高性能淀粉酶菌株的篩選[開題報(bào)告]

1、<p><b>　　畢業(yè)論文開題報(bào)告</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　高性能淀粉酶菌株的篩選</p><p>　　1 選題的背景和意義</p><p>　　淀粉酶是能催化淀粉和糖原水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其它低聚糖的一類酶的總稱，在淀粉糖工業(yè)、食

2、品工業(yè)、醫(yī)藥、紡織、洗滌劑、青貯飼料、微生態(tài)制劑以及釀酒行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。淀粉酶是最早用于工業(yè)化生產(chǎn)并且迄今為止仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一[1、2]。</p><p>　　不同種類的淀粉酶水解淀粉會(huì)生成不同的產(chǎn)物。根據(jù)淀粉酶水解淀粉的作用方式可分為α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和異淀粉酶。α-淀粉酶能隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，所得產(chǎn)物的還原性末端葡萄糖單位碳

3、原子為α構(gòu)型，同時(shí)該酶能使淀粉漿的粘度下降，又稱為液化酶；β-淀粉酶是從淀粉的非還原性末端切下一分子的麥芽糖，又被稱為糖化酶，其產(chǎn)物還原性末端葡萄糖單位碳原子為β構(gòu)型；葡萄糖淀粉酶是從底物非還原末端依次水解α-l，4糖苷鍵和分支的α-1，6-糖苷鍵，生成葡萄糖。異淀粉酶是只水解糖原或支鏈淀粉分支點(diǎn)的α-1，6-糖苷鍵，切下側(cè)枝鏈[3]。</p><p>　　淀粉酶是工業(yè)中最重要的酶。如今，在生物制藥領(lǐng)域，它也具有

4、重要的作用。雖然淀粉酶具有很多來源，但是微生物來源的淀粉酶，特別是α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，在商業(yè)上發(fā)揮著重要的作用。由于淀粉是可以由淀粉酶水解的惟一天然物質(zhì)，分離有效的微生物菌株生產(chǎn)對(duì)生淀粉有效性高的淀粉酶是非常理想的。應(yīng)用新的耐熱性葡糖淀粉酶可以促進(jìn)淀粉的水解過程，而使用α-淀粉酶可以使整個(gè)過程一步便可以完成，具有經(jīng)濟(jì)效益?，F(xiàn)在，必須開發(fā)具有雙重功效的，如液化作用和糖化作用的微生物菌株如淀粉分解酵母。也應(yīng)該開發(fā)具有有效β-淀粉酶活性的

5、菌株，β-淀粉酶可以用來生產(chǎn)麥芽糖漿?？梢杂棉r(nóng)業(yè)和工業(yè)上的廢物作為淀粉酶生產(chǎn)的底物，從而降低開支，也解決了廢物的處理和污染問題。在工業(yè)上的作用，淀粉酶的耐熱性已成為非常重要的性質(zhì)，因此，我們也應(yīng)該努力從耐熱和極端耐熱的微生物中生產(chǎn)淀粉酶。另外，將淀粉酶的應(yīng)用范圍拓寬如應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域也具有積極的意義。</p><p>　　2 相關(guān)研究的最新成果及動(dòng)態(tài) </p><p>　　2.1 α-淀

6、粉酶的催化機(jī)理</p><p>　　目前公認(rèn)的α-淀粉酶的催化機(jī)理[4]，催化中心位于α/β桶狀結(jié)構(gòu)的底部，261位谷氨酸和231位天冬氨酸是起催化作用的兩個(gè)重要?dú)埢?。整個(gè)催化過程可分三步：第一步，淀粉鏈中的糖苷氧被質(zhì)子供體261谷氨酸質(zhì)子化；第二步，親核基團(tuán)231位天冬氨酸親核攻擊葡萄糖殘基的C1，糖苷鍵斷裂，葡萄糖殘基與231位天冬氨酸形成酯鍵，同時(shí)去質(zhì)子化狀態(tài)的261位谷氨酸奪取一個(gè)水分子H+，產(chǎn)生一個(gè)OH

7、-；第三步，OH- 攻擊葡萄糖殘基的C1，使酯鍵斷裂，261位谷氨酸和231位天冬氨酸重新恢復(fù)初始狀態(tài)。在已知結(jié)構(gòu)的α-淀粉酶中，在α/β桶狀結(jié)構(gòu)的底部，均含有谷氨酸和天冬氨酸兩個(gè)殘基，它們的相對(duì)位置相似，并且所有α-淀粉酶的整體三維結(jié)構(gòu)都很相似，因此，它們的催化反應(yīng)機(jī)理應(yīng)該是相同或相近的[4、5]。以對(duì)α-淀粉酶分子結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理的研究為基礎(chǔ)，通過各種手段改善酶的催化反應(yīng)特異性，使其更適合于在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用是近年來新興的發(fā)展趨勢。&l

8、t;/p><p>　　2.2 α-淀粉酶的突變研究</p><p>　　目前應(yīng)用得最廣泛的基因水平上的突變主要有兩種，即隨機(jī)突變和定點(diǎn)突變，有時(shí)也將兩種方法結(jié)合使用。隨機(jī)突變首先需構(gòu)建突變文庫，然后根據(jù)研究酶的特點(diǎn)設(shè)計(jì)高通量的篩選方法。它的優(yōu)點(diǎn)是不必明確知道酶的三維結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理等。定點(diǎn)突變需要對(duì)酶的結(jié)構(gòu)機(jī)理有較明確的認(rèn)識(shí)，它更適用于研究單個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)對(duì)酶分子的影響。將這些方法應(yīng)用于α-淀粉酶

9、的研究已有一定進(jìn)展。目前有關(guān)突變的研究大多針對(duì)于地衣芽胞桿菌活菌，如Takase研究發(fā)現(xiàn)天冬酰胺326賴氨酸/天冬氨酸能夠顯著改變地衣芽胞桿菌活菌的pH特性。Nielsen J E等對(duì)地衣芽胞桿菌活菌進(jìn)行定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺264絲氨酸和天冬酰胺190苯丙氨酸能提高地衣芽胞桿菌活菌的熱穩(wěn)定性。Shaw A 等通過隨機(jī)突變，得到Met15Thr,能增強(qiáng)地衣芽胞桿菌活菌的穩(wěn)定性，在此突變的基礎(chǔ)上進(jìn)行隨機(jī)突變，發(fā)現(xiàn)Met15Thr和天冬酰胺

10、188絲氨酸使地衣芽胞桿菌活菌熱穩(wěn)定性提高2倍[6]。但目前就氨基酸突變?nèi)绾螌?dǎo)致酶宏觀性質(zhì)的改變說法不一，還有待進(jìn)一步研究。</p><p>　　2.3基因克隆及氨基酸序列</p><p>　　分子生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)α-淀粉酶的研究已進(jìn)入分子水平階段，在α-淀粉酶的氨基酸序列分析、基因編碼及核苷酸序列分析、基因克隆和基因性狀表達(dá)等方面都取得較大的進(jìn)展，基因工程技術(shù)已廣泛應(yīng)用到了淀粉酶生產(chǎn)菌

11、株的克隆上，并且在不同微生物的α-淀粉酶基因克隆方面已經(jīng)作了大量的工作，主要在大腸桿菌等。Suganum a et al. 研究了α-淀粉酶的N-端氨基酸序列。Kim et al. 描述了編碼一種新 α-淀粉酶的基因，該基因被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)[7]。</p><p>　　Steyn 和Pretorius 編碼α-淀粉酶基因(AMY)編碼GA的基因(STA 2)轉(zhuǎn)入一個(gè)酵母菌的整合載體(Yip5)，形成重組質(zhì)

12、粒pSP1和pSP2，AMY和STA 2被一同連接到載體Yip5中，產(chǎn)生質(zhì)粒pSP3。隨后，編碼抗Geneticin 418 顯性標(biāo)記的A PH 1 被克隆到pSP3 中得到pSP4。為了增強(qiáng)Geneticin 418的表達(dá)，pSP4再連接啟動(dòng)子GAL10和終止子URA3，這樣就得到質(zhì)粒pSP5。pSP5通過增加ARS1H和CEN4序列被修改成環(huán)形微染色體pSP6。轉(zhuǎn)入了pSP1-pSP6 的實(shí)驗(yàn)室郎酒酵母菌株能穩(wěn)定產(chǎn)多種α-淀粉酶和G

13、A [7]。</p><p>　　3 課題的研究內(nèi)容及擬采取的研究方法（技術(shù)路線）、難點(diǎn)及預(yù)期達(dá)到的目標(biāo)</p><p>　　本課題希望通過對(duì)曲和其他不同來源的淀粉酶產(chǎn)生菌的比較，篩選獲得淀粉酶活力較高及生產(chǎn)性能較好的菌株1株，對(duì)其產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)具體內(nèi)容包括：(1)產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選；(2)產(chǎn)酶菌株的鑒定；(3)菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化；(4)酶學(xué)特性的研究。</p>

14、;<p>　　3.1產(chǎn)酶菌株的篩選流程圖（如上）</p><p><b>　　3.2菌種來源　</b></p><p>　　曲和其他不同來源的淀粉酶產(chǎn)生菌。</p><p><b>　　3.3培養(yǎng)基　</b></p><p>　　采用淀粉固體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。稱取牛肉膏5g、蛋白胨10g

15、、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于900mL 蒸餾水中，再加入25g瓊脂粉并攪拌至充分溶解，調(diào)pH 至中性，最后加蒸餾水定容至1000mL，高壓蒸汽滅菌[2]。</p><p><b>　　3.4初篩方法</b></p><p>　　稱取酒曲5g，倒入盛有無菌水帶玻璃珠的三角瓶中，搖床振蕩后制成土壤懸液記為10-1土壤稀釋液。用無菌移液管吸取10-1的土壤懸液0.5

16、 mL，放入4.5 mL無菌水中吹吸數(shù)次混勻即為10-2稀釋液，照此分別制成10-2～10-9的稀釋液，分別取10-7、10-8、10-9土壤稀釋液各0.5 mL，涂布于平板培養(yǎng)基表面，一個(gè)稀釋度涂布接種到數(shù)個(gè)平板，恒溫培養(yǎng)，待長出菌落后，滴加盧戈氏碘液，挑取有明顯淀粉水解圈的單菌落，進(jìn)行斜面培養(yǎng)，作為初篩菌株編號(hào)保藏[8]。</p><p><b>　　3.5復(fù)篩方法</b></p&

17、gt;<p>　　把初篩出的菌株劃線到不同編號(hào)的平板培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)一段時(shí)間，長出單菌落后，選擇直徑相當(dāng)?shù)膯尉洌渭颖R戈氏碘液，用游標(biāo)卡尺測水解圈直徑，選取水解圈直徑相對(duì)較大的菌株作為復(fù)篩菌株即實(shí)驗(yàn)菌株，進(jìn)行菌種鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[9]。</p><p><b>　　3.6細(xì)菌鑒定</b></p><p>　　參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》,鑒定項(xiàng)目包括：

18、形態(tài)觀察、革蘭氏染色、芽孢染色、糖發(fā)酵、V-P試驗(yàn)、淀粉水解、木糖產(chǎn)酸、檸檬酸鹽試驗(yàn)及耐鹽性試驗(yàn)等[10]。</p><p>　　3.7響應(yīng)面法優(yōu)化溫淀粉酶發(fā)酵條件</p><p>　　在優(yōu)化初期利用Plackett-Burman（簡稱PB）設(shè)計(jì)法，將初始發(fā)酵培養(yǎng)基的8種成分：可溶性淀粉（X1）、尿素（X2）、K2HPO4（X3）、KH2PO4（X4）、MnSO4·H2O（X5）

19、、MgSO4·7H2O（X6）、豆粕（X7）和酵母膏（X8），分別作為PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的8 個(gè)因素，每個(gè)因素取2～3個(gè)水平，即低水平（-1）為初始發(fā)酵培養(yǎng)基各成分的濃度，高水平（+1）取低水平的1.5 倍?；罹孔鳛轫憫?yīng)值Y[11、13]。</p><p>　　根據(jù)PB試驗(yàn)篩選出的對(duì)發(fā)酵液活菌含量影響顯著的因素、以各顯著因素的正負(fù)效應(yīng)確定最陡爬坡試驗(yàn)的路徑，快速的逼近最大響應(yīng)區(qū)域。</p>

20、<p>　　Box-behnken 設(shè)計(jì)Box-behnken 設(shè)計(jì)適用于2～5個(gè)因素的優(yōu)化試驗(yàn)，基于PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和最陡爬坡試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)：以PB試驗(yàn)篩選得到的對(duì)發(fā)酵液活菌含量影響顯著的因素作為設(shè)計(jì)因素，以最陡爬坡試驗(yàn)得出的濃度作為中心點(diǎn)，根據(jù)相應(yīng)的試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)后[11]，使用SAS對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析[12]。</p><p><b>　　3.8酶學(xué)

21、特性研究</b></p><p><b>　　3.8.1酶活測定</b></p><p>　　淀粉酶酶活定義：1 mL酶液（或1g固體酶粉）在pH 6.0，溫度60℃，1min液化可溶性淀粉1mg所需的酶量稱為一個(gè)酶活單位（U）。測定：2 %可溶性淀粉溶液10mL，pH6.0磷酸二氫鈉—磷酸氫二鈉緩沖液2.5mL于60℃下水浴預(yù)熱5min后，加入稀釋一定倍

22、數(shù)的酶液0.5mL反應(yīng)5min，用0.1mol/L的鹽酸0.5mL終止反應(yīng)。取1mL反應(yīng)液于5mL比色碘液中，用比色碘液做空白樣，測其660nm吸光度A660。根據(jù)A660與酶濃度C的回歸方程式計(jì)算出C。酶活力=C×稀釋倍數(shù)×16.7[14]。</p><p>　　3.8.2酶的性質(zhì)分析[15]</p><p>　?。?）酶反應(yīng)的最適溫度：將酶溶于pH 4.0的磷酸緩沖

23、液中，在4～100℃范圍內(nèi)，不同溫度下測定酶活性，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力；</p><p>　　(2)酶反應(yīng)的最適pH：將酶溶于范圍在2.6～7.6之間，不同pH的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液中，于最適反應(yīng)溫度下測定酶活力。以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力；</p><p>　?。?）酶的熱穩(wěn)定性：將酶溶于pH4.0的磷酸緩沖液中，在不同溫度下處理不同時(shí)間后冷卻，分別測定酶

24、活力，以未經(jīng)熱處理的酶所測得的活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力；</p><p>　?。?）酶的酸穩(wěn)定性：將酶溶于范圍在2.6～7.6之間，不同pH的磷酸緩沖液中，在37 ℃下放置不同時(shí)間后，測定酶活力。以未放置于4℃下保存的酶所測得的活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力;</p><p>　?。?）酶的Km 值測定：以可溶性淀粉為底物，在pH 4.0，60℃的條件下以不同濃度(S)的可溶性淀粉為

25、底物溶液,測定酶的反應(yīng)速度V(以單位時(shí)間內(nèi)吸光度的減少量dA/dt來表示)，以1/V21/[S]的雙倒數(shù)法作圖，計(jì)算Km值； </p><p>　?。?）金屬離子對(duì)酶活性的影響[16、17]：分別配置含有5mmol/L的不同金屬離子的等量酶液，充分混勻后，在適當(dāng)溫度下下放置一段時(shí)間后，pH4.0條件下測定酶活力。以未含金屬離子的酶活力為100%,計(jì)算相對(duì)酶活力。</p><p><b

26、>　　3.9 重點(diǎn)難點(diǎn)</b></p><p>　　高活力淀粉酶菌株的篩選；淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究。</p><p>　　4 論文工作進(jìn)度和安排</p><p>　　2010.10.30 選題</p><p>　　2010.11.5 布置論文任務(wù)</p><

27、p>　　2010.11.5－2010.12.30 查閱文獻(xiàn)資料，翻譯英文文獻(xiàn)，完成文獻(xiàn)綜述和開題報(bào)告 </p><p>　　2011.1.10 文獻(xiàn)綜述、開題報(bào)告和翻譯文章定稿并上交</p><p>　　2010.11.5-2011.1.10 熟悉實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和基本實(shí)驗(yàn)操作，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需基本材料</p><p>　　

28、2011.4月前 在學(xué)校指定時(shí)間完成開題答辯</p><p>　　2010.11.5－2011.5.12 畢業(yè)論文實(shí)驗(yàn)階段</p><p>　　2011.5.13 完成并提交畢業(yè)論文</p><p>　　2011.5 在學(xué)校指定時(shí)間進(jìn)行畢業(yè)論文答辯</p><p&g

29、t;　　2011.6 完成并提交答辯后的修改論文</p><p><b>　　5 參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 孫曉菲,李愛江.α-淀粉酶的應(yīng)用及研究現(xiàn)狀.[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2008(6):13-14.</p><p>　　[2] 張雙民.土壤中淀粉酶高產(chǎn)菌株的分離及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化.[J].土

30、壤肥料,2006(2):59-60.</p><p>　　[3] 顏守保.產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶菌株的篩選,發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)研究.[D].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2007</p><p>　　[4] Sivaramakrisshan S,Gangadharan D,Nampoothiri K M,et al.α-Amylase from microbial sources-an overview on

31、 recent development. Food Technol. Biotechnol[J].2006, 44 (2) ,173-184</p><p>　　[5] N ielsen J E, Borchert T V. Protein engineering of bacterial alpha-amylases [J].Biochim Biophys Acta, 2000,1543(2):253-274&

32、lt;/p><p>　　[6] 王楠,馬榮山.耐高溫α-淀粉酶的研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2007(3)</p><p>　　[7] 胡欣潔,鄧斌,胡承. 微生物α-淀粉酶的研究進(jìn)展[J].中國防偽,2005(9):59-60</p><p>　　[8]魏群.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（第二版）[M].北京:高等教育出版社,2007.</p><p&g

33、t;　　[9]陳均輝,李俊,張?zhí)?等.生物化學(xué)試驗(yàn)（第四版）[M].北京:科學(xué)出版社,2008.</p><p>　　[10]伯杰細(xì)菌鑒定手冊（第八版）[M].北京:科學(xué)出版社,1984.</p><p>　　[11]陳雄,袁金,鳳王志,等.響應(yīng)面法優(yōu)化地衣芽孢桿菌A2發(fā)酵培養(yǎng)基[J].中國飼料,2009, 7:17-20</p><p>　　[12]歐宏宇,賈士

34、.SAS軟件在微生物培養(yǎng)優(yōu)化中的應(yīng)用[J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,1:</p><p>　　[13]茆軍,張志東,王瑋,等.響應(yīng)面法優(yōu)化低溫淀粉酶發(fā)酵條件研究[J].生物技術(shù), 2008,18 (4):83-86</p><p>　　[14]蔣若天,盧濤,宋航.一株α-高溫淀粉酶的地衣芽孢桿菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].現(xiàn)代食品科技,2006,22(4):52-56</p>

35、<p>　　[15]李勃,黨永,馬瑜,等.黑曲霉Tx-278耐酸性α-淀粉酶的分離純化及其性質(zhì)研究[J].微生物學(xué)雜志,2008,28(4):30-34.</p><p>　　[16]Rezahi S, Hosseinnim K K.A Ca2＋independentα-amylase that is active and stable at low pH from the Bacillus sp1