產(chǎn)淀粉酶菌株鑒定及酶的制備[開題報(bào)告]

1、<p><b>　　畢業(yè)論文開題報(bào)告</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　產(chǎn)淀粉酶菌株鑒定及酶的制備</p><p>　　1 選題的背景和意義</p><p>　　淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的統(tǒng)稱，是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制

2、劑品種。它是最重要的工業(yè)用酶之一，廣泛應(yīng)用于各種淀粉轉(zhuǎn)化為糖漿，以環(huán)糊精為產(chǎn)品的制藥行業(yè)，這些酶約占全球酶產(chǎn)量的30％。除動物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外兩大來源是植物和微生物，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的主要是微生物淀粉酶。淀粉酶不僅可以簡化液化、糖化過程，降低淀粉深加工的生產(chǎn)成本，還可用于麥芽糖漿的生產(chǎn)、開發(fā)新型助消化劑以及工業(yè)廢液處理等多個領(lǐng)域，包括淀粉酶、異構(gòu)酶、果膠酶和纖維素酶等糖酶所占的市場份額約為40％。而食品

3、和飲料行業(yè)利用90％的糖酶進(jìn)行生產(chǎn)，因此淀粉酶具有巨大的應(yīng)用前景。隨著社會需求的增大，工業(yè)生產(chǎn)對α-淀粉酶的需求量越來越大，其在各領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，急需具更高活性的淀粉酶制劑。</p><p>　　生物發(fā)酵法生產(chǎn)淀粉酶只是解決了“豐產(chǎn)”的問題，但要最大限度地創(chuàng)造出物質(zhì)財(cái)富，必須還要從下游分離工程（酶的分離純化）解決“豐收”的問題。通常處理的發(fā)酵液或酶反應(yīng)液中淀粉酶的濃度一般很低，提取時所耗費(fèi)的能量就很大，費(fèi)用也就很高

4、，同時淀粉酶是生化活性物質(zhì)，易受環(huán)境因素如溫度、pH、金屬離子和微生物等的影響，甚至失活，而在很多情況下，特別是醫(yī)藥產(chǎn)品和作為生物試劑用的產(chǎn)品，其最終產(chǎn)品的純度要求很高，有些產(chǎn)品要求是有一定保存期的穩(wěn)定的無色晶體。因此，下游工程往往要比其他生產(chǎn)過程需要更多的設(shè)備，耗用更多的能源及操作費(fèi)用。酶的分離純化常在整個用發(fā)酵法生產(chǎn)酶產(chǎn)品的生產(chǎn)成本上占主要部分，如果終產(chǎn)物純度要求相當(dāng)高時更是如此。對于傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)來說，其分離和提純所占費(fèi)用約為總投資

5、的60%，而對于基因工程菌的發(fā)酵，甚至達(dá)到整個生產(chǎn)投資的80%-90%。所以認(rèn)真地研究和優(yōu)化發(fā)酵液中淀粉酶的分離純化工藝對工業(yè)降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益至關(guān)重要。</p><p>　　2 相關(guān)研究的最新成果及動態(tài) </p><p>　　2.1 產(chǎn)淀粉酶菌株的研究</p><p>　　淀粉酶是由植物、動物和微生物產(chǎn)生的。微生物來源，即真菌和細(xì)菌淀粉酶，鑒于其成本低、穩(wěn)

6、定、用時少、生產(chǎn)空間省和便于工藝改造和優(yōu)化等優(yōu)點(diǎn)在工業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。芽孢桿菌被廣泛用于耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)。如枯草芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌和淀粉液化芽孢桿菌均能很好地生產(chǎn)α-淀粉酶，同時已被廣泛用于各種應(yīng)用酶的商業(yè)生產(chǎn)。曲霉屬于真菌，也是最常用的α-淀粉酶的生產(chǎn)菌之一。但隨著各行業(yè)對淀粉酶的需求不斷加大，且需要性能更穩(wěn)定酶活更高或具適應(yīng)生產(chǎn)的新特征的酶。因此，現(xiàn)研究重點(diǎn)放在了篩選耐酸性或熱穩(wěn)定性強(qiáng)的高產(chǎn)淀粉酶產(chǎn)生

7、菌上。運(yùn)用基因工程、酶工程的手段，將不同的真菌和細(xì)菌來源的α-淀粉酶基因使用合適的載體已被克隆到適當(dāng)?shù)氖荏w生物體中，使其得到高表達(dá)或研究新特征。如在地衣芽孢桿菌中，將Asn172、His156和分別突變成Arg、Tyr和Thr，使α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性提高了5倍。</p><p>　　2.2 淀粉酶分離純化方法的研究</p><p>　　高純度α-淀粉酶是一種重要的水解淀粉類酶制劑，可用于研

8、究酶反應(yīng)機(jī)理和測定生化反應(yīng)平衡常數(shù)等。分離純化α-淀粉酶的方法很多，一般都是依據(jù)酶分子的大小、形狀、電荷性質(zhì)、溶解度、穩(wěn)定性、專一性結(jié)合位點(diǎn)等性質(zhì)建立的。要得到高純度的α-淀粉酶，往往需要將各種方法聯(lián)合使用。</p><p>　　鹽析沉淀、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水作用層析、親和層析和電泳等，是蛋白質(zhì)分離純化的主要方法。用吸附樹脂法、40%乙醇從α-淀粉酶發(fā)酵液中分離高活性α-淀粉酶，用離子交換法和透析法對

9、初酶液進(jìn)行脫鹽處理，最后用DEAE－纖維素純化α－淀粉酶，所得酶活力為60153U/g，酶活性回收率為66.04%。另通過乙醇沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析等方式，從白曲霉菌A. kawachii的米曲粗抽出液中，分離純化到兩個耐酸性α-淀粉酶比活性極高的組分。用疏水吸附法和DEAE-cellulose(二乙氨基乙基-纖維素)柱層析法分離純化α-淀粉酶，所得酶活力為110 000 U/g。用硫酸銨沉淀和垂直板制備凝膠電泳對地衣芽孢桿菌

10、A. 4041耐高溫α-淀粉酶進(jìn)行分離純化，得到3種電泳均一的組分。通過超濾、濃縮、脫鹽和聚丙烯酰胺垂直板凝膠電泳，對利用基因工程菌生產(chǎn)的重組超耐熱耐酸性α-淀粉酶進(jìn)行純化，得到電泳純級的超耐熱耐酸性α-淀粉酶，純化倍數(shù)為11. 7，活力回收率為29. 8%。但上述方法存在的共同問題是，連續(xù)操作和規(guī)模放大都比較困難。</p><p>　　雙水相技術(shù)具有處理容量大、能耗低、易連續(xù)化操作和工程放大等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用雙水相系

11、統(tǒng)PEG/磷酸鹽分離純化α-淀粉酶，增加PEG濃度有助于酶富集上相。同樣用PEG/磷酸鹽雙水相體系從發(fā)酵液中直接萃取分離低溫α-淀粉酶，分配系數(shù)及回收率分別為4. 8和87%。PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和硫酸銨對酶活力具有保護(hù)作用，利用PVP/硫酸銨液-固萃取體系分離提取耐高溫α-淀粉酶，酶活力回收率高，體系成相時間短，操作時不需雙水相體系所用的分液漏斗和離心操作，用傾液法即可實(shí)現(xiàn)相分離，因此，與雙水相體系相比，液-固萃取體系具有更大的優(yōu)

12、越性。</p><p>　　3 課題的研究內(nèi)容及擬采取的研究方法（技術(shù)路線）、難點(diǎn)及預(yù)期達(dá)到的目標(biāo)</p><p><b>　　3.1 研究內(nèi)容</b></p><p>　　1）產(chǎn)淀粉酶的菌株鑒定；</p><p><b>　　2）淀粉酶的發(fā)酵；</b></p><p>　　

13、3）發(fā)酵液中淀粉酶的分離純化工藝優(yōu)化。</p><p>　　3.2 研究方案（技術(shù)路線）</p><p>　　3.2.1 菌種鑒定</p><p>　　將保存的未知產(chǎn)淀粉酶菌株進(jìn)行平板接種培養(yǎng)使其復(fù)活，根據(jù)菌種鑒定手冊等文獻(xiàn)對復(fù)活的菌株進(jìn)行相關(guān)生理生化實(shí)驗(yàn)，鑒定項(xiàng)目包括形態(tài)觀察、革蘭氏染色、芽孢染色、糖發(fā)酵、V-P試驗(yàn)、淀粉水解、木糖產(chǎn)酸、檸檬酸鹽試驗(yàn)及耐鹽性試驗(yàn)等

14、，考察其分類地位。再采用CTAB法提取基因組DNA，并以此為模板進(jìn)行16SrDNA序列的PCR擴(kuò)增。將測序結(jié)果用Blast軟件在GenBank中進(jìn)行同源性比較，采用MEGA 4.0 軟件中相鄰連接方法(Neighbor Joining Method)獲得系統(tǒng)進(jìn)化樹，最終確定目的菌的屬種。</p><p>　　3.2.2 淀粉酶發(fā)酵</p><p>　　確定菌株屬種后，參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)淀粉酶發(fā)酵

15、出發(fā)培養(yǎng)基，可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，MgSO4?7H2O 1g，KH2PO4 4g，(NH4)2SO4 2g,NaCl 4g,蒸餾水1000mL, pH自然，培養(yǎng)基在121℃滅菌20min，進(jìn)行液體發(fā)酵。</p><p>　　3.2.3 淀粉酶的分離純化</p><p>　　發(fā)酵液離心除去菌體后收集上清液，即為粗酶液，用（NH4）2SO4鹽析沉淀或乙醇沉淀等初步分離方法去除粗酶液中的

16、部分雜蛋白，然后利用DEAE-纖維素離子交換柱、凝膠層析等方法進(jìn)行精制，并將所收集的酶液凍干制備酶粉。以上各步驟測定酶活力和回收率。</p><p>　　酶活測定：淀粉酶酶活定義，1 mL酶液（或1g固體酶粉）在pH 6.0，溫度60℃，1min液化可溶性淀粉1mg所需的酶量稱為一個酶活單位（U）。測定：準(zhǔn)確吸取酶液1.00mL，用少量磷酸緩沖液（pH=6.0）溶解，配制n倍稀釋倍數(shù)的酶液。吸取20.00mL的2

17、%可溶性淀粉溶液于試管中，加入磷酸緩沖液5.00mL，搖勻后，置于60℃恒溫水浴中預(yù)熱8min。加入1.00mL稀釋好的待測酶液，立即記時，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)5min。待反應(yīng)5min后立即吸取1.00mL的反應(yīng)液，加到預(yù)先盛有的0.5mL的0.1mol/LHCl和5.00mL的稀碘液的試管中，搖勻，并以0.5mL的鹽酸溶液和5.00mL的稀碘液為空白，于660nm下，用10mm比色皿迅速測定其吸光度（A）。酶活力的計(jì)算公式：X1= C &#

18、215;n，其 中：X1為樣品的酶活力，U/mL；C為測試樣液溶度，U/mL；n為稀釋倍數(shù)。根據(jù)各步的酶活力和回收率綜合考慮確定優(yōu)化工藝。</p><p><b>　　技術(shù)路線</b></p><p><b>　　3.3 研究難點(diǎn)</b></p><p>　　從相關(guān)文獻(xiàn)資料來看，對淀粉酶分離純化工藝進(jìn)行工藝優(yōu)化是一項(xiàng)困難的

19、工作。發(fā)酵一次，收集到的淀粉酶本就不多，且很容易在純化過程中受到污染而失去活性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果受到影響。并且，不同批次發(fā)酵收集到的酶液受發(fā)酵液等因素影響，分離效果可能都不相同。</p><p><b>　　3.4 預(yù)期目標(biāo)</b></p><p>　　通過利用生理生化手段和分子生物學(xué)手段，對產(chǎn)淀粉酶菌株進(jìn)行分類鑒定，獲得其種屬學(xué)名；并建立起較為經(jīng)濟(jì)高效的淀粉酶分離純化工

20、藝路線。</p><p>　　4 論文工作進(jìn)度和安排</p><p>　　2010.10.30 選題</p><p>　　2010.11.5 布置論文任務(wù)</p><p>　　2010.11.5－2010.12.30 查閱文獻(xiàn)資料，翻譯英文文獻(xiàn)，完成文獻(xiàn)綜述和開題報(bào)告 </

21、p><p>　　2011.1.10 文獻(xiàn)綜述、開題報(bào)告和翻譯文章定稿并上交</p><p>　　2010.11.5-2011.1.10 熟悉實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和基本實(shí)驗(yàn)操作，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需基本材料</p><p>　　2011.4月前 在學(xué)校指定時間完成開題答辯</p><p>　　2010.1

22、1.5－2011.5.12 畢業(yè)論文實(shí)驗(yàn)階段</p><p>　　2011.5.13 完成并提交畢業(yè)論文</p><p>　　2011.5 在學(xué)校指定時間進(jìn)行畢業(yè)論文答辯</p><p>　　2011.6 完成并提交答辯后的修改論文</p><p

23、><b>　　5 參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1 ] Sivaramakrisshan S, Gangadharan D, Nampoothiri K M, et al. α-Amylase from microbial sources-an overview on recent development. Food Technol. Biotechnol[J].2006,

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