轉(zhuǎn)Bcl-2水稻抗氧化脅迫及水稻邊緣細(xì)胞發(fā)育調(diào)控的研究.pdf

1、逆境脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素，嚴(yán)重影響著農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。利用基因工程手段提高農(nóng)作物的抗逆性已成為作物遺傳改良的重要內(nèi)容之一。本研究以水稻為材料，初步分析基于細(xì)胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)和根邊緣細(xì)胞(RootBorder Cell，RBC)發(fā)育的抗逆機(jī)制。
　　 1.Bcl-2基因在水稻抗H202脅迫中的作用及其分子機(jī)制
　　 植物細(xì)胞程序性死亡是指在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育或?qū)ν饨?/p>

2、刺激的反應(yīng)過(guò)程中受自身基因編碼、主動(dòng)、有序的細(xì)胞死亡過(guò)程。研究顯示，在植物中異源表達(dá)動(dòng)物的抗凋亡基因能抑制PCD，從而提高植物對(duì)生物和非生物脅迫的抗性。但相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制還知之甚少。
　　 本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，將人類的抗凋亡基因Bcl-2導(dǎo)入水稻中花11(Oryza sativa L.subsp. Japonica)，獲得5個(gè)水稻35S::Bcl-2純合轉(zhuǎn)基因株系，Northem blot檢測(cè)表明各株系中Bcl-

3、2均有不同程度的表達(dá)。在H202脅迫下，轉(zhuǎn)基因水稻的種子萌發(fā)率(Seeds germination)、葉片葉綠素保有率(Chlorophyll retention)，根伸長(zhǎng)量(Rootelongation)和根尖活性(Root tip viability)比野生型顯著提高，表明抗凋亡基因Bcl-2的異源表達(dá)能提高水稻抗氧化脅迫的能力。
　　 DNA laddering和TUNEL的檢測(cè)結(jié)果顯示，在20 rrrM H202脅迫下，

4、野生型水稻出現(xiàn)明顯的細(xì)胞程序性死亡，具有明顯的DNA laddering和TUNEL熒光信號(hào)，相對(duì)于野生型，轉(zhuǎn)Bcl-2基因水稻中的DNA laddering和TUNEL信號(hào)明顯減弱。表明Bcl-2的異源表達(dá)能抑制H2O2誘導(dǎo)的PCD發(fā)生，從而提高水稻的抗氧化脅迫能力。
　　 為了進(jìn)一步探索其分子機(jī)理是否與液泡途徑有關(guān)，首先通過(guò)序列比對(duì)和功能結(jié)構(gòu)域分析，預(yù)測(cè)了水稻中存在4個(gè)液泡加工酶(Vacuolar Processing En

5、zyme， VPE)同源基因，分別為OsOlg37910(Os VPE-1)、 Os02943010(Os VPE-2)、 Os04945470(Os VPE-3、Os05951570(Os VPE-4；7個(gè)metacaspases同源基因，分別為OsOlg58580(OsMC-1)、Os03927170(OsMC-2)、Os03927190(OsMC-3)，Os03927210(OsMC-4)、Os05941660(ClsMC-5)、

6、Os05941670(OsMC-6)、Osllg04010(Os MC-7)，它們的酶促反應(yīng)底物結(jié)合位點(diǎn)保守殘基與動(dòng)物Caspase在結(jié)構(gòu)上具有高度的同源性。然后用20 mM H2O2處理野生型水稻中花11，通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)不同處理時(shí)間后Os VPEs和Os MCs的表達(dá)量，觀察到OsVPE-1的表達(dá)量在處理6、8、12和24 h時(shí)均顯著上調(diào)，Os VPE-2的表達(dá)在處理2h后被顯著上調(diào)，并持續(xù)至12 h，到24 h后，其表達(dá)

7、量又恢復(fù)到未處理對(duì)照組水平。而其他的Os VPEs和Os MCs的表達(dá)量沒(méi)有顯著變化，認(rèn)為H2O2誘導(dǎo)的水稻PCD可能是通過(guò)液泡途徑(主要是Os VPE-1和 OsVPE-2)執(zhí)行的。進(jìn)一步比較實(shí)驗(yàn)表明，在20 mM H2O2脅迫處理?xiàng)l件下，35S:: Bcl-2轉(zhuǎn)基因水稻幼苗中的Os VPE-1和Os VPE-2表達(dá)量無(wú)顯著變化，而野生型中的Os VPE-1和Os VPE-2表達(dá)被明顯上調(diào)。推測(cè)Bct-2的作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)VPE的表

8、達(dá)來(lái)抑制H2O2脅迫誘導(dǎo)的PCD產(chǎn)生，從而提高水稻對(duì)氧化脅迫的耐受性。
　　 2.水稻根邊緣細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控
　　 植物根邊緣細(xì)胞是由根冠細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，具有活性的一群細(xì)胞，其發(fā)育受遺傳調(diào)控，且在多種逆境中發(fā)揮生物學(xué)功能.對(duì)其發(fā)育調(diào)控和生物學(xué)功能的研究已倍受關(guān)注。但是對(duì)水稻根邊緣細(xì)胞的數(shù)目、活性、發(fā)生規(guī)律以及根邊緣細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的研究尚少。
　　 本研究觀察水稻根邊緣細(xì)胞的發(fā)生，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目和檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果顯示

9、，在水稻根形成的同時(shí)就已有邊緣細(xì)胞產(chǎn)生，每個(gè)水稻根尖的邊緣細(xì)胞數(shù)目達(dá)到1500個(gè)左右時(shí)，邊緣細(xì)胞停止產(chǎn)生，邊緣細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)其活性達(dá)到95％，在離體條件下培養(yǎng)能保持48 h。當(dāng)移去邊緣細(xì)胞后，在36 h內(nèi)水稻根尖又能產(chǎn)生一套完整的1500個(gè)左右的邊緣細(xì)胞。用不同濃度的BR(油菜素內(nèi)酯)、 GA3(赤霉素)、IAA(吲哚乙酸)和KT(激動(dòng)素)處理水稻種子，發(fā)現(xiàn)這些植物激素在某一特定濃度時(shí)能促使水稻根尖產(chǎn)生更多邊緣細(xì)胞，最高可達(dá)到2100～25

10、00個(gè)細(xì)胞/根，是正常水平的140％～167％。表明邊緣細(xì)胞的產(chǎn)生和發(fā)育可能受到多個(gè)激素協(xié)同調(diào)控，和根冠的細(xì)胞分裂能力密切相關(guān)。
　　 同時(shí)，檢測(cè)了水稻發(fā)芽過(guò)程不同時(shí)間的根尖果膠甲基酯酶(Pectin Methylesterase，PME)活性，結(jié)果表明，PME活性隨根的伸長(zhǎng)而增強(qiáng)。在根長(zhǎng)5 mm時(shí)，活性達(dá)到最高值。隨后，PME活性逐漸下降，最后維持在一個(gè)較低活性水平。但當(dāng)水稻根尖的整套邊緣細(xì)胞移去后，根冠PME活性又迅速上升，

11、到12 h時(shí)達(dá)到最高值，之后下降，表明水稻根邊緣細(xì)胞的發(fā)生和根尖果膠甲基酯酶的活性密切相關(guān)。因此，本研究克隆了水稻果膠甲基酯酶基因OsPME-1(Os0490458900).序列分析表明，該基因編碼568個(gè)氨基酸，含有兩個(gè)保守的功能結(jié)構(gòu)域PMEI domain和PME domain。并且，通過(guò)半定量RT PCR分析，發(fā)現(xiàn)OsPME-1在邊緣細(xì)胞產(chǎn)生和發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化與PME活性的變化一致，說(shuō)明克隆的水稻OsPME-1和邊緣細(xì)胞的產(chǎn)生

12、和發(fā)育可能存在密切的聯(lián)系。
　　 為了進(jìn)一步研究OsPME-1基因在根邊緣細(xì)胞產(chǎn)生和發(fā)育過(guò)程中的作用，構(gòu)建了4個(gè)含有OsPME-1不同結(jié)構(gòu)域的植物表達(dá)載體pCAMBIA13011-OsPME-1(含Os PME-1全序列)，pCAMBIA1301l-OsPME-2(含OsPME-l反義序列)，pCAMBIA13011.OsPME-3(含PMEIdomain)和pCAMBIA13011-OsPME-4(含PME domain).并