樁蛋白家族成員Leupaxin在整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附中的作用.pdf

1、研究目的：
　　探討樁蛋白家族成員Leupaxin與整合素alpha4（α4integrin）之間的相互作用關(guān)系，證實(shí)兩者在體內(nèi)特異性結(jié)合，找出其結(jié)合位點(diǎn)，并通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明對(duì)細(xì)胞的粘附和遷移有著重要作用。
　　研究方法：
　　1.構(gòu)建pcDNA3.1（-）α4 integrin重組質(zhì)粒并將其與GFP-Leupaxin（GFP-LPXN）重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，構(gòu)建過表達(dá)兩種蛋白模型，并做免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明兩者在體內(nèi)

2、特異性結(jié)合；
　　2.共轉(zhuǎn)染His-Myc-α4 integrin重組質(zhì)粒與分別敲除總LD區(qū)、LD1、LD2、LD3及LD4的GFP-LPXN重組質(zhì)粒，檢測(cè)其表達(dá)與結(jié)合情況，探索兩種蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。
　　3.在Jurkat E6細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GFP-LPXN、GFP-LPXN-△LD3及GFP-vector，并給予纖維粘連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）刺激，通過粘附實(shí)驗(yàn)觀察其粘附情況。
　　4.在Jurkat E6細(xì)

3、胞中轉(zhuǎn)染GFP-LPXN、GFP-LPXN-△LD3及GFP-vector，通過Transwell實(shí)驗(yàn)觀察其遷移情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.His-Myc-α4 integrin重組質(zhì)粒成功構(gòu)建并表達(dá)，共轉(zhuǎn)染后，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)Leupaxin與α4 integrin特異性結(jié)合；
　　2.共轉(zhuǎn)染α4 integrin與完整的LPXN及分別敲除LD1/2/3/4區(qū)的GFP-LPXN，蛋白成功表達(dá)，且敲除LD3區(qū)及總

4、LD區(qū)的Leupaxin無法與α4 integrin發(fā)生特異性結(jié)合，證明兩者結(jié)合位點(diǎn)即為L(zhǎng)D3。
　　3.粘附實(shí)驗(yàn)證實(shí)，相對(duì)于轉(zhuǎn)染完整的GFP-LPXN的Jurkat細(xì)胞，轉(zhuǎn)染GFP-LPXN-△LD3的細(xì)胞粘附率明顯下降；Transwell實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染GFP-LPXN-△LD3細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力出現(xiàn)明顯增強(qiáng)，發(fā)生遷移的細(xì)胞增多。
　　結(jié)論：
　　樁蛋白家族成員 Leupaxin與整合素α4 integrin可發(fā)生特異性結(jié)