高性能淀粉酶菌株的篩選[開題報告]

1、<p><b>　　畢業(yè)論文開題報告</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　高性能淀粉酶菌株的篩選</p><p>　　1 選題的背景和意義</p><p>　　淀粉酶是能催化淀粉和糖原水解轉化成葡萄糖、麥芽糖及其它低聚糖的一類酶的總稱，在淀粉糖工業(yè)、食

2、品工業(yè)、醫(yī)藥、紡織、洗滌劑、青貯飼料、微生態(tài)制劑以及釀酒行業(yè)中被廣泛應用。淀粉酶是最早用于工業(yè)化生產并且迄今為止仍是用途最廣、產量最大的酶制劑產品之一[1、2]。</p><p>　　不同種類的淀粉酶水解淀粉會生成不同的產物。根據淀粉酶水解淀粉的作用方式可分為α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和異淀粉酶。α-淀粉酶能隨機地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，所得產物的還原性末端葡萄糖單位碳

3、原子為α構型，同時該酶能使淀粉漿的粘度下降，又稱為液化酶；β-淀粉酶是從淀粉的非還原性末端切下一分子的麥芽糖，又被稱為糖化酶，其產物還原性末端葡萄糖單位碳原子為β構型；葡萄糖淀粉酶是從底物非還原末端依次水解α-l，4糖苷鍵和分支的α-1，6-糖苷鍵，生成葡萄糖。異淀粉酶是只水解糖原或支鏈淀粉分支點的α-1，6-糖苷鍵，切下側枝鏈[3]。</p><p>　　淀粉酶是工業(yè)中最重要的酶。如今，在生物制藥領域，它也具有

4、重要的作用。雖然淀粉酶具有很多來源，但是微生物來源的淀粉酶，特別是α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，在商業(yè)上發(fā)揮著重要的作用。由于淀粉是可以由淀粉酶水解的惟一天然物質，分離有效的微生物菌株生產對生淀粉有效性高的淀粉酶是非常理想的。應用新的耐熱性葡糖淀粉酶可以促進淀粉的水解過程，而使用α-淀粉酶可以使整個過程一步便可以完成，具有經濟效益?，F在，必須開發(fā)具有雙重功效的，如液化作用和糖化作用的微生物菌株如淀粉分解酵母。也應該開發(fā)具有有效β-淀粉酶活性的

5、菌株，β-淀粉酶可以用來生產麥芽糖漿?？梢杂棉r業(yè)和工業(yè)上的廢物作為淀粉酶生產的底物，從而降低開支，也解決了廢物的處理和污染問題。在工業(yè)上的作用，淀粉酶的耐熱性已成為非常重要的性質，因此，我們也應該努力從耐熱和極端耐熱的微生物中生產淀粉酶。另外，將淀粉酶的應用范圍拓寬如應用于生物制藥領域也具有積極的意義。</p><p>　　2 相關研究的最新成果及動態(tài) </p><p>　　2.1 α-淀

6、粉酶的催化機理</p><p>　　目前公認的α-淀粉酶的催化機理[4]，催化中心位于α/β桶狀結構的底部，261位谷氨酸和231位天冬氨酸是起催化作用的兩個重要殘基。整個催化過程可分三步：第一步，淀粉鏈中的糖苷氧被質子供體261谷氨酸質子化；第二步，親核基團231位天冬氨酸親核攻擊葡萄糖殘基的C1，糖苷鍵斷裂，葡萄糖殘基與231位天冬氨酸形成酯鍵，同時去質子化狀態(tài)的261位谷氨酸奪取一個水分子H+，產生一個OH

7、-；第三步，OH- 攻擊葡萄糖殘基的C1，使酯鍵斷裂，261位谷氨酸和231位天冬氨酸重新恢復初始狀態(tài)。在已知結構的α-淀粉酶中，在α/β桶狀結構的底部，均含有谷氨酸和天冬氨酸兩個殘基，它們的相對位置相似，并且所有α-淀粉酶的整體三維結構都很相似，因此，它們的催化反應機理應該是相同或相近的[4、5]。以對α-淀粉酶分子結構和催化機理的研究為基礎，通過各種手段改善酶的催化反應特異性，使其更適合于在工業(yè)生產中應用是近年來新興的發(fā)展趨勢。&l

8、t;/p><p>　　2.2 α-淀粉酶的突變研究</p><p>　　目前應用得最廣泛的基因水平上的突變主要有兩種，即隨機突變和定點突變，有時也將兩種方法結合使用。隨機突變首先需構建突變文庫，然后根據研究酶的特點設計高通量的篩選方法。它的優(yōu)點是不必明確知道酶的三維結構、催化機理等。定點突變需要對酶的結構機理有較明確的認識，它更適用于研究單個或多個位點對酶分子的影響。將這些方法應用于α-淀粉酶

9、的研究已有一定進展。目前有關突變的研究大多針對于地衣芽胞桿菌活菌，如Takase研究發(fā)現天冬酰胺326賴氨酸/天冬氨酸能夠顯著改變地衣芽胞桿菌活菌的pH特性。Nielsen J E等對地衣芽胞桿菌活菌進行定點突變，發(fā)現谷氨酰胺264絲氨酸和天冬酰胺190苯丙氨酸能提高地衣芽胞桿菌活菌的熱穩(wěn)定性。Shaw A 等通過隨機突變，得到Met15Thr,能增強地衣芽胞桿菌活菌的穩(wěn)定性，在此突變的基礎上進行隨機突變，發(fā)現Met15Thr和天冬酰胺

10、188絲氨酸使地衣芽胞桿菌活菌熱穩(wěn)定性提高2倍[6]。但目前就氨基酸突變如何導致酶宏觀性質的改變說法不一，還有待進一步研究。</p><p>　　2.3基因克隆及氨基酸序列</p><p>　　分子生物技術的發(fā)展，對α-淀粉酶的研究已進入分子水平階段，在α-淀粉酶的氨基酸序列分析、基因編碼及核苷酸序列分析、基因克隆和基因性狀表達等方面都取得較大的進展，基因工程技術已廣泛應用到了淀粉酶生產菌

11、株的克隆上，并且在不同微生物的α-淀粉酶基因克隆方面已經作了大量的工作，主要在大腸桿菌等。Suganum a et al. 研究了α-淀粉酶的N-端氨基酸序列。Kim et al. 描述了編碼一種新 α-淀粉酶的基因，該基因被克隆并在大腸桿菌中表達[7]。</p><p>　　Steyn 和Pretorius 編碼α-淀粉酶基因(AMY)編碼GA的基因(STA 2)轉入一個酵母菌的整合載體(Yip5)，形成重組質

12、粒pSP1和pSP2，AMY和STA 2被一同連接到載體Yip5中，產生質粒pSP3。隨后，編碼抗Geneticin 418 顯性標記的A PH 1 被克隆到pSP3 中得到pSP4。為了增強Geneticin 418的表達，pSP4再連接啟動子GAL10和終止子URA3，這樣就得到質粒pSP5。pSP5通過增加ARS1H和CEN4序列被修改成環(huán)形微染色體pSP6。轉入了pSP1-pSP6 的實驗室郎酒酵母菌株能穩(wěn)定產多種α-淀粉酶和G

13、A [7]。</p><p>　　3 課題的研究內容及擬采取的研究方法（技術路線）、難點及預期達到的目標</p><p>　　本課題希望通過對曲和其他不同來源的淀粉酶產生菌的比較，篩選獲得淀粉酶活力較高及生產性能較好的菌株1株，對其產酶條件及酶學性質進行研究。實驗具體內容包括：(1)產淀粉酶菌株的篩選；(2)產酶菌株的鑒定；(3)菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化；(4)酶學特性的研究。</p>

14、;<p>　　3.1產酶菌株的篩選流程圖（如上）</p><p><b>　　3.2菌種來源　</b></p><p>　　曲和其他不同來源的淀粉酶產生菌。</p><p><b>　　3.3培養(yǎng)基　</b></p><p>　　采用淀粉固體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。稱取牛肉膏5g、蛋白胨10g

15、、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于900mL 蒸餾水中，再加入25g瓊脂粉并攪拌至充分溶解，調pH 至中性，最后加蒸餾水定容至1000mL，高壓蒸汽滅菌[2]。</p><p><b>　　3.4初篩方法</b></p><p>　　稱取酒曲5g，倒入盛有無菌水帶玻璃珠的三角瓶中，搖床振蕩后制成土壤懸液記為10-1土壤稀釋液。用無菌移液管吸取10-1的土壤懸液0.5

16、 mL，放入4.5 mL無菌水中吹吸數次混勻即為10-2稀釋液，照此分別制成10-2～10-9的稀釋液，分別取10-7、10-8、10-9土壤稀釋液各0.5 mL，涂布于平板培養(yǎng)基表面，一個稀釋度涂布接種到數個平板，恒溫培養(yǎng)，待長出菌落后，滴加盧戈氏碘液，挑取有明顯淀粉水解圈的單菌落，進行斜面培養(yǎng)，作為初篩菌株編號保藏[8]。</p><p><b>　　3.5復篩方法</b></p&

17、gt;<p>　　把初篩出的菌株劃線到不同編號的平板培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)一段時間，長出單菌落后，選擇直徑相當的單菌落，滴加盧戈氏碘液，用游標卡尺測水解圈直徑，選取水解圈直徑相對較大的菌株作為復篩菌株即實驗菌株，進行菌種鑒定及產酶條件優(yōu)化[9]。</p><p><b>　　3.6細菌鑒定</b></p><p>　　參照《伯杰細菌鑒定手冊》,鑒定項目包括：

18、形態(tài)觀察、革蘭氏染色、芽孢染色、糖發(fā)酵、V-P試驗、淀粉水解、木糖產酸、檸檬酸鹽試驗及耐鹽性試驗等[10]。</p><p>　　3.7響應面法優(yōu)化溫淀粉酶發(fā)酵條件</p><p>　　在優(yōu)化初期利用Plackett-Burman（簡稱PB）設計法，將初始發(fā)酵培養(yǎng)基的8種成分：可溶性淀粉（X1）、尿素（X2）、K2HPO4（X3）、KH2PO4（X4）、MnSO4·H2O（X5）

19、、MgSO4·7H2O（X6）、豆粕（X7）和酵母膏（X8），分別作為PB 試驗設計的8 個因素，每個因素取2～3個水平，即低水平（-1）為初始發(fā)酵培養(yǎng)基各成分的濃度，高水平（+1）取低水平的1.5 倍?；罹孔鳛轫憫礩[11、13]。</p><p>　　根據PB試驗篩選出的對發(fā)酵液活菌含量影響顯著的因素、以各顯著因素的正負效應確定最陡爬坡試驗的路徑，快速的逼近最大響應區(qū)域。</p>

20、<p>　　Box-behnken 設計Box-behnken 設計適用于2～5個因素的優(yōu)化試驗，基于PB 試驗設計和最陡爬坡試驗的試驗結果，進行Box-Behnken設計：以PB試驗篩選得到的對發(fā)酵液活菌含量影響顯著的因素作為設計因素，以最陡爬坡試驗得出的濃度作為中心點，根據相應的試驗表進行試驗后[11]，使用SAS對試驗結果進行響應面分析[12]。</p><p><b>　　3.8酶學

21、特性研究</b></p><p><b>　　3.8.1酶活測定</b></p><p>　　淀粉酶酶活定義：1 mL酶液（或1g固體酶粉）在pH 6.0，溫度60℃，1min液化可溶性淀粉1mg所需的酶量稱為一個酶活單位（U）。測定：2 %可溶性淀粉溶液10mL，pH6.0磷酸二氫鈉—磷酸氫二鈉緩沖液2.5mL于60℃下水浴預熱5min后，加入稀釋一定倍

22、數的酶液0.5mL反應5min，用0.1mol/L的鹽酸0.5mL終止反應。取1mL反應液于5mL比色碘液中，用比色碘液做空白樣，測其660nm吸光度A660。根據A660與酶濃度C的回歸方程式計算出C。酶活力=C×稀釋倍數×16.7[14]。</p><p>　　3.8.2酶的性質分析[15]</p><p>　?。?）酶反應的最適溫度：將酶溶于pH 4.0的磷酸緩沖

23、液中，在4～100℃范圍內，不同溫度下測定酶活性，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力；</p><p>　　(2)酶反應的最適pH：將酶溶于范圍在2.6～7.6之間，不同pH的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液中，于最適反應溫度下測定酶活力。以最高酶活力為100%，計算相對酶活力；</p><p>　?。?）酶的熱穩(wěn)定性：將酶溶于pH4.0的磷酸緩沖液中，在不同溫度下處理不同時間后冷卻，分別測定酶

24、活力，以未經熱處理的酶所測得的活力為100%，計算相對酶活力；</p><p>　　（4）酶的酸穩(wěn)定性：將酶溶于范圍在2.6～7.6之間，不同pH的磷酸緩沖液中，在37 ℃下放置不同時間后，測定酶活力。以未放置于4℃下保存的酶所測得的活力為100%，計算相對酶活力;</p><p>　?。?）酶的Km 值測定：以可溶性淀粉為底物，在pH 4.0，60℃的條件下以不同濃度(S)的可溶性淀粉為

25、底物溶液,測定酶的反應速度V(以單位時間內吸光度的減少量dA/dt來表示)，以1/V21/[S]的雙倒數法作圖，計算Km值； </p><p>　　（6）金屬離子對酶活性的影響[16、17]：分別配置含有5mmol/L的不同金屬離子的等量酶液，充分混勻后，在適當溫度下下放置一段時間后，pH4.0條件下測定酶活力。以未含金屬離子的酶活力為100%,計算相對酶活力。</p><p><b

26、>　　3.9 重點難點</b></p><p>　　高活力淀粉酶菌株的篩選；淀粉酶的酶學性質研究。</p><p>　　4 論文工作進度和安排</p><p>　　2010.10.30 選題</p><p>　　2010.11.5 布置論文任務</p><

27、p>　　2010.11.5－2010.12.30 查閱文獻資料，翻譯英文文獻，完成文獻綜述和開題報告 </p><p>　　2011.1.10 文獻綜述、開題報告和翻譯文章定稿并上交</p><p>　　2010.11.5-2011.1.10 熟悉實驗室環(huán)境和基本實驗操作，準備實驗所需基本材料</p><p>　　

28、2011.4月前 在學校指定時間完成開題答辯</p><p>　　2010.11.5－2011.5.12 畢業(yè)論文實驗階段</p><p>　　2011.5.13 完成并提交畢業(yè)論文</p><p>　　2011.5 在學校指定時間進行畢業(yè)論文答辯</p><p&g

29、t;　　2011.6 完成并提交答辯后的修改論文</p><p><b>　　5 參考文獻</b></p><p>　　[1] 孫曉菲,李愛江.α-淀粉酶的應用及研究現狀.[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2008(6):13-14.</p><p>　　[2] 張雙民.土壤中淀粉酶高產菌株的分離及產酶條件的優(yōu)化.[J].土

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