和營(yíng)安心方對(duì)慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

1、<p>　　和營(yíng)安心方對(duì)慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響</p><p>　　作者：李永民，王保和 邢立強(qiáng)，薄愛華， 吳迎爽，周寧</p><p>　　【摘要】 　　目的觀察和營(yíng)安心方對(duì)慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法以皮下大量注射異丙腎上腺素（ISO）的方法制備慢性心衰大鼠模型，隨機(jī)分為模型對(duì)照組，卡托普利組，參麥注射液組，和營(yíng)安心大、中、小劑量組。另設(shè)正常對(duì)照組，用TUN

2、EL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，用免疫組化方法檢測(cè)心肌細(xì)胞Bax，Bcl2蛋白表達(dá)，計(jì)算Bcl2/Bax比值。結(jié)果模型對(duì)照組TUNEL法心肌細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，棕褐色細(xì)胞核明顯增多，免疫組化圖像分析Bax表達(dá)明顯升高，Bcl2，Bcl2/Bax比值明顯下降。與模型對(duì)照組比較，和營(yíng)安心方組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，Bax蛋白表達(dá)明顯下降，Bcl2，Bcl2/Bax比值明顯升高。結(jié)論和營(yíng)安心方有減抑慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用。 </

3、p><p>　　【關(guān)鍵詞】 和營(yíng)安心方； 心力衰竭； 細(xì)胞凋亡； 血流動(dòng)力學(xué)</p><p>　　Abstract：ObjectiveTo study the effects of Heyingansxin Fang on myocardial apoptosis in chronic congestive heart failure rats.MethodsAnimal model of

4、 heart failure was induced by subcutaneously injecting large dose of ISO and the rats were randomly divided into model group， captopril group，Shenmai injection group， high dosage of Heyinganxin Fang， middle dosage of He

5、yinganxin Fang ， small dosage of Heyinganxin Fang and normal group. Apoptosis was detected with TUNEL .The Bax and Bcl-2 proteins of</p><p>　　Key words：Heyinganxin Fang; Congestive heart failure; Apoptos

6、is; Hemodynamics</p><p>　　慢性心衰屬于虛勞“心損”的范疇，《難經(jīng)》認(rèn)為“損其心者，調(diào)其營(yíng)衛(wèi)”，我們宗《難經(jīng)》之旨，確立了“調(diào)和營(yíng)衛(wèi)、化淤利水”的慢性心衰治則，組成和營(yíng)安心方。本實(shí)驗(yàn)觀察了和營(yíng)安心方對(duì)慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>　　1.1

7、 材料雄性Wistar大鼠70只，體重200～240 g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；和營(yíng)安心方由西洋參6 g，玉竹15 g，云茯苓15 g，桂枝15 g，丹參20 g等組成，中劑量組水煎濃縮為1∶1煎液（每毫升含生藥1 g）、大劑量組為1∶2煎液（每毫升含生藥2 g）、小劑量組為2∶1煎液（每毫升含生藥0.5 g），藥物購(gòu)自北京同仁堂藥店；鹽酸異丙腎上腺素注射液，2 ml∶1 mg/支，上海禾豐制藥有限公司；卡托普利，25 mg/片，常州

8、制藥廠有限公司；參麥注射液，10 ml/支，河北神威藥業(yè)有限公司；MK1020原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，武漢博士德生物工程公司；Bax，Bcl-2一抗，二步法TV6001免疫組化檢測(cè)試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)公司。</p><p>　　1.2 方法 在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上［1，2］，略加改進(jìn)并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，采取皮下多點(diǎn)注射異丙腎上腺素（ISO）的方法，第1天按20 mg/kg，第2天按10 mg/kg，第3～12天

9、按5 mg/kg的劑量連續(xù)皮下給藥，另取11只大鼠為正常對(duì)照組，皮下注射等量蒸餾水。造模結(jié)束后隨機(jī)取2只正常大鼠、5只造模大鼠測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，兩組指標(biāo)差異明顯，確認(rèn)模型制備成功。造模大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組，參麥注射液組，卡托普利組，和營(yíng)安心大、中、小劑量組，每組9只。以人與大鼠體表面積等效劑量比折算量為和營(yíng)安心中劑量組，擴(kuò)大兩倍為大劑量組，縮小兩倍為小劑量組，每次灌胃0.8 ml/100 g，1 次/d；卡托普利組配成0.45%蒸餾

10、水溶液，每次灌服1 ml/100 g；正常對(duì)照組及模型對(duì)照組灌服蒸餾水1 ml/100g；參麥注射液組每天按5 ml/kg腹腔注射參麥注射液；連續(xù)給藥4周。</p><p>　　1.3 觀測(cè)指標(biāo) </p><p>　　1.3.1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大鼠腹腔注射20%烏拉坦麻醉（1 ml/100 g），游離右側(cè)頸總動(dòng)脈并插入自制的心室插管（充滿1%肝素），通過左側(cè)動(dòng)脈瓣和房室瓣

11、進(jìn)入左心室，用多導(dǎo)生理記錄及分析系統(tǒng)描記記錄左室內(nèi)壓峰值（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室內(nèi)壓上升、下降最大速率（±dp/dtmax）。</p><p>　　1.3.2 心重指數(shù)開胸提起心臟，按相同位置剪斷肺靜脈、肺動(dòng)脈、主動(dòng)脈和上下腔靜脈，取出心臟，分析天平稱取心臟重量，計(jì)算心重指數(shù)（心重mg/體重g）。</p><p>　　1.3.3 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞

12、凋亡［3］縱向剪開左心室，從乳頭肌處橫切0.3 cm×0.5 cm的心肌標(biāo)本，置于10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，按照試劑盒說(shuō)明嚴(yán)格進(jìn)行操作，用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，以細(xì)胞核染成棕褐色為陽(yáng)性結(jié)果，每組每個(gè)心肌標(biāo)本各取1張切片，每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野（400×），計(jì)算各組每高倍視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。</p><p>　　1.3.4 心肌Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)

13、及Bcl-2/Bax比值按照二步法TV6001免疫組化試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，每組每個(gè)心肌標(biāo)本連續(xù)切片，Bax，Bcl-2染色各取1張切片，棕褐色陽(yáng)性顆粒主要表達(dá)于細(xì)胞漿，采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，攝取400×圖像輸入分析系統(tǒng)內(nèi)，測(cè)定各組圖像的平均灰度值，每張切片于陽(yáng)性區(qū)選擇5個(gè)無(wú)重疊視野，以灰度值大小作為待測(cè)蛋白的陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)，并計(jì)算Bcl-2/Bax比值。</p><p>　　1.4 統(tǒng)

14、計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，應(yīng)用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用單因素方差分析進(jìn)行組間比較。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 和營(yíng)安心方對(duì)血流動(dòng)力學(xué)、心重指數(shù)的影響結(jié)果見表1。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組LVEDP明顯升高，LVSP，±dp/dtmax明顯降低，心重指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P&a

15、mp;lt;0.01）；與模型對(duì)照組比較，和營(yíng)安心方大、中劑量組LVEDP明顯降低，LVSP，±dp/dtmax明顯升高，心重指數(shù)降低，治療效果接近卡托普利組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P&lt;0.01或P&lt;0.05），說(shuō)明和營(yíng)安心方對(duì)慢性心衰血流動(dòng)力學(xué)、心重指數(shù)有良好改善作用。</p><p>　　表1 和營(yíng)安心方對(duì)血流動(dòng)力學(xué)、心重指數(shù)的影響（略） </p><

16、p>　　與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01　</p><p>　　2.2 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果正常對(duì)照組大鼠心肌未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡，模型對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，凋亡細(xì)胞呈孤立、散在分布，數(shù)明顯增多，核內(nèi)有分布均勻的棕褐色顆粒，體積等于或小于正常胞核，每20×20視野平均3.9個(gè)；和營(yíng)安心大劑量組、卡托普利組每高倍視野

17、平均1.5個(gè)、1.8個(gè)，棕褐色細(xì)胞核數(shù)量較少；和營(yíng)安心中劑量組、小劑量組、參麥注射液組每高倍視野平均2.3，2.9，2.7個(gè)，棕褐色細(xì)胞核仍較多見?？梢?，各治療組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯低于模型對(duì)照組，和營(yíng)安心大劑量組、卡托普利組改善慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的效果最好。</p><p>　　2.3 和營(yíng)安心方對(duì)Bax，Bcl-2，Bcl-2/Bax的影響結(jié)果見表2。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠Bax蛋白表達(dá)明顯升

18、高，Bcl-2/Bax比值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P&lt;0.01）；和營(yíng)安心大、中劑量組、卡托普利組與模型對(duì)照組比較，Bcl-2蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax比值明顯升高，Bax蛋白表達(dá)明顯下降（P&lt;0.01或P&lt;0.05）。</p><p>　　表2 和營(yíng)安心方對(duì)Bax，Bcl-2 ，Bcl-2/Bax的影響（略） </p><p>　　與正常

19、對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01　；n=8　</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　《難經(jīng)》認(rèn)為“損其心者，調(diào)其營(yíng)衛(wèi)”，《內(nèi)經(jīng)》在闡述“營(yíng)衛(wèi)致病”時(shí)提出了“營(yíng)氣衰少而衛(wèi)氣內(nèi)伐”，和“營(yíng)氣稽留，血澀不行，衛(wèi)氣從之”的病機(jī)，我們據(jù)此提出了慢性心衰的中醫(yī)病機(jī)假說(shuō)為“營(yíng)衛(wèi)不和，營(yíng)澀衛(wèi)

20、伐，淤結(jié)水?！?，并擬定和營(yíng)安心方，由西洋參、玉竹、桂枝、云茯苓、丹參等組成。西洋參、玉竹益氣生津，充養(yǎng)營(yíng)氣，益營(yíng)和陰；桂枝、云茯苓、丹參疏衛(wèi)通陽(yáng)，活血化淤，寧心利水。全方補(bǔ)氣生津，益營(yíng)通衛(wèi)，調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，活血利水?，F(xiàn)代藥理研究表明，西洋參所含主要成分人參皂苷Rb1，玉竹所含主要成分鈴蘭苷、鈴蘭苦苷有良好的強(qiáng)心作用，而方中所含桂皮醛、丹參素、丹參酮等主要有效成分對(duì)慢性心衰也有良好調(diào)節(jié)作用［4］。本實(shí)驗(yàn)采取皮下注射ISO的方法復(fù)制慢性心衰大鼠模

21、型，ISO連續(xù)12 d皮下注射總量達(dá)到80 mg/kg，兒茶酚胺大量入血、持續(xù)刺激造成心肌彌漫性急性壞死［2］，模型對(duì)照組大鼠LVSP，±dp/dtmax明顯降低，LVEDP，心重指數(shù)明顯升高，表明左心舒縮功能明顯受損，并出現(xiàn)心室肥大，和營(yíng)安心方大、中劑量組能明顯升高LVSP，±dp/dtmax，明顯降低LVEDP、心重指數(shù)，對(duì)心功能、心室肥大有良好改善作用。</p><p>　　細(xì)胞凋亡是遺

22、傳基因控制的細(xì)胞自主性死亡過程，是機(jī)體清除嚴(yán)重受損的細(xì)胞、不再需要的細(xì)胞和癌變細(xì)胞的自身防御性機(jī)制，包括Bcl2家族蛋白的調(diào)控和胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶的激活等機(jī)制。在Bcl2家族蛋白中，Bcl2，Mcl1以及Bclxl均對(duì)細(xì)胞的生存起著促進(jìn)作用，即抑制細(xì)胞凋亡；而Bax，Bclxs，bak和bad則促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，即誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl2 protooncogene是一個(gè)抑制凋亡的原癌基因，Bax protoonc

23、ogene是一個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的原癌基因，Bax與Bcl2結(jié)合，阻止Bcl2的激活，從而促進(jìn)凋亡。Bax、Bcl2是調(diào)控心肌細(xì)胞的關(guān)鍵凋亡基因，兩者的比例決定心肌細(xì)胞在受到凋亡刺激后是死亡還是存活。慢性心衰時(shí)存在廣泛的心肌細(xì)胞凋亡，其中Bax基因表達(dá)顯著升高，Bcl2基因表達(dá)及bcl2 /Bax比值明顯下降，細(xì)胞凋亡使心肌細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、纖維化增生，導(dǎo)致心室重構(gòu)。而神經(jīng)內(nèi)分泌激素的持續(xù)異常激活是引起細(xì)胞凋亡的重要

24、因素，細(xì)胞凋亡是引起心肌死亡乃至心肌重構(gòu)的重要原因，也是心功能下降的主要原因［5］。而細(xì)胞凋亡的特征是核內(nèi)D</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　?。?］ 沈 雁，曹洪欣，周景華. 溫心膠囊對(duì)慢性心功能不全大鼠心功能和心肌基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物1表達(dá)的研究［J］. 上海中醫(yī)藥雜志，2005，39（5）：55.</p>

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