納米al2o3對(duì)斑馬魚(yú)肝基因表達(dá)的影響【開(kāi)題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開(kāi)題報(bào)告</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　納米Al2O3對(duì)斑馬魚(yú)肝基因表達(dá)的影響</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><

2、;p>　　納米材料的生物安全性問(wèn)題之所以受到科學(xué)家們的關(guān)注，是因?yàn)榧{米材料特殊的物理化學(xué)性質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致它們?cè)谏矬w內(nèi)的生理行為與常規(guī)物質(zhì)不同，在環(huán)境中的行為也可能與常規(guī)物質(zhì)不一樣。目前納米材料的生物效應(yīng)、環(huán)境效應(yīng)以及毒性和安全性的研究才剛剛起步，科學(xué)家們只對(duì)納米TiO2、SiO2、碳納米管、富勒烯和納米鐵粉等少數(shù)幾種納米材料的生物效應(yīng)進(jìn)行了初步研究。結(jié)果均表明這幾種納米材料對(duì)生命體有一定的毒性作用。如用吸入法和注入法將納米TiO2

3、導(dǎo)入小鼠、大鼠和豚鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)TiO2能誘發(fā)肺部炎癥，并在肺部嚴(yán)重沉積，難以清除；在紫外光的作用下，納米TiO2 能加強(qiáng)Gfsk-S1魚(yú)細(xì)胞中的DNA的損傷等。但是，納米材料的毒性及其作用機(jī)理還遠(yuǎn)遠(yuǎn)未被充分揭示，金屬納米顆粒是其中的一種類型，工業(yè)上大量生產(chǎn)的金屬納米粒子對(duì)生物及環(huán)境的效應(yīng)還是未知數(shù)，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)金屬納米顆粒的生物學(xué)效應(yīng)研究較少，有報(bào)道表明納米A12O3粉可小鼠使血清LDH活性明顯增高；而納米ZnO對(duì)雌性小鼠的肝、腎和心肌

4、有輕度毒性；Fe2O3納米粒子在一定范圍內(nèi)可抑制HepG2細(xì)胞增值，高劑量導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位下降，且細(xì)胞凋亡率顯著增高。在對(duì)小鼠的研究</p><p>　　斑馬魚(yú)是一種小型熱帶淡水魚(yú)，生存能力強(qiáng)，遺傳背景清楚，物種穩(wěn)定，繁殖力強(qiáng)，胚胎透明，易于觀察，基于自身的這些優(yōu)點(diǎn)最早是作為胚胎發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。自20世紀(jì)70年代末期，國(guó)外開(kāi)始運(yùn)用斑馬魚(yú)進(jìn)行化學(xué)物的急性毒性研究， 現(xiàn)在斑馬魚(yú)(Brachyda

5、nio rerio)是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）推薦使用的標(biāo)準(zhǔn)化魚(yú)類毒性試驗(yàn)動(dòng)物。</p><p>　　本課題正是基于這一點(diǎn)，選取斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，研究納米Al2O3對(duì)斑馬魚(yú)生理代謝的影響及其相關(guān)基因表達(dá)的研究,為該領(lǐng)域的研究提供參考，積累數(shù)據(jù)，更為深入了解納米Al2O3的毒性及其機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù)。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問(wèn)題：</p><

6、p><b>　　基本內(nèi)容</b></p><p>　　1. 從轉(zhuǎn)錄水平研究納米Al2O3對(duì)魚(yú)的生物學(xué)效應(yīng)，包括RNA含量的測(cè)定；</p><p>　　2. 從分子水平研究納米Al2O3對(duì)魚(yú)的生物學(xué)效應(yīng)，如hsp70等基因的表達(dá)。</p><p><b>　　擬解決的主要問(wèn)題</b></p><p&

7、gt;　　1. 斑馬魚(yú)魚(yú)肝RNA的提取及含量的測(cè)定；</p><p>　　2. 檢測(cè)熱應(yīng)激蛋白70（hsp70），金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子（mtf1），多藥耐藥基因（mdr)、 Na+-K+-ATP(nka)等基因的表達(dá)。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p><b>　　研究方法：</b></p><p&

8、gt;　　運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)熱應(yīng)激蛋白70（hsp70），金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子（mtf1），多藥耐藥基因（mdr)、Na+-K+-ATP(nka)等基因在納米A12O3脅迫下的表達(dá)；</p><p><b>　　研究技術(shù)路線：</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2009年10、11月 ： 納米A12

9、O3 處理斑馬魚(yú)；</p><p>　　斑馬魚(yú)肝臟RNA提??；</p><p>　　2010年3月至今： RT-PCR 檢測(cè)hsp70、mtf1、actin等基因的表達(dá)水平；</p><p>　　分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果（目前該部分工作已經(jīng)接近尾聲）。 </p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p>

10、<p>　　[1] 湯宏波. 納米材料在生態(tài)環(huán)境方面的應(yīng)用及潛在危害[J]. 新材料產(chǎn)業(yè), 2008,3(2): 51-55. </p><p>　　[2] Grazyna B P, Golimowski J, Pawel L. Urban Nanoparticles: Their potential toxicity, waste and environmental management[J].

11、Waste Management, 2009, 29: 2587-2595. </p><p>　　[3] 湯洪宵. 環(huán)境納米材料及其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[J]. 水處理信息報(bào)導(dǎo), 2006, 6(3): 1-2. </p><p>　　[4] 熊道文, 李政, 方濤. 納米材料的水生態(tài)毒理學(xué)研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境污染與防治, 2009, 31(4).</p><p>　　[5

12、] 畢永紅, 胡征宇. 納米材料對(duì)環(huán)境和健康的潛在危害[J]. 上海環(huán)境科學(xué), 2006, 25(5): 214-217. </p><p>　　[6] 單志強(qiáng). 納米材料特性極其在環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用[J]. 環(huán)保材料, 2005, 2(3): 24-26.</p><p>　　[7] 李泉, 曾廣斌. 納米粒子[J]. 化學(xué)通報(bào), 1995, (6): 29.</p>&l

13、t;p>　　[8] 白偉, 張程程, 姜文君, 等. 納米材料的環(huán)境行為及其毒理學(xué)研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2009, 4(2): 174-182.</p><p>　　[9] Adams L K, Lyon D Y, Alvarezp J J. Comparative eco-toxicity of nanoscale TiO2, SiO2, and ZnO water suspensions [

14、J]. Water Research, 2006, 40(19): 3527-3532.</p><p>　　[10] Zhang Y, Chen Y, Westerhoff P , et a1. Stability of commercial metal oxide nanoparticles in water[J]. Water Research, 2008, 42: 8-9.</p><

15、p>　　[11] Chen Z, Meng H, Xing G M, et al. Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo [J]. Toxicology LeRe, 2006, 163(2): 109-120.</p><p>　　[12] 白茹, 王雯, 金星龍, 等. 納米材料生物安全性研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境與健康雜志,

16、2007, 24(1): 59-61.</p><p>　　[13] 田文靜, 白偉, 趙春祿, 等. 納米ZnO對(duì)斑馬魚(yú)胚胎抗氧化酶系統(tǒng)的影響[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2010, 30(5): 705-709</p><p>　　[14] 玉曉微, 趙占克, 韓冰, 等. 納米二氧化硅對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育毒性的初步研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2009, 4(5): 675-681.<

17、/p><p>　　[15] 但志剛, 倪瑾. PEG功能化碳納米管的制備及對(duì)斑馬魚(yú)的毒性實(shí)驗(yàn)研究[J]. 納米加工工藝, 2009, 6(1): 30-33. </p><p>　　[16] 劉信勇, 朱琳. 多壁碳納米管存在環(huán)境下Pb、Zn對(duì)斑馬魚(yú)毒性的變化[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2009, 4(6): 826-833.</p><p>　　[17] 襲著革, 林治

18、卿. 納米尺度物質(zhì)對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響極其生物安全性的研究進(jìn)展與展望[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 1(3): 203-208.</p><p>　　[18] 朱小山, 朱琳, 朗宇鵬, 等. 富勒烯及其衍生物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育毒性的比較[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2008, 28(2): 173-177. </p><p>　　[19] 朱小山, 朱琳, 朗宇鵬, 等. 人工納米材料富勒烯（C60）低

19、劑量長(zhǎng)期暴露對(duì)鯽魚(yú)的氧化傷害[J]. 環(huán)境科學(xué), 2008, 29(4): 855-860. </p><p>　　[20] Zhu S Q, Oberdorster E, Haasch M L. Toxicity of an engineered nanoparticle(fullerne, C60)in two aquatic species, daphnia and fathead minnow[J]. M

20、ar. Environ. Res. ,2006, 62(1): 5-9.</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　納米材料對(duì)水體中魚(yú)和浮游植物的毒性研究</p><p>　　摘要：納米材料的應(yīng)用前景廣闊，在其廣泛應(yīng)用的同

21、時(shí)也會(huì)對(duì)環(huán)境造成潛在的危害。納米材料釋放到環(huán)境中，對(duì)水體造成影響，從而對(duì)水體中的生物產(chǎn)生影響。本文從納米材料自身的特性，其進(jìn)入水環(huán)境后的行為以及國(guó)內(nèi)外關(guān)于納米材料對(duì)水生生物影響的研究進(jìn)行闡述，并對(duì)進(jìn)一步研究納米材料對(duì)水生生物毒性機(jī)制提出展望。</p><p>　　關(guān)鍵詞：納米材料；水生生物；毒性機(jī)制</p><p><b>　　1 引言</b></p>

22、<p>　　納米材料具有良好的應(yīng)用前景，應(yīng)用范圍廣闊，已被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，包括涂料、廢水處理、殺菌、化妝品、食品添加劑、生物醫(yī)藥等[1]。Grazyna B P等[2]等報(bào)道，2004年納米材料的年產(chǎn)量約為1000噸，每天有超過(guò)800件的產(chǎn)品生產(chǎn)基于納米材料，預(yù)計(jì)到2014年全球?qū)⒊^(guò)15%的產(chǎn)品在制造過(guò)程中使用納米材料。然而，納米材料在被廣泛應(yīng)用的同時(shí)將不可避免向環(huán)境中釋放，可能造成潛在的環(huán)境危害和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[3]。納米材

23、料進(jìn)入環(huán)境后直接或間接地對(duì)水環(huán)境造成影響，從而對(duì)水體中的生物造成影響[4]。目前，納米材料對(duì)水生生物的影響已有了相關(guān)報(bào)道，對(duì)其毒性[5]機(jī)制研究雖鮮有報(bào)道但也越來(lái)越受到重視。</p><p>　　2 納米材料的特性</p><p>　　納米材料的結(jié)構(gòu)單元尺寸介于1nm-100nm之間，其特殊的理化性質(zhì)取決于它的顆粒大小[6、7]、表面積和表面分布、化學(xué)構(gòu)成純度、結(jié)晶型、帶點(diǎn)性、表面結(jié)構(gòu)、

24、溶解性、形狀和聚集性等[4]。納米材料的尺度與基因在同一數(shù)量級(jí)，納米顆粒物可能透過(guò)細(xì)胞膜干擾DNA的排列組合，從而產(chǎn)生變異導(dǎo)致生理障礙[3]。</p><p>　　3 納米材料在水中的環(huán)境行為</p><p>　　納米材料進(jìn)入水體后，可能對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)造成破壞，白偉等[8]報(bào)道相對(duì)弱的電解質(zhì)溶液能打破富勒烯溶液的平衡，形成可沉降的聚集體，且隨著離子強(qiáng)度的增大，其在多孔介質(zhì)中的沉積更嚴(yán)重。

25、Fortner等發(fā)現(xiàn)，C60在水中形成穩(wěn)定的聚集體，在較低的離子強(qiáng)度下可穩(wěn)定存在數(shù)月。Adamslk等報(bào)道[9]，納米材料在水中的顆粒大小要比廠家提供數(shù)據(jù)大，Zhang等[9]研究得到，用超聲波分散TiO210min后顆粒的平均粒徑在200~800nm。Cheng等[11]報(bào)道富勒烯和包覆的單臂碳納米管在鹽溶液、細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)、重建硬水和Mini-Q水中穩(wěn)定。而在天然水體系中，納米材料的水體行為受到更多因素的影響，因此更復(fù)雜。白偉等[5]

26、報(bào)道，納米材料在海水和河口環(huán)境中，海洋微表層對(duì)納米材料有影響，海洋微表層中的酯類、碳水化合物、蛋白質(zhì)等可包被親脂性的納米材料，水體和海岸帶的水動(dòng)力學(xué)和形態(tài)學(xué)特征在較大程度上決定納米材料的分布，人工納米材料的研究相對(duì)較少，目前只能從已知的納米或微米顆粒的水中環(huán)境行為來(lái)推測(cè)。</p><p>　　4 納米材料對(duì)水體中魚(yú)和浮游植物的毒性研究</p><p>　　4.1 納米材料對(duì)魚(yú)的毒性研究&

27、lt;/p><p>　　納米材料進(jìn)入水體后，可能進(jìn)入細(xì)胞或一些部位，直接對(duì)魚(yú)類造成損傷。OberdÖrster研究發(fā)現(xiàn)[12]，0.5mg·L-1的C60對(duì)幼年大嘴黑鱸魚(yú)有大腦脂質(zhì)過(guò)氧化損傷影響，并且腮組織中的還原型谷胱甘肽含量降低，可能由于C60具有氧化還原活性和親脂性，由此得出C60能對(duì)水生魚(yú)類大腦造成損傷。田文靜，趙宇亮等[13]將正常斑馬魚(yú)受精卵用納米ZnO處理，預(yù)冷勻漿介質(zhì)，離心，取上清

28、液，測(cè)定蛋白含量和抗氧化指標(biāo)包括GSH、SOD、CAT、MDA，發(fā)現(xiàn)GSH含量低于對(duì)照組，SOD活性隨納米ZnO濃度的增大而降低，CAT活性低于對(duì)照組，MDR含量高于對(duì)照組，由此得出納米ZnO能對(duì)斑馬魚(yú)胚胎產(chǎn)生氧化損傷，使斑馬魚(yú)胚胎生理機(jī)能改變，不能成功孵化。玉曉微等[14]在對(duì)納米二氧化硅處理斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育毒性的研究中發(fā)現(xiàn)，常規(guī)二氧化硅對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育無(wú)明顯毒性效應(yīng)，而納米二氧化硅對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育有明顯抑制作用，可導(dǎo)致胚胎孵化率顯著降

29、低，死亡率顯著升高，幼魚(yú)有畸形現(xiàn)象，還可使斑馬魚(yú)提前孵化但不能發(fā)育完全，現(xiàn)象表明納米二氧化硅可能導(dǎo)致氧化損傷。但志剛，倪瑾用DSPE-PEG2000-NH2 超聲處理碳納米管進(jìn)行斑馬魚(yú)</p><p>　　4.2 納米材料對(duì)浮游植物的毒性研究</p><p>　　浮游植物是水環(huán)境中重要的生產(chǎn)者，在水生態(tài)系統(tǒng)中占有重要的地位。納米材料對(duì)浮游植物的毒害能直接或間接地對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，此外，

30、浮游植物對(duì)納米材料的蓄積也能直接或間接的影響水生態(tài)系統(tǒng)。Auna等[22]報(bào)導(dǎo)了納米材料對(duì)浮游植物有毒性效應(yīng)，納米C60為90mg·L-1時(shí)，對(duì)藻的生長(zhǎng)速率抑制大約為30。藻與納米C60顆粒團(tuán)聚體接觸后加速了藻細(xì)胞富集水體中的其他污染物。朱小山等[23]得到，SWC-NTs、MWCNTs和納米C60在96h 斜生柵藻生長(zhǎng)EC60分別為22.6、15.5、13.1mg·L-1，但這3種納米材料對(duì)斜生柵藻毒性沒(méi)有顯著性差

31、異。熊勤等[24]研究報(bào)道了，光照24h處理后，納米沙藻布面積為0.08cm2·L-1，懸浮液中的微囊藻、魚(yú)腥藻裸藻和衣藻的細(xì)胞密度分別下降為77.0%、69.1% 、89.1%和56.9%。而在硅藻舟型藻中，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降18.7%。</p><p><b>　　5 展望</b></p><p>　　目前，對(duì)于納米材料對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)都由于使生物

32、造成脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，從而引起細(xì)胞膜破損，最終使細(xì)胞失去正常功能而引起細(xì)胞死亡或凋亡[25]。但是，納米材料對(duì)水生生物的毒性機(jī)制研究目前還較少，尤其從分子角度研究納米材料對(duì)水生生物的影響機(jī)制還鮮有報(bào)導(dǎo)。另外，由于納米材料本生具有巨大的比表面積和高吸附能力，進(jìn)入水環(huán)境中的行為非常復(fù)雜，若只單一考慮其對(duì)水生生物的影響而忽略對(duì)水中其它污染物的影響會(huì)較片面。因此，對(duì)于納米材料對(duì)水生生物的毒性機(jī)制以及納米材料進(jìn)入水體后與水中污染物相互作用的研究還有

33、待于進(jìn)一步探索。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 湯宏波. 納米材料在生態(tài)環(huán)境方面的應(yīng)用及潛在危害[J]. 新材料產(chǎn)業(yè), 2008, 3(2): 51-55. </p><p>　　[2] Grazyna B P, Golimowski J, Pawel L. Urban Nanoparticles:

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36、t;p>　　[7] 李泉, 曾廣斌. 納米粒子[J]. 化學(xué)通報(bào), 1995, (6): 29.</p><p>　　[8] 白偉, 張程程, 姜文君, 等. 納米材料的環(huán)境行為及其毒理學(xué)研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2009, 4(2): 174-182.</p><p>　　[9] Adams L K, Lyon D Y, Alvarezp J J. Comparative

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38、icles in water[J]. Water Research, 2008, 42: 8-9.</p><p>　　[11] Chen Z, Meng H, Xing G M, et al. Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo [J]. Toxicology LeRe, 2006, 163(2): 109-120.</p

39、><p>　　[12] 白茹, 王雯, 金星龍, 等. 納米材料生物安全性研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2007, 24(1): 59-61.</p><p>　　[13] 田文靜, 白偉, 趙春祿, 等. 納米ZnO對(duì)斑馬魚(yú)胚胎抗氧化酶系統(tǒng)的影響[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2010, 30(5): 705-709.</p><p>　　[14] 玉曉微, 趙占克,

40、 韓冰, 等. 納米二氧化硅對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育毒性的初步研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2009, 4(5): 675-681.</p><p>　　[15] 但志剛, 倪瑾. PEG功能化碳納米管的制備及對(duì)斑馬魚(yú)的毒性實(shí)驗(yàn)研究[J]. 納米加工工藝, 2009, 6(1): 30-33. </p><p>　　[16] 劉信勇, 朱琳. 多壁碳納米管存在環(huán)境下Pb、Zn對(duì)斑馬魚(yú)毒性的變化[J

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42、-177. </p><p>　　[19] 朱小山, 朱琳, 朗宇鵬, 等. 人工納米材料富勒烯（C60）低劑量長(zhǎng)期暴露對(duì)鯽魚(yú)的氧化傷害[J]. 環(huán)境科學(xué), 2008, 29(4): 855-860. </p><p>　　[20] Zhu S Q, Oberdorster E, Haasch M L. Toxicity of an engineered nanoparticle(full

43、erne, C60)in two aquatic species, daphnia and fathead minnow[J]. Mar. Environ. Res. ,2006, 62(S1): 5-9.</p><p>　　[21] Bauna, Sorensensn et al. Toxicity and bioaccumulation of xenobiotic organic compounds in

44、the presence of aqueous suspensions of aggregates of nano- C60[J]. Aquatic Toxicology, 2008, 86(3).</p><p>　　[22] 張萬(wàn)忠, 劉景民, 周智敏. 納米TiO2的研究與應(yīng)用進(jìn)展[J]. 石油化工, 2007, 36(11): 1184-1189.</p><p>　　[23] 朱

45、小山, 朱琳, 田勝艷, 等.三種碳納米材料對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2008, 28(3).</p><p>　　[24] 熊勤, 劉治華, 張一卉, 等. 納米殺藻布?xì)⒃逍Ч芯縖J]. 環(huán)境科學(xué), 2006, 27(4): 715-719.</p><p>　　[25] 張婷, 唐萌. 納米顆粒吸入毒性研究進(jìn)展[J]. 衛(wèi)生研究, 2008, 37(5): 633

46、-636.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　納米Al2O3對(duì)斑馬魚(yú)肝基因表達(dá)的影響</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b

47、>　　1 引言1</b></p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)材料與方法1</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料1</p><p>　　2.1.1.實(shí)驗(yàn)用魚(yú)1</p><p>　　2.1.2 主要儀器和設(shè)備2</p><p>　　2.1.3 主要試劑2</p><p>　　

48、2.2 培養(yǎng)方法2</p><p><b>　　2.3實(shí)驗(yàn)方法2</b></p><p>　　2.3.1 染毒2</p><p>　　2.3.2 組織提取2</p><p>　　2.3.3 RNA的提取2</p><p>　　2.3.4 基因檢測(cè)3</p><p&g

49、t;　　2.3.5 數(shù)據(jù)處理3</p><p><b>　　3. 結(jié)果3</b></p><p>　　3.1 肝組織在納米Al2O3處理不同時(shí)間下總RNA的提取4</p><p>　　3.2 常規(guī)RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平4</p><p>　　3.2.1 納米Al2O3對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中hsp70基因表達(dá)的

50、影響5</p><p>　　3.2.2 納米Al2O3對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中mdr基因表達(dá)的影響5</p><p>　　3.2.3 納米Al2O3對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中nka基因表達(dá)的影響6</p><p>　　3.2.4 納米Al2O3對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中mtf1基因表達(dá)的影響7</p><p><b>　　4.討論8</b>&l

51、t;/p><p>　　4.1 納米Al2O3影響斑馬魚(yú)肝臟中hsp70基因表達(dá)的機(jī)理分析9</p><p>　　4.2 納米Al2O3影響斑馬魚(yú)肝臟中mdr基因表達(dá)的機(jī)理分析9</p><p>　　4.3 納米Al2O3影響斑馬魚(yú)肝臟中nka基因表達(dá)的機(jī)理分析9</p><p>　　4.4 納米Al2O3影響斑馬魚(yú)肝臟中mtf1基因表達(dá)的機(jī)

52、理分析9</p><p>　　5 總結(jié)和展望10</p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn):2</b></p><p>　　附錄錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p>　　摘要：納米材料的生物安全性問(wèn)題之所以受到科學(xué)家們的關(guān)注，是因?yàn)榧{米材料特殊的物理

53、化學(xué)性質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致它們?cè)谏矬w內(nèi)的生理行為與常規(guī)物質(zhì)不同，在環(huán)境中的行為也可能與常規(guī)物質(zhì)不一樣。本文應(yīng)用浸浴法研究納米Al2O3對(duì)斑馬魚(yú)肝基因熱休克蛋白70(hsp70)、多藥耐藥基因(mdr)、Na+-K+-ATPase(nka)、金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子1(mtf1)表達(dá)的影響。結(jié)果表明，經(jīng)5.6mg· L-1的納米Al2O3處理不同時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)6h的穩(wěn)定期后各基因表達(dá)量均上調(diào)，一般在12h小時(shí)達(dá)到最大值，用BioSens G

54、el Imaging System軟件對(duì)所得電泳圖進(jìn)行分析，求出各基因的相對(duì)含量，得出斑馬魚(yú)肝臟中hsp70、mdr、nka、mtf1與對(duì)照組相比存在顯著性差異（P<0.05）。</p><p>　　關(guān)鍵詞: 納米材料斑馬魚(yú)；hsp70；mdr；nka；mtf1</p><p>　　Abstract: Owing to nano-materials' special natu

55、re of physical chemistry, the security problems of nanomaterials is concerned by scientists. The physiological behavior of nanomaterials in vivo is different from conventional materials, the behavior in the environment m

56、ay be not the same as conventional materials. The effect of nano Al2O3 on heat shock protein70(hsp70), multidrug resistance(mdr), Na+-K+-ATPase (nka)and metal-responsive transcription factor-1(mtf1) of zebra fish's l

57、iver was studied </p><p>　　Keyword: Nano-materials; zebra fish; hsp70; mdr; nka; mtf11 引言</p><p>　　根據(jù)ASTM標(biāo)準(zhǔn)的定義,納米材料的結(jié)構(gòu)單元尺寸介于1nm-100nm之間，其特殊的理化性質(zhì)取決于它的顆粒大小[1,2]、表面積和表面分布、化學(xué)構(gòu)成純度、結(jié)晶型、帶點(diǎn)性、表面結(jié)構(gòu)、溶解性、形狀

58、和聚集性等[3]。自20世紀(jì)70年代問(wèn)世以來(lái),已被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，包括涂料、廢水處理、殺菌、化妝品、食品添加劑、生物醫(yī)藥等，是一類具有重要理論價(jià)值和廣闊應(yīng)用前景的新型功能材料[4,5]。</p><p>　　Grazyna等[6]等報(bào)道，2004年納米材料的年產(chǎn)量約為1000噸，每天有超過(guò)800件的產(chǎn)品生產(chǎn)基于納米材料，預(yù)計(jì)到2014年全球?qū)⒊^(guò)15%的產(chǎn)品在制造過(guò)程中使用納米材料。然而，納米材料在被廣泛應(yīng)用的

59、同時(shí)將不可避免向環(huán)境中釋放，可能造成潛在的環(huán)境危害和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[7]。但由于納米科技發(fā)展時(shí)間短，許多研究尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段，缺乏在對(duì)生物體健康效應(yīng)的研究和對(duì)生態(tài)環(huán)境效應(yīng)影響的研究。Federici等[8]研究得到，納米TiO2可在虹鱒魚(yú)的消化道和腮中積累，并轉(zhuǎn)運(yùn)到其它組織器官中，從而對(duì)水生動(dòng)物產(chǎn)生毒性作用，納米材料的粒徑大小也會(huì)對(duì)水生生物的毒性產(chǎn)生影響[9]。</p><p>　　納米氧化鋁顯白色蓬松粉末狀態(tài)，粒徑

60、20nm；比表面積≥230m2·g-1。粒度分布均勻、純度高、極好分散，其比表面高，具有耐高溫的惰性，高活性，屬活性氧化鋁；多孔性；硬度高、尺寸穩(wěn)定性好[10]，目前僅有報(bào)道表明納米A12O3粉可小鼠使血清LDH活性明顯增高[11]，而對(duì)水生動(dòng)物的效應(yīng)研究較少，更未見(jiàn)有研究納米A12O3對(duì)魚(yú)肝損傷及相關(guān)基因表達(dá)影響的報(bào)道，因此，對(duì)納米A12O3生態(tài)效應(yīng)的研究具有一定的科研價(jià)值和應(yīng)用前景。</p><p>

61、;　　斑馬魚(yú)是屬于輻鰭亞綱（Actinopterygii）鯉科（Cyprinidae）短擔(dān)尼魚(yú)屬（Danio）的一種硬骨魚(yú)，因其體側(cè)具有像斑馬一樣縱向的暗藍(lán)與銀色相間的條紋而得名。成魚(yú)體長(zhǎng)4～6 cm，孵出后約3～4個(gè)月可達(dá)性成熟，自20世紀(jì)70年代末期，國(guó)外開(kāi)始運(yùn)用斑馬魚(yú)進(jìn)行化學(xué)物的急性毒性研究，現(xiàn)在斑馬魚(yú)是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）推薦使用的標(biāo)準(zhǔn)化魚(yú)類毒性試驗(yàn)動(dòng)物之一。斑馬魚(yú)除了具有經(jīng)濟(jì)、觀賞價(jià)值外，由于個(gè)體小，生存能力強(qiáng)，遺傳背景清

62、楚，物種穩(wěn)定，繁殖力強(qiáng)，胚胎透明，易于觀察等多種優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于胚胎學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、毒理學(xué)、分子生物學(xué)等研究，具有很高的科研價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚(yú)為模型，在納米Al2O3脅迫下斑馬魚(yú)肝臟相關(guān)基因表達(dá)的影響作為評(píng)價(jià)金屬納米顆粒對(duì)水生生物的作用提供相應(yīng)的參考數(shù)據(jù)，并為進(jìn)一步研究金屬納米顆粒對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響打好基礎(chǔ)以及為“納米熱”的可行性提供科學(xué)依據(jù)。</p><

63、p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)材料與方法</b></p><p><b>　　·2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　2.1.1.實(shí)驗(yàn)用魚(yú)</p><p>　　藍(lán)斑馬魚(yú)（Danio rerio）購(gòu)買于寧波市天勝花鳥(niǎo)市場(chǎng)水族館。</p><p>　　2.1.2 主要儀器和設(shè)備<

64、/p><p>　　超凈工作臺(tái)：SW-CJ-ZFD；</p><p>　　超聲細(xì)胞粉碎機(jī)：SB-3200；上海新芝生物技術(shù)研究所</p><p>　　FR-980 生物電泳圖像分析儀：上海復(fù)日公司；</p><p>　　PCR儀：Eppendorf AG 22331；</p><p>　　臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：NEOFUGE-

65、15R；</p><p>　　新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9240A，寧波江南儀器廠；</p><p>　　自動(dòng)蒸汽高壓滅菌器：MLS-3750，寧波江南儀器廠制冰機(jī)；</p><p>　　電子分析天平：AB104-N，METTLER TOLEDO；</p><p>　　海爾冰箱：BCD-208A/C；</p><p&

66、gt;　　海爾立式冷藏柜：SC-316，青島海爾特種電冰柜有限公司冰箱；</p><p>　　超微量分光光度計(jì)：Thermo nanoDrop 1000</p><p>　　帶控溫裝置的魚(yú)缸若干、液氮罐、烘箱、充氣泵</p><p>　　2.1.3 主要試劑</p><p>　　納米Al2O3(購(gòu)于杭州大洋納米新材料有限公司)； Bizol

67、 RNA提取試劑盒(購(gòu)于上海生工），Prime ScriptR one step RT-PCR Kit Ver.2(購(gòu)于TaKaRa公司)； RNA酶抑制劑，異丙醇，氯仿，75％冰乙醇，DEPC滅菌水、KMnO4固狀粉末、去氯試劑等。</p><p><b>　　2.2 飼養(yǎng)方法</b></p><p>　　選取的斑馬魚(yú)體重為0.95±0.15ｇ，大小均勻，

68、外觀正常，體質(zhì)健壯，飼養(yǎng)在50L含有去氯水的透明魚(yú)缸中，每天按斑馬魚(yú)體重的5 %-10 %投喂斑馬魚(yú)飼料1次，每天根據(jù)魚(yú)的生長(zhǎng)狀況，相應(yīng)調(diào)節(jié)投飼量。實(shí)驗(yàn)期間不間斷充氣增氧，2-3天換水1次，換水量為1/3，水溫為（28.5±1.5）℃。</p><p><b>　　2.3實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p><b>　　2.3.1 染毒</b&g

69、t;</p><p>　　實(shí)驗(yàn)魚(yú)養(yǎng)殖8d后，隨機(jī)取出30條斑馬魚(yú)（數(shù)量因魚(yú)大小略有差異）放入一干凈的魚(yú)缸，內(nèi)含20L的去氯離子水，加入納米Al2O3粉末，終濃度為5.6mg·L-1 。</p><p>　　2.3.2 組織提取</p><p>　　經(jīng)納米Al2O3 染毒后，分別在0h、6h、12h、24h、48h、72h對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行肝組織液氮提取，每次所需

70、斑馬魚(yú)5條左右，取好后放于-40℃冰箱備用。</p><p>　　2.3.3 RNA的提取</p><p>　　(1) 組織研磨：對(duì)肝組織液氮研磨后，加入1mLBizol試劑裂解。</p><p>　　(2) 收集：將裂解液靜置30-40min后，吸入1.5mLEP管內(nèi)，然后在室溫下放置15-20min.</p><p>　　(3) 去雜：

71、將上述混合物按比例（Bizol：氯仿>5:1）加入氯仿，蓋緊管蓋，充分振蕩混勻并將其在冰上孵育15min，然后于4℃，12000r/min，離心15min。離心后混合物分為三層，RNA存在于上清層中。</p><p>　　(4) RNA的沉淀：將上清層轉(zhuǎn)移至干凈的EP管中，加入等體積冰浴的異丙醇，緩慢顛倒混勻，將樣品在-20℃下孵育20min以上，4℃，12000r/min，離心10min，RNA呈片狀沉淀

72、附著于管壁或管底；</p><p>　　(5) RNA的洗滌：棄去上清，用冰浴的75％乙醇洗滌RNA沉淀1~2次，加入1ml 75％乙醇，顛倒洗滌管壁，并漩渦振蕩樣品，盡可能讓沉淀懸浮，4℃，12000r/min，離心5min，棄去上清，晾干沉淀；</p><p>　　(6) RNA的溶解及保存：適度晾干沉淀(避免過(guò)分干燥，會(huì)降低其可溶性)，用適量無(wú)RNA酶水來(lái)溶解RNA，抽提好的RNA保

73、存于-40℃冰箱，同時(shí)加入適量RNA酶抑制劑。</p><p>　　2.3.4 基因檢測(cè)</p><p>　　(1) One step RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：</p><p>　　(2) 反應(yīng)程序設(shè)置：</p><p>　　表2 One step RT-PCR反應(yīng)條件</p><p>　　(3) β-actin、

74、mdr、hsp70、nka、mtf1基因的檢測(cè)條件：</p><p>　　表3 引物的退火溫度及循環(huán)數(shù)</p><p>　　2.3.5 數(shù)據(jù)處理</p><p>　　采用BioSens Gel Imaging System軟件將半定量圖譜轉(zhuǎn)化為定量數(shù)值，并用SPSS軟件在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間進(jìn)行差顯分析，認(rèn)為P<0.05時(shí)存在顯著性差異，P< 0.01時(shí)存

75、在極顯著差異。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　3.1 納米Al2O3處理不同時(shí)間后肝組織的總RNA</p><p>　　RNA提取的好壞是影響實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，條帶的清晰度可以用來(lái)說(shuō)明RNA的降解率，圖1為納米Al2O3處理不同時(shí)間后肝組織總RNA的電泳圖，有3條條帶，分別對(duì)應(yīng)沉降系數(shù)5.8s、18s、28s，含量

76、在982.9-1447.1ng·µL-1,其中處理0h小時(shí)和處理6小時(shí)魚(yú)肝的RNA質(zhì)量較差，說(shuō)明其在保存的過(guò)程被降解，存貯越久，降解的越厲害，雖然不以3條帶出現(xiàn)作為RNA質(zhì)量好壞的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)檫@3種RNA在細(xì)胞內(nèi)含量較多，但其清晰度較高，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)相關(guān)的其他RNA的降解率也越低，一般以O(shè)D260/OD280值作為RNA質(zhì)量的參照，越接近2.0，說(shuō)明RNA純度越高，經(jīng)過(guò)超微量分度光度計(jì)分析，OD260/OD280值在1.9

77、6-2.05之間，如表4所示，說(shuō)明提取的RNA純度較高，可以作為基因檢測(cè)的模板。</p><p>　　圖1 RNA提取條帶</p><p>　?。ㄗⅲ?-處理72h的魚(yú)肝；1-處理48h的魚(yú)肝；2-處理24h的魚(yú)肝；</p><p>　　3-處理12h的魚(yú)肝；4-處理6h的魚(yú)肝；5-處理0h的魚(yú)肝。）</p><p>　　表4 總RNA含量與

78、純度</p><p>　　3.2 常規(guī)RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平</p><p>　　β-actin，即肌動(dòng)蛋白，在各種生物組織或者細(xì)胞中其表達(dá)量較恒定，亮度之間的差異一般只與編碼該蛋白的基因數(shù)目成正比，生物學(xué)上把這類編碼基因稱為持家基因。因此往往以β-actin作為內(nèi)參，來(lái)達(dá)到消除其余基因表達(dá)的差異由原初RNA含量不同帶來(lái)的誤差。經(jīng)濃度為5.6mg·L-1納米Al2O3

79、處理不同時(shí)間后斑馬魚(yú)β-actin測(cè)定的結(jié)果，如圖2所示，處理6h與24h的比對(duì)照組測(cè)定較強(qiáng)，而另外三組12h、48h、72h均弱于對(duì)照組，說(shuō)明原初RNA量并不完全相同，計(jì)算各基因的絕對(duì)含量與相應(yīng)β-actin含量并進(jìn)行比值，求出各基因的相對(duì)含量，以排除由RNA含量的不同而導(dǎo)致的誤差。</p><p>　　圖2 β-actin基因的測(cè)定水平</p><p>　　注：M代表marker標(biāo)記；

80、1-對(duì)照組；2-處理6h肝；3-處理12h肝；</p><p>　　4-處理24h肝；5-處理48h肝；6-處理72h肝。</p><p>　　3.2.1 納米Al2O3對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中hsp70基因表達(dá)的影響</p><p>　　納米Al2O3處理不同時(shí)間得到的肝組織hsp70基因測(cè)定結(jié)果如圖3、4所示，6h內(nèi)hsp70表達(dá)量無(wú)明顯變化，12h、24h、48h、72

81、h時(shí)卻顯著增加（P<0.05）（表5），12h達(dá)到最大值，說(shuō)明斑馬魚(yú)經(jīng)納米Al2O3處理后，對(duì)hsp70基因表達(dá)有影響。</p><p>　　圖3 hsp70基因的表達(dá)水平</p><p>　　注：M代表marker標(biāo)記；1-對(duì)照組；2-處理6h肝；3-處理12h肝；</p><p>　　4-處理24h肝；5-處理48h肝；6-處理72h肝。</p>

82、;<p>　　圖4 hsp70的相對(duì)含量</p><p>　　3.2.2 納米Al2O3對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中mdr基因表達(dá)的影響</p><p>　　檢測(cè)不同時(shí)間處理后斑馬魚(yú)mdr基因（圖5），6h內(nèi)表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，12h達(dá)到最大值，以后呈逐漸下降趨勢(shì)，但整體上仍高于對(duì)照組（圖5、6）。經(jīng)納米Al2O3處理后，斑馬魚(yú)肝組織中的mdr與處理時(shí)間雖然無(wú)明顯的相關(guān)性，但與對(duì)照組都有顯著差

83、異（P<0.05）（表5）。說(shuō)明納米Al2O3可以促進(jìn)mdr基因的表達(dá)。</p><p>　　圖5 mdr基因的表達(dá)水平 </p><p>　　注：M代表marker標(biāo)記；1-對(duì)照組；2-處理6h肝；3-處理12h肝；4-處理24h肝；</p><p>　　5-處理48h肝；6-處理72h肝。</p><p>　　圖6 mdr基因

84、的相對(duì)含量</p><p>　　3.2.3 納米Al2O3對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中nka基因表達(dá)的影響</p><p>　　圖7所示為納米Al2O3處理不同時(shí)間，斑馬魚(yú)nka基因表達(dá)差異的結(jié)果。處理6h后nka基因表達(dá)能力與對(duì)照相近，處理12h時(shí)達(dá)到最大值，12h以后強(qiáng)于對(duì)照組（圖7、8），12h、48h、72h實(shí)驗(yàn)組中的nka表達(dá)量與對(duì)照組相比有顯差異（P<0.05）（表5），表明納米Al2

85、O3可以促進(jìn)nka基因表達(dá)。</p><p>　　圖7 nka基因的表達(dá)水平</p><p>　　注：M代表marker標(biāo)記；1-對(duì)照組；2-處理6h肝；3-處理12h肝；4-處理</p><p>　　24h肝；5-處理48h肝；6-處理72h肝。</p><p>　　圖8 nka基因的相對(duì)含量</p><p>　　3

86、.2.4 納米Al2O3對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中mtf1基因表達(dá)的影響</p><p>　　與對(duì)照相比，不同時(shí)間處理斑馬魚(yú)mtf1表達(dá)強(qiáng)度無(wú)明顯變化（圖9）。處理6h附近無(wú)顯著差異，其余處理時(shí)間12h、24h、48h、72h均有顯著差異（P<0.05）（表5、圖10），但與處理時(shí)間無(wú)正相關(guān)性。</p><p>　　圖9 mtf1基因的表達(dá)水平</p><p>　　注：M

87、代表marker標(biāo)記；1-對(duì)照組；2-處理6h肝；3-處理12h肝；</p><p>　　4-處理24h肝；5-處理48h肝；6-處理72h肝。</p><p>　　圖10 mtf1相對(duì)含量</p><p>　　表5 納米Al2O3處理與對(duì)照組相比肝臟中各基因顯著性差異分析</p><p>　　注：F????（????）?????；F????

88、（????）?????；?表示??h與對(duì)照相比存在顯著性差異（p<0.05）；??表示??h與</p><p>　　????????????????????對(duì)照相比存在高度顯著性差異（p<0.01）。</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　4.1 納米Al2O3影響斑馬魚(yú)肝臟中hsp70基因表達(dá)的機(jī)理分析&l

89、t;/p><p>　　熱休克蛋白70（hsp70）是指能夠穩(wěn)定另一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)想，具有高度保守的序列，并可通過(guò)有效地結(jié)合和釋放、協(xié)助多聚體的組裝或降解、新生肽的折疊延伸及細(xì)胞器蛋白的跨膜運(yùn)輸及調(diào)節(jié)、修復(fù)和降解變性的蛋白質(zhì)方面起著重要作用的一類蛋白質(zhì)家族[12]。劉迪秋[13]等報(bào)道了鯽魚(yú)肝臟hsp70在重金屬</p><p>　　Cu、Ge處理下表達(dá)均上調(diào)，hsp90在1mg·

90、L-1 Cu處理12h表達(dá)至最大值。此外，Hartl F U[14]及Schroder H[15]等報(bào)道在體外脅迫下，hsp70分子伴侶能夠起保護(hù)酶結(jié)構(gòu)的作用。在本研究中，經(jīng)過(guò)納米Al2O3處理，斑馬魚(yú)肝組織內(nèi)的hsp70基因表達(dá)量比對(duì)照均上調(diào)，在12h達(dá)到最大值，與其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，說(shuō)明納米Al2O3可能造成蛋白質(zhì)的損傷或者變性，引起跨膜運(yùn)輸及調(diào)節(jié)、修復(fù)上的紊亂，為恢復(fù)機(jī)體正常功能，hsp70基因被增強(qiáng)表達(dá)。但為了使實(shí)驗(yàn)更具有說(shuō)明力，

91、可以進(jìn)一步從與hsp70功能相關(guān)的酶活性上研究。</p><p>　　4.2 納米Al2O3影響斑馬魚(yú)肝臟中mdr基因表達(dá)的機(jī)理分析</p><p>　　多藥耐藥性基因(mdr1)是指某種耐藥細(xì)胞系對(duì)許多結(jié)構(gòu)上無(wú)關(guān)的和作用機(jī)制不同的其它藥物或化學(xué)品產(chǎn)生交叉耐藥性的一類基因。mdr1過(guò)度表達(dá)生成的P-gp(糖蛋白）是mdr產(chǎn)生的最重要原因，而在正常情況下，P-gp可以將滲入細(xì)胞內(nèi)的有害物質(zhì)排

92、出體外，減小傷害。穆寶忠[16]等對(duì)mdr進(jìn)行分子機(jī)理研究，發(fā)現(xiàn)正常組織發(fā)生腫瘤后，P-gp表達(dá)依然強(qiáng)烈，給腫瘤治愈帶來(lái)很大的難題[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)納米Al2O3處理，斑馬魚(yú)肝組織內(nèi)的mdr基因表達(dá)量比對(duì)照均上調(diào)，在12h達(dá)到最大值，說(shuō)明機(jī)體在暴露在納米材料下，隨著納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)累積到一定量，機(jī)體為了維持自身功能的有序，mdr1基因被激活，編碼過(guò)量的P-gp將納米材料排出體外，進(jìn)行保護(hù)。但為了更系統(tǒng)地闡述納米Al2O3與

93、mdr的相關(guān)性，還需從與mdr表達(dá)或代謝功能相關(guān)的酶活性上研究。</p><p>　　4.3 納米Al2O3影響斑馬魚(yú)肝臟中nka基因表達(dá)的機(jī)理分析</p><p>　　Na+-K+-ATP基因（nka）是指用于編碼Na+-K+-ATP酶的一類基因，主要功能是編碼蛋白以維持細(xì)胞膜的通透性，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的相對(duì)穩(wěn)定以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境與體外環(huán)境的滲透壓平衡，且對(duì)金屬離子具有強(qiáng)敏感性。S.F. P

94、ERRY1[18]等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用生理鹽水或140mmol·L-1 HCl處理虹鱒3h、6h、12h時(shí)，存在顯著差異（p<0.05）。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)納米材料脅迫，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境滲透壓失衡，又因nka對(duì)金屬離子均有強(qiáng)敏感性，促進(jìn)了nka的表達(dá)，說(shuō)明納米材料在一定濃度范圍內(nèi)，可以誘導(dǎo)nka基因的過(guò)量表達(dá)，以重新維持環(huán)境的穩(wěn)定，不過(guò)超過(guò)一定的濃度范圍就起抑制作用，如朱小山[19]等報(bào)告鯽魚(yú)鰓組織內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性在nC

95、60/aq 為0.20mg·L-1時(shí)被激活，而在1.0 mg·L-1時(shí)酶活性又開(kāi)始下降，說(shuō)明機(jī)體自我調(diào)節(jié)的能力有限。</p><p>　　4.4 納米Al2O3影響斑馬魚(yú)肝臟中mtf1基因表達(dá)的機(jī)理分析</p><p>　　金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子1 (mtf1)，又稱鋅指轉(zhuǎn)錄因子，能與金屬硫蛋白（MT)啟動(dòng)子的金屬感應(yīng)序列結(jié)合，調(diào)控其基因的表達(dá)，而金屬硫蛋白在基本金屬元素的調(diào)

96、節(jié)中起重要作用，并且對(duì)非基本的金屬元素有抑制和解毒作用，MT[20]通過(guò)與重金屬結(jié)合可以有效的減輕重金屬對(duì)機(jī)體的毒害，是目前臨床上最理想的生物螯合解毒劑，有研究表明[21]mtf1可被鎘激活。本研究中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)納米Al2O3處理一定時(shí)間后，mtf1基因被激活，編碼產(chǎn)物又進(jìn)一步調(diào)控金屬硫蛋白翻譯能力增強(qiáng)，產(chǎn)生大量MT以結(jié)合金屬納米鋁，中和其毒性。說(shuō)明機(jī)體將納米材料視為外源毒物加以排除，通過(guò)調(diào)控金屬硫蛋白表達(dá)產(chǎn)物與鋁金屬結(jié)合，起解毒和減輕重金

97、屬對(duì)機(jī)體的傷害。</p><p><b>　　5 總結(jié)和展望</b></p><p>　　納米材料具有良好的理化性質(zhì)，所以國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開(kāi)始普遍使用。但由于體積微小，易通過(guò)呼吸道或者</p><p>　　氣孔進(jìn)入生物體內(nèi)，也正因?yàn)椴恢榔涫欠駮?huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境帶來(lái)破壞，一系列有關(guān)納米材料的研究正在進(jìn)行中，通過(guò)本次研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的納米顆粒進(jìn)入水體后會(huì)對(duì)

98、水生生物，如斑馬魚(yú)肝組織的生長(zhǎng)代謝相關(guān)基因產(chǎn)生了不良影響，說(shuō)明超過(guò)一定濃度的納米材料能產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[22]，破壞一些生物的正常代謝，但由于本實(shí)驗(yàn)研究面不廣、涉及面不深，所以無(wú)法得出如何濃度下的納米積累會(huì)給環(huán)境帶來(lái)影響，或者納米材料的自然降解的周期，因此只能說(shuō)納米材料使用需謹(jǐn)慎。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 單志強(qiáng). 納米

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