋白的復性和降解，緩解高溫脅迫造成的傷害，產(chǎn)生抗熱性。近年來的研究表明：除高溫外，其他環(huán)境脅迫（如低溫、干旱、高滲透壓及重金屬等環(huán)境因素）也可以誘導HSP的產(chǎn)生。HSPs 超家族包括在各種生物中大量不同分子量的HSPs : HSP100(Clp) 、H

53、SP90 、HSP70 (Dna K) 、HSP60 ( Gro EL) ，還有一組分子量在16000 ～ 40000之間的小HSPs。另外，正常條件下生活的細胞中也有HSP，這類HSP是組成型表達的，稱為HSC(Heat Shock Cognate Protein)。</p><p>　　Furuki 等（1996）在聚球藻Synechococcus vulcanus 中克隆到了HSP60（gro EL）基因，

54、在熱激條件下，該基因的轉錄數(shù)可增長幾倍。Bierkens等（1998）證明環(huán)境中不同的pH、溫度、胡敏酸（humic acid）、硝酸鹽、磷酸鹽等都會誘導藻（Raphidocelis subcapitata）hsp70的瞬時表達，其中溫度、pH刺激可能會提高該藻的抗逆性。藍藻中的Dna K蛋白與植物中的線粒體和質體的HSP70同源性較高，Nimura等（2001）發(fā)現(xiàn)聚球藻Synechococcus sp . PCC7942. 中的Dn

55、a K蛋白家族有三種蛋白Dna K1，Dna K2和Dna K3，其中Dna K2對熱脅迫反應敏感，而Dna K1和Dna K3在熱脅迫下無轉錄增強的現(xiàn)象，推測Dna K2可能與熱應激反應有關。Ireland等（2004）發(fā)現(xiàn)高溫42℃的脅迫下，2h時墨角藻（Fucus serra tus）hsp70表達量最大，4h時浮萍（Lemna minor）hsp70表達最豐富。姜國忠等（2005）從鹽藻(Dunaliella salina)&l

56、t;/p><p><b>　　4 結語</b></p><p>　　藻類生活的特殊的水體環(huán)境使其必然具有一些不同于陸生植物的特殊功能蛋白、功能因子、信號傳導和調控機制等，但是我們目前對此認識還遠遠不夠，尤其對于藻類細胞如何感受脅迫、如何將脅迫信號傳遞到細胞中誘導相關轉錄因子的表達并調控下游功能基因的表達等一系列的分子機理都還知之甚少。深入研究藻類高溫脅迫的應答機制，了解其

57、耐高溫機理，對于促進藻類的健康養(yǎng)殖和耐高溫品種選育等都具有重要意義。另外，藻類抗逆性的應用研究也有待深入，應盡快研制適用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高效自由基清除劑，以減輕活性氧在逆境脅迫中對藻類的傷害，從而提高海藻的抗逆性。</p><p>　　隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，關于植物逆境脅迫下誘導表達的基因、信號的傳導、基因表達調控、逆境脅迫相關轉錄因子及抗逆脅迫的基因工程研究已經(jīng)越來越深入，為了解植物對不同逆境響應的分子機理

58、及研究人工調控生物技術等方面展示出良好的前景。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 杜秀敏，殷文璇，趙彥修等. 植物中活性氧的產(chǎn)生及清除機制[J]. 生物工程學，2001，3： 121-125.</p><p>　　[2] 郝林華，孫丕喜，王能飛等. 南極冰藻Chlorophyceae L4 抗氧化酶活性對

59、溫度升高的響應[J].漁業(yè)科學進展，2009，30（3）：97-102.</p><p>　　[3] 姜國忠，許培榮，牛向麗等. 鹽藻胞漿hsp70 cDNA 的克隆及其mRNA的誘導表達[J ] . 海洋科學，2005 ，5： 43-49.</p><p>　　[4] 林忠平. 走向21世紀的植物分子生物學[M] . 北京：科學出版社，2000 ：266-270.</p>

60、<p>　　[5] 馬旭俊，朱大海. 植物超氧化物歧化酶(SOD)的研究進展[J]. 遺 傳HEREDITAS(Beijing)，2003，25(2)： 225-231.</p><p>　　[6] 王榮，劉濤，周曉君等. 條斑紫菜錳超氧化物歧化酶基因克隆與序列分析[J ] . 高技術通訊，2006 ，16 (5) ：522-528.</p><p>　　[7] 王悠，唐學璽.

61、不同海帶品系抗氧化系統(tǒng)活性與耐熱性的相關性研究[J ] . 應用生態(tài)學報，2005 ，16 (8) ：1507-1510.</p><p>　　[8] 夏快飛，梁承鄴，葉秀粦. 鈣調素及鈣調素相關蛋白在植物細胞中的研究進展[J ] . 廣西植物，2005 ，25 (3) ： 269-273.</p><p>　　[9] 謝榮，唐學璽，李永祺等. 活性氧對3種海洋微藻生長的影響[J ] .

62、海洋學報，2001 ，23 (1) ：94-101.</p><p>　　[10] 楊銳，張曉龍，徐麗寧等. 壇紫菜耐高溫脅迫機理之初步研究[ EB/ OL ] . http://epub. cnki.net/grid 2008/detail. aspx ? filename = ZGHI200708001174 & dbname = CPFD2007.</p><p>　　[11

63、] Apel K,Hirt H．Reactive oxygen species: Metabolism, oxidmive stress, and signal transduction．Annu Rev Plant Biol, 2004, 55: 373-399.</p><p>　　[12] Asada K. Production and action of active oxygen in photosyn

64、thetic tissue[M]. CRC Press Boca Raton F L, 1994, 77-104.</p><p>　　[13] Balentine J D. Pathology of Oxygen Toxicity[M]. New York: Academic Press, 1982.</p><p>　　[14] Bierkens J, Van de Perre W,

65、Maes J. Effect of different environmental variables on the synthesis of Hsp70 in Raphidocelis subcapitata[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A 120, 1998: 29-34.</p><p>　　[15] Dat J F,Pellinen R

66、,Beeckman T,et a1．Changes in hydrogen peroxide homeostasis trigger an active cell death process in tobacco[J]．P1ant J, 2003, 33(4): 621-632.</p><p>　　[16] Furuki M , Tanaka N , Hiyama T , et al . Cloning ,Ch

67、aracterization and Functional Analysis of Groel-Like Gene f rom Thermophilic Cyanobacterium Synechococcus vulcanus , which Does Not form an Operon with Groes [ J ] . Biochimica et Biophysica Acta, 1996, 1294 :106-110.<

68、;/p><p>　　[17] Halliwell B, Gutteridge J M C. Free Radicals in Biology and Medicine[M]. 4rd edition, Oxford,Clarendon Press, 2006.</p><p>　　[18] Ireland H E, Harding S J, Graham A, et al. Evaluatio

69、n of heat shock protein 70 as a bio-marker of environmental stress in Fucus serratus and Lemna minor[J]. Biomarkers, 2004 , 9 (2): 139-155.</p><p>　　[19] J iménez C ,Berl T ,Rivard C J , et al . Phospho

70、rylation of MAP Kinase-Like Proteins Mediate the Response of the Halotolerant Alga Dunaliel la viridis to Hypertonic Shock [ J ] . Biochimica et Biophysica Acta( BB A ) -Molecular Cell Research , 2004 , 1644 (1 , 2) :61-

71、69.</p><p>　　[20] Kovtun Y,Tena G,Tena G. Functional Analysis of Oxidative Stress-Activated Mitogen-Activated Protein Kinase Cascade in Plants[J ]. Proceedings of the National Acade my of Sciences (USA), 200

72、0, 97 : 2940-2945.</p><p>　　[21] Mahalingam R , Fedoroff N. Stress response, cell death and signalling: the many faces of reactive oxygen species[J]. Physiologia Plantarum, 2003, 119: 56-68.</p><p

73、>　　[22] Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M, et al. Reactive oxygen gene network of plants[J]. Trends in Plant Science, 2004, 10: 490-496.</p><p>　　[23] Nimura K, Takahashi H , Yoshikawa H. Characterizat

74、ion of the Dna K Multigene Family in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC7942 [J ]. Journal of Bacteriology, 2001, 183(4): 1320-1328.</p><p>　　[24] Nitta K, Suzuki N, Honma D, et al . Ultrastructu

75、ral Stability under High Temperature or Intensive Light Stress Conferred by a Small Heat Shock Protein in Cyanobacteria[J ]. FEBS Letters, 2005, 579 :1235-1242.</p><p>　　[25] Sachin K, Jane L,Ung L, et al. C

76、omplexity of the heat stress response in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2007, 10:310-316.</p><p>　　[26] Schulz-Raffelt M ,Lodha M , Schroda M. Heat ShockFactor 1 Is a Key Regulator of the St re

77、ss Response in Chlamy domonas [ J ] . The Plant J ournal, 2007, 52(2): 286-295.</p><p>　　[27] Torrecilla I ,Leganes F ,Bonilla I ,et al . Use of Recombinant Aequorin to Study Calcium Transient s in Response

78、to Heat and Cold in Cyanobacterial [J ] . Plant Physiology, 2000, 123 (1): 161-175.</p><p>　　[28] Xu S C, Ding H D, Sang J R. Reactive Oxygen Species, Metabolism, and Signal Transduction in Plant Cells[J ] .

79、 Acta Botanica Yunnanica, 2007, 29 (3): 355-365.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　NAC對壇紫菜高溫脅迫下hsp70基因表達的影響</p><p><b&

80、gt;　　目錄</b></p><p>　　1 引言……………………………………………….....……………………………………...................………… 1</p><p>　　2 材料與方法……………………………………………......……………………...................……………...…… 2</p><p>　

81、　2.1 實驗材料………………………………………..............................……...................…………………….... 2</p><p>　　2.1.1 實驗樣品…………...……………………..……………………………...................…………………2</p><p>　　2.1.2 菌株和載體…………………..

82、.………………........………………………...................……………. 2</p><p>　　2.1.3 試劑和試劑盒………………...………………………………...................…………………………. 2</p><p>　　2.1.4 實驗儀器………………………...…………………………………...................…………

83、…………. 2</p><p>　　2.2 實驗方法………………………………………………………...........…………......................…………… 2</p><p>　　2.2.1 壇紫菜總RNA的提取…………………………………………...……….…...................…………. 2</p><p>　　2.2.2

84、 第一鏈cDNA的合成………………………………………….............……...................….………. 3</p><p>　　2.2.3 實時熒光定量PCR引物的設計……………………………………..............……...................…… 3</p><p>　　2.2.4 實時熒光定量PCR標準質粒的構建…………………………

85、………..……….…...................……3</p><p>　　2.2.5 實時熒光定量PCR檢測樣品…………………………………………..………...................….……4</p><p>　　3 結果與分析………………………………………………………………...................………….......………….. 5</p>

86、;<p>　　3.1 組織RNA提取和目的基因片段的制備…………...………………………...................…....…………… 5</p><p>　　3.2 重組質粒的鑒定……………………....…………………...............................................................….……. 6</p><

87、;p>　　3.3 標準品質粒的熒光定量PCR檢測…….……...…………………...……….................................…...…… 6</p><p>　　3.3.1 擴增曲線分析…………....…………………………..…...................................................................... 6<

88、;/p><p>　　3.3.2 標準曲線分析…………………………………………...................................................................... 7</p><p>　　3.3.3 溶解曲線分析………………………………………….................................................

89、..................... 8</p><p>　　3.3.4 重復性檢測………………………………………….......................................................................... 10</p><p>　　3.4 hsp70基因的差異表達檢測結果…………………..………………….……………....

90、...............………11</p><p>　　3.4.1 實驗樣品擴增的動力學參數(shù)…………...….............…………….……………...................………11</p><p>　　3.4.2 不同處理條件下的樣品拷貝數(shù)…….............………...….............……………...................……

91、…12</p><p>　　3.4.3 不同處理條件下hsp70基因的相對表達...………..….............……………......................………13</p><p>　　4 討論……………………………………………………………...................………………......………………. 15</p><p>　　4

92、.1 溫度脅迫與hsp70基因的表達……………………....…...………………....…...……...................…….. 15</p><p>　　4.2 NAC干預與hsp70基因的表達…………………………....………………....................................…… 16</p><p>　　4.3 不同處理條件下hsp70

93、基因表達的相似性………………...………………...............................………. 16</p><p>　　5 結論……………………………………………………………………………..............................…………… 17</p><p>　　致謝………………………………………………………………………………….......……

94、…...................…… 18</p><p>　　參考文獻……………………………………………………………………………......…...................…………. 18</p><p>　　附錄………………………………………………………………………………...................…….......………… 19</p><

95、;p>　　附錄1：紫菜葉狀體總RNA的提取………………...…...........................…………...........................……… 19</p><p>　　附錄2：DH5α大腸桿菌感受態(tài)的制備……………….......…………......………........................................... 19</p>

96、;<p>　　附錄3：PCR產(chǎn)物的回收……………………………….………………………...…..........................…...…. 19</p><p>　　附錄4：PCR膠回收產(chǎn)物與克隆載體的連接與轉化………………………….…......................……....…… 20</p><p>　　附錄5：重組質粒的抽提………………..

97、..…………………………………................................................... 20</p><p>　　附錄6：陽性質粒的篩選與PCR鑒定………….………………..…………………..............................…..... 20</p><p>　　摘要：活性氧（ROS）代謝的失調是植物逆境傷害的共同機理之

98、一。本研究利用實時熒光定量PCR技術，以18s為內(nèi)源特異參照基因，對壇紫菜hsp70基因在高溫脅迫及活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）干預下的相對表達進行了研究。結果表明：在35℃熱脅迫及5mmol/L NAC處理短時間（5min）內(nèi)，壇紫菜hsp70基因的表達都會迅速升高，隨后繼續(xù)逐漸上升，且都在12小時時達到頂峰，然后又急劇下降；NAC干預下hsp70基因表達的上升幅度較熱脅迫大，熱脅迫+NAC干預下上升幅度最大。該結果提示5m

99、mol/L NAC可能對壇紫菜耐高溫脅迫并沒有保護作用，對正常壇紫菜細胞也有一定的毒害作用，而且較熱脅迫要強烈，這可能與外源藥物NAC破壞了正常細胞內(nèi)的ROS穩(wěn)態(tài)有關。這種傷害是否由高濃度的NAC引起或者低濃度的NAC是否能保護壇紫菜細胞免受ROS損害需要更進一步的研究。</p><p>　　關鍵詞：高溫脅迫；hsp70；N-乙酰半胱氨酸（NAC）；實時熒光定量PCR；ROS</p><p&g

100、t;　　Abstract：The imbalance of reactive oxygen species (ROS) metabolism is one of the common reasons for stress injury in plants. In the present study, the expression of hsp70 gene of Porphyra haitanensis under high tempe

101、rature stress and the ROS remover N-acetylcysteine (NAC) treatment were detected by the real-time quantitative PCR technique . The result showed that the level of mRNA expression of hsp70 gene increased rapidly after a s

102、hort period of heat shock (35℃, 5min), so that in the experiment</p><p>　　Keywords: high temperature stress; hsp70; N-acetylcysteine (NAC); real-time quantitative PCR; ROS</p><p><b>　　1 引言

103、</b></p><p>　　壇紫菜（Porphyra haitanensis）是我國最重要的經(jīng)濟藻種之一，為潮間帶大型藻類的典型代表，生活環(huán)境復雜多變，具有特殊的抗逆應答機制，是研究藻類抗逆機理的良好材料。近年來由于海水養(yǎng)殖無節(jié)制擴大和工業(yè)發(fā)展造成海水污染以及全球氣候變化等自然和人為因素的影響，越來越多海區(qū)環(huán)境日益惡化，成為逆境，嚴重威脅著藻類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。深入了解紫菜的抗逆機理對全面紫菜健康養(yǎng)