類整合素蛋白與微管蛋白在植物響應(yīng)滲透脅迫中的作用.pdf

1、整合素蛋白是動物細(xì)胞粘附分子的重要成員，屬于一類跨膜蛋白的超家族，由α-亞基和β-亞基通過非共價鍵連接而成。它的胞外域能識別并結(jié)合各種含有RGD短肽序列的胞外基質(zhì)分子，而在胞內(nèi)域連接細(xì)胞骨架和信號分子，從而構(gòu)成了胞外基質(zhì)—質(zhì)膜—細(xì)胞骨架連續(xù)體，成為了動物細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵分子之一，在細(xì)胞的運(yùn)動、增殖、分化和凋亡等方面起著重要的作用。近年來的研究表明：胞外基質(zhì)-質(zhì)膜-細(xì)胞骨架連續(xù)體是所有真核細(xì)胞所共有的一種結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)中的聯(lián)結(jié)

2、分子在植物、真菌和動物細(xì)胞中可能是相同或類似的。但對植物細(xì)胞內(nèi)是否存在連接細(xì)胞壁組分與細(xì)胞骨架的分子，如存在，該類分子的特性又是怎樣的還知之甚少。有證據(jù)表明在植物細(xì)胞的質(zhì)膜上存在類似動物細(xì)胞整合素的蛋白。 干旱等逆境引起的滲透脅迫是影響植物生長發(fā)育的主要因素之一。闡明植物對滲透脅迫的響應(yīng)機(jī)制，增強(qiáng)植物的抗性具有重要的意義。滲透脅迫導(dǎo)致植物細(xì)胞產(chǎn)生質(zhì)壁分離，而細(xì)胞壁與質(zhì)膜間的粘附結(jié)構(gòu)對于維持植物細(xì)胞正常的生理功能至關(guān)重要，特別是在

3、對滲透脅迫的反應(yīng)過程中。作為細(xì)胞壁-質(zhì)膜-細(xì)胞骨架連續(xù)體的重要分子，質(zhì)膜上類似于動物細(xì)胞整合素蛋白分子以及與細(xì)胞骨架間的相互作用很可能參與了滲透脅迫所誘導(dǎo)的許多生理生化響應(yīng)過程。 本試驗(yàn)以擬南芥(Arabidopsisthaliana，Columbia生態(tài)型)葉片懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和玉米(ZeamaizeL.)幼苗為試驗(yàn)材料，綜合利用分子生物學(xué)、植物生理學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)，研究了植物細(xì)胞細(xì)胞壁與質(zhì)膜間的相互作用、類整合素和

4、微管蛋白的功能、細(xì)胞學(xué)定位以及編碼類整合素蛋白和微管蛋白基因的克隆與轉(zhuǎn)化，同時研究了類整合素蛋白、細(xì)胞骨架及兩者的相互作用在滲透脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞合成ABA中的作用，為進(jìn)一步深入研究植物細(xì)胞壁-質(zhì)膜-細(xì)胞骨架連續(xù)體在滲透脅迫信號傳導(dǎo)過程中的作用提供一些理論依據(jù)。主要結(jié)果如下： 1、應(yīng)用差速離心和密度梯度離心分離純化細(xì)胞不同部分(膜部分和可溶性部分)，結(jié)合WesternBlotting技術(shù)分析了相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，在擬南芥懸浮細(xì)胞

5、和玉米幼苗根尖細(xì)胞的不溶性部分存在與人整合素β1亞基抗體特異反應(yīng)的蛋白質(zhì)帶，其分子量分別在110kDa和80kDa。用人整合素β1亞基抗體作探針，采用間接免疫熒光定位的方法，在擬南芥懸浮細(xì)胞的細(xì)胞膜和玉米幼苗根尖細(xì)胞的細(xì)胞膜與核中均檢測到了類整合素蛋白的存在。 2、等滲條件下，正常細(xì)胞的質(zhì)膜與細(xì)胞壁是粘連在一起的，沒有明顯的分界線，在滲透濃度為722mmol/kg的改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h的細(xì)胞發(fā)生了局部的質(zhì)壁分離，質(zhì)壁分離的程度與

6、細(xì)胞所處的滲透濃度和處理時間密切相關(guān)。當(dāng)RGD(胞外基質(zhì)與質(zhì)膜上的整合素蛋白特異結(jié)合的阻斷劑)預(yù)處理細(xì)胞后再進(jìn)行脅迫處理，細(xì)胞則發(fā)生了完全的質(zhì)壁分離，而用RGD類似物(不含RGD結(jié)構(gòu)域)處理則不發(fā)生質(zhì)壁分離，說明類整合素蛋白介導(dǎo)了細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的粘連作用。 3、利用擬南芥懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體及胞外基質(zhì)與整合素蛋白特異結(jié)合的阻斷劑RGD及其類似物研究了細(xì)胞壁和/或細(xì)胞壁-質(zhì)膜間的相互作用在滲透脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞合成ABA中的作用。結(jié)果

7、表明，滲透脅迫處理顯著促進(jìn)了細(xì)胞和原生質(zhì)體內(nèi)ABA的積累，但原生質(zhì)體內(nèi)ABA的積累量顯著低于細(xì)胞內(nèi)ABA的積累；RGD處理顯著降低了滲透脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ABA的積累，但對原生質(zhì)體內(nèi)ABA的積累無影響；而用RGD類似物處理則對滲透脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞和原生質(zhì)體內(nèi)ABA的積累無影響。說明細(xì)胞壁和/或細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的相互作用在擬南芥懸浮細(xì)胞響應(yīng)滲透脅迫和滲透脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞合成ABA過程中起著重要作用。 4、采用間接免疫標(biāo)記熒光的方法對擬南芥

8、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和玉米根細(xì)胞中類整合素蛋白和α-微管蛋白進(jìn)行了熒光共定位，同時研究了類整合素蛋白和α-微管蛋白相關(guān)的作用物對類整合素蛋白與細(xì)胞骨架蛋白之間可能的相互作用。結(jié)果表明：在伸長的玉米根細(xì)胞中，微管蛋白排列與細(xì)胞的縱軸成一定角度，并彼此平行排列；而在擬南芥懸浮細(xì)胞中周質(zhì)微管呈網(wǎng)格狀均勻而無一定方向分布。類整合素和細(xì)胞骨架蛋白相關(guān)試劑的處理試驗(yàn)表明：RGD肽在阻斷植物細(xì)胞壁與細(xì)胞膜間的粘附作用的同時，也間接影響了微管與質(zhì)膜的連接。微管

9、解聚劑—秋水仙堿和AlCl3以及微管穩(wěn)定劑—紫杉醇改變了細(xì)胞中微管蛋白的結(jié)構(gòu)，但不影響類整合素蛋白在質(zhì)膜上的排列與分布。而微絲解聚劑——細(xì)胞松弛素D除間接使微管蛋白變得松散外，也使質(zhì)膜上類整合素蛋白的標(biāo)記熒光變得彌散和暗淡。表明類整合素蛋白在質(zhì)膜上的分布與排列受微絲排列變化的影響要高于受微管排列的影響。 5、采用RT-PCR和TA克隆或TOPO克隆的方法從野生型擬南芥(Col)中克隆出了At14a基因，并將此基因序列與35S-啟

10、動子和報(bào)告基因(GFP)相融合構(gòu)建過表達(dá)載體后，再通過原生質(zhì)體瞬時表達(dá)技術(shù)研究了At14a蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)和定位。同時通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了At14a基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株和懸浮細(xì)胞系。結(jié)果表明，At14a-GFP融合蛋白在原生質(zhì)體中表達(dá)強(qiáng)度很高，在細(xì)胞水平，其表達(dá)主要在質(zhì)膜部分，而在根器官水平主要在根尖表達(dá)。這些結(jié)果為深入探討該基因的功能，尤其是在植物響應(yīng)滲透脅迫中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。 6、按TOPO克隆的方法克

11、隆出編碼α-微管蛋白的基因(TUA2)，同時獲得了轉(zhuǎn)過表達(dá)TUA2-GFP融合基因的擬南芥植株和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系。轉(zhuǎn)基因植株中TUA2-GFP融合蛋白主要在根部表達(dá)，而細(xì)胞水平主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。這些結(jié)果為研究微管蛋白和類整合素蛋白間的相互作用和微管蛋白本身的功能創(chuàng)造了條件。 7、以15％PEG溶液對玉米幼苗根系分別處理不同時間(0h、12h、24h、48h)，結(jié)合熒光定位技術(shù)研究了滲透脅迫對微管蛋白排列的影響。結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)胞受

12、到滲透脅迫后，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成了更多的周質(zhì)微管，說明微管蛋白在植物細(xì)胞響應(yīng)干旱脅迫過程中起重要作用。 8、RT-PCR的結(jié)果表明，PEG處理的玉米根系細(xì)胞中Vp14基因的表達(dá)量明顯增加；紫杉醇處理和紫杉醇預(yù)處理后再用PEG處理也使Vp14表達(dá)量較對照有所增加；而先用PEG處理后再用紫杉醇處理，Vp14表達(dá)量增加更為顯著。用黃草消和PEG共處理也得出了類似的結(jié)果。對細(xì)胞內(nèi)ABA含量分析結(jié)果表明，與對照相比，PEG處理24h的玉米根細(xì)

13、胞中內(nèi)源ABA含量增加了3倍，單獨(dú)紫杉醇處理和紫杉醇預(yù)處理后再用PEG模擬干旱處理都使細(xì)胞內(nèi)ABA含量上升了1-2倍，而先用PEG處理再用紫杉醇處理則使玉米根細(xì)胞內(nèi)ABA含量比對照增加了6-7倍。說明微管骨架參與了干旱脅迫誘導(dǎo)ABA合成過程，且無論是解聚還是穩(wěn)定，只要改變微管的動態(tài)平衡就能導(dǎo)致細(xì)胞合成ABA。微管骨架動態(tài)平衡的改變很可能是通過調(diào)節(jié)ABA合成過程中關(guān)鍵酶——NCED的基因(Vp14)表達(dá)量的變化來影響ABA的合成過程。

14、 綜上所述，根據(jù)本研究的結(jié)果可以達(dá)到以下結(jié)論：(1)植物細(xì)胞中存在類似于動物細(xì)胞的整合素蛋白分子(稱為類整合素蛋白)，類整合素蛋白參與了細(xì)胞壁與質(zhì)膜的相互作用；(2)細(xì)胞壁和/細(xì)胞壁與細(xì)胞膜間的相互作用參與了細(xì)胞對滲透脅迫的感知以及滲透脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞合成ABA的過程，這一過程在很大程度上是通過改變與ABA合成相關(guān)酶基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的；(3)微管蛋白也參與了細(xì)胞對滲透脅迫的響應(yīng)過程；(4)植物細(xì)胞內(nèi)存在細(xì)胞壁-質(zhì)膜-細(xì)胞骨架連續(xù)體系，而且