抗hbs mab的研制及其對(duì)野生與免疫逃逸變異 hbsag的交叉反應(yīng)特征

1、<p>　　抗HBs mAb的研制及其對(duì)野生與免疫逃逸變異 HBsAg的交叉反應(yīng)特征</p><p>　　作者：李方和, 張小燕, 嚴(yán)兵△, 張波, 黃永國, 張春燕, 龔勁松, 陳妍, 劉靜華</p><p>　　【摘要】 　　目的: 抗HBs G6 mAb制備及其對(duì)重組野生與免疫逃逸變異HBsAg結(jié)合能力與特點(diǎn)的評(píng)價(jià)。方法: 常規(guī)制備并純化抗HBs mAb, 以純化抗HBs

2、 mAb IgG包被, 采用ELISA對(duì)17種野生及“a”決定簇替代性變異全基因重組表達(dá)HBsAg進(jìn)行檢測, 并與幾種市售HBsAg檢測試劑進(jìn)行比較。結(jié)果: 該雜交瘤細(xì)胞生長與分泌特性穩(wěn)定, 其培養(yǎng)上清與腹水效價(jià)分別為2048及4096×103; 對(duì)野生HBsAg檢測（ELISA）敏感性不低于0.125 μg/L。該抗體可與15種變異抗原中12種發(fā)生反應(yīng)（P/N≥2.5）, 反應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度分別為低反應(yīng)組（2份, 與野生株A值比較

3、, 下同）平均7.55%; 中反應(yīng)組（1例）為59.40%; 高反應(yīng)組（9種）分別為野生株的92.1%～109.4%, 低反應(yīng)或無反應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的免疫逃逸變異部位集中在HBV“a”決定簇I環(huán)的起始部即120～124序列之間。部分表達(dá)產(chǎn)物采用市售試劑作同步檢測, 平均顯色強(qiáng)度高于或明顯高于幾種國內(nèi)應(yīng)用最為普遍的HBsAg ELISA（P&lt;0.05 )。結(jié)論: 抗HBs G6 mAb對(duì)多數(shù)免疫逃逸變異</p>&l

4、t;p>　　【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒 基因變異 HBsAg 免疫逃逸 ELISA</p><p>　　[Abstract] AIM: To prepare monoclonal antibodies against HBsAg and estimate its binding capacity to both wildtype and varies of immune escape mutantty

5、pe HBsAg. METHODS: Using selfmade the antiHBs G6 mAb and HRPlabeled goat antiHBs antibody, A sandwich ELISA for detection both wildtype and varies of immune escape mutanttype HBsAg has been developed. Applying thi

6、s assay, to detect 17 species of whole gene wildtype and recombination expressed HBsAg which varied in “a” determinant. to eva</p><p>　　[Keywords]HBV; gene variation; HBsAg; immune escape; ELISA</p>

7、<p>　　乙型肝炎病毒感染流行范圍廣, 感染人數(shù)多, 是目前全球最為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。該病毒的DNA多聚酶缺乏校對(duì)功能, 較其他病毒更易形成遺傳變異, 一旦變異發(fā)生在某些特定基因區(qū)段（如S基因“a”決定簇）, 即可引起所表達(dá)蛋白（HBsAg）的抗原性發(fā)生漂移或明顯漂移, 從而形成HBV免疫逃逸變異株（hepatitis B virus immune escape mutant strain, HBV IEMS）。由于這

8、類變異病毒在體內(nèi)不能為針對(duì)野生HBV的保護(hù)性免疫中和, 在體外其HBsAg不能為多數(shù)現(xiàn)行市售試劑所檢出, 其存在勢必造成部分HBV感染者臨床診斷困惑, 獻(xiàn)血員篩查漏檢, 及其血清流行病學(xué)調(diào)查失真, 已受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[2, 3]。作者所在單位自上世紀(jì)末即高度關(guān)注這一現(xiàn)象, 并為此進(jìn)行大量的研究。新近又獲得一株能與多數(shù)免疫逃逸變異（IEM）HBsAg有極強(qiáng)結(jié)合能力的單克隆抗體（細(xì)胞克隆序號(hào)G6B3F1, 分泌物簡稱抗HBs G6

9、mAb）, 并對(duì)其與HBV“a”決定簇變異重組表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合特征進(jìn)行了初步的評(píng)價(jià)。</p><p><b>　　1 材料和方法</b></p><p>　　1.1 材料 BALB/c小鼠由湖北省疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物室提供; HBV Dane顆粒、 全基因重組野生HBsAg及Al(OH)3凝膠由衛(wèi)生部武漢生物制品研究所提供; Sp2/0細(xì)胞由中國典型培養(yǎng)物保藏中心

10、提供; RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司; PEG、 HAT、 HT以及鼠免疫球蛋白亞類檢測試劑等購自Sigma公司; 羊抗鼠IgG及HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自美國Pierce公司; HRP標(biāo)記羊抗HBs、 部分HBsAg ELISA試劑盒自市售獲得; 抗HBs A11 mAb與抗HBs Mt mAb由中科院武漢病毒研究所提供; 乙肝病毒G145R變異表面抗原由本室既往制備; 其他多種野生與IEM重組全基因S蛋白表達(dá)產(chǎn)物（表1

11、）由本院臨床免疫研究室收集并提供。</p><p><b>　　1.2 方法</b></p><p>　　1.2.1 抗HBs G6 mAb的制備 按文獻(xiàn)報(bào)道[4]。常規(guī)免疫小鼠, 融合及有限稀釋法制備雜交瘤細(xì)胞; 降植烷誘導(dǎo)法制備腹水; 采用紫外比色（以BSA為標(biāo)準(zhǔn)）測定腹水中總蛋白含量?？笻Bs G6 mAb IgG的純化采用辛酸硫酸銨沉淀法。</p

12、><p>　　1.2.2 G6ELISA的建立 采用純化抗HBs G6mAb IgG包被, 羊抗HBsHRP示蹤, 建立雙抗體夾心ELISA。主要操作為(1)將抗HBs G6mAb IgG以pH9.6的碳酸緩沖液稀釋, 加入酶標(biāo)反應(yīng)板各孔中, 4℃放置過夜; （2）以PBST洗滌5次, 加入20 g/L BSA（150 μL/孔）, 置37℃ 2 h, 甩干; （3）加入待測或?qū)φ諛?biāo)本（100 μL/孔）,

13、37℃反應(yīng)30 min; （4）同上洗板, 每孔加入100 μL羊抗HBsHRP, 37℃反應(yīng)30 min; （5）同上洗板, 加入TMBH2O溶液顯色15 min, 以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng), 置酶標(biāo)儀上測定A450值, 以P/N≥2.1判為陽性。</p><p>　　1.2.3 阻斷試驗(yàn) 在上述G6mELISA的基礎(chǔ)上進(jìn)行, 主要操作為MT mAb或A11 mAb包被; 包被; 加入與不

14、同抗HBs G6 mAb IgG預(yù)溫（30 min）后的rwHBsAg或rG145R HBsAg反應(yīng); 加入HRP標(biāo)記羊抗HBs反應(yīng); 加入TMBH2O溶液顯色, 同上測定A450值, 并與未中和孔比較計(jì)算實(shí)驗(yàn)孔顯色抑制百分率。</p><p>　　1.2.4 常規(guī)HBsAg ELISA檢測 其他多種HBsAg ELISA檢測參照試劑說明進(jìn)行。</p><p>　　1.2.5

15、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析, 結(jié)果以P&lt;0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 mAb的制備 采用常規(guī)細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞, 以間接ELISA對(duì)其抗體的特異性與分泌能力進(jìn)行篩選, 經(jīng)3次克隆化（有限稀釋法）后獲得能高效分泌抗HBs IgG6 mAb的G6B

16、3F1雜交瘤細(xì)胞系。以降植烷誘導(dǎo)法制備腹水, 并以辛酸硫酸銨沉淀法純化, 產(chǎn)物即為抗HBs G6 mAb IgG。采用紫外比色及其雙抗體夾心ELISA對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清、 腹水及純化產(chǎn)物進(jìn)行檢測, 雜交瘤上清抗HBs效價(jià)為2048, 后二者蛋白含量及效價(jià)分別為11.2±3.16 g/L與4096×103, 以及3.6 g/L與1 024×103。</p><p>　　2.2 G6M

17、ELISA的敏感性 采用G6ELISA對(duì)系列稀釋的部頒高濃度HBsAg值控血清進(jìn)行檢測, 并與重組G145R變異全基因表達(dá)產(chǎn)物（濃縮培養(yǎng)上清）進(jìn)行比較, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。該抗體與2種不同抗原反應(yīng)的顯色強(qiáng)度大致相當(dāng), 稀釋曲線斜率分別為0.716與0.729; 部頒質(zhì)控血清（自然表達(dá)野生HBsAg）稀釋至0.125 μg/L時(shí)仍能得到較強(qiáng)陽性結(jié)果（P/N值為4.5）。</p><p>　　圖1 野生與G145

18、R變異HBsAg在G6 ELISA檢測中的反應(yīng)性比較（略）</p><p>　　Fig 1 The comparision of the reactivity between wHBsAg and G145R mutant HBsAg in the G6 ELISA</p><p>　　2.3 變異抗原結(jié)合特征 采用同上G6mELISA對(duì)15份全基因重組“a”決定簇變異表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行

19、檢測, 并與野生及非“a”決定簇變異表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行比較, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）。</p><p>　　表1 抗HBs G6 mAb對(duì)“a”決定簇變異重組全基因HBsAg的反應(yīng)特性（略）</p><p>　　Tab 1 The reactivity of antiHBs G6 mAb to recombinational whole gene HBsAg which varied in “a

20、” determinant</p><p>　　*: Take the average A450 of Gly Dr and Gly Dw as 100%; **: The A450 of nontransfection supernatant control was 0.06.</p><p>　　G6mAb能與15種參與研究的IEM HBsAg中的12種發(fā)生反應(yīng), 對(duì)其中9種IEM

21、HBsAg在 ELISA中的顯色信號(hào)超過rwHBsAG產(chǎn)物的90%。(2)以羊抗HBs HRP取代各自示蹤抗體, 采用5種不同市售試劑對(duì)12種基因重組“a”決定簇變異表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測, 以重組野生全基因表達(dá)產(chǎn)物（2種）的同期檢測信號(hào)為基數(shù)計(jì)算各表達(dá)產(chǎn)物的平均顯色率（%）, 并與G6mELISA進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)。</p><p>　　表2 不同ELISA對(duì)部分重組免疫逃逸變異HBsAg檢測能力的比較

22、（略）</p><p>　　Tab 2 The comparision of the detection capability to partial recombination immune escape mutant HBsAg</p><p>　　*: Reaction intensity rank: high≥80%; Middle 30%～80%; Low≤30%; **: Co

23、mpared with G6mELISA; #: Coated with multiclone antibody.</p><p>　　2.4 抗HBs G6 mAb抗原結(jié)合位點(diǎn)分析 采用不同純化抗HBs MT與A11 mAb分別包被反應(yīng)板, 以純化抗HBs G6 mAb為阻斷抗體, 通過雙抗體夾心ELISA阻斷試驗(yàn)分析抗HBs G6 mAb與其他抗HBs mAb在抗原結(jié)合位點(diǎn)上的差別, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）顯

24、示抗HBs G6 mAb 能同時(shí)阻斷MT mAb跟rwHBsAg與rG145RHBsAg 2種抗原的反應(yīng); 其有效阻斷（即產(chǎn)生50%以上阻斷率）濃度前者幾乎較后者低一個(gè)數(shù)量級(jí)。A11與rwHBsAg的反應(yīng)可為高濃度抗HBs G6 mAb阻斷, 其與rG145R HBsAg的反應(yīng)未顯示出明確的檢測信號(hào)。同上反應(yīng)條件下, 對(duì)抗HBs A11 mAb與抗HBs MT mAb二者相互做中和試驗(yàn)。在飽和包被, 以野生HBsAg為抗原, 中和抗

25、體分別為100 mg/L濃度下, 二者平均阻斷率僅為6.83%及1.45%。</p><p>　　表3 抗HBs G6 mAb抗原結(jié)合表位的初步分析（略）</p><p>　　Tab 3 The initial analysis to antigen binding epitope of the antiHBs G6 mAb</p><p>　　*: Inte

26、rrupted hole A value/interruption rate; **: Anti HBs A11 mAb cannot react to rG145R HBsAg under this coating concentration, interruption test cannot be effective.</p><p>　　上述結(jié)果表明抗HBs G6 mAb, A11 mAb及MT mAb所針

27、對(duì)的均為HBsAg上獨(dú)立的抗原決定簇; 前二者所對(duì)應(yīng)抗原決定簇在rwHBsAg分子的距離（包括結(jié)構(gòu)與空間距離）較大但仍有一定的相關(guān)性; 抗HBs G6 mAb能較好阻斷抗HBs MT mAb對(duì)野生與G145R HBsAg的結(jié)合, 但其阻斷能力存在明顯差別, 提示它們所針對(duì)抗原決定簇的空間距離較其與抗HBs A11 mAb顯然要近。該實(shí)驗(yàn)顯示抗HBs G6 mAb對(duì)2種抗原在結(jié)合能力上的差別, 推測為G145R變異所致變異蛋白空間結(jié)構(gòu)改

28、變所帶來的影響。</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　和野生HBV一樣, HBV IEMS感染臨床診斷與流行病學(xué)的研究亦應(yīng)包括對(duì)基因、 抗原及抗體等不同層面標(biāo)志的檢測。這些標(biāo)志檢測的方法、 陽性率及其陽性覆蓋面各異, 臨床意義亦各不相同。國內(nèi)外對(duì)血清IEM HBsAg臨床漏檢的認(rèn)識(shí)與研究起源于上世紀(jì)90年代初, 重新啟用多克隆抗HBs,

29、 采用抗HBsAg非“a”決定簇區(qū)段的高親和力抗體, 以及研制一組針對(duì)不同IEMHBsAg“a”決定簇的mAb作包被抗體, 所研發(fā)的標(biāo)記免疫學(xué)試劑雖不能確證單個(gè)HBV IEM感染的臨床診斷, 但能明顯提高HBV IEM感染的臨床檢出率, 并進(jìn)而最大限度防止因感染者漏檢而引發(fā)的公共衛(wèi)生問題。我國自2000年以來部分國產(chǎn)ELISA試劑在一定程度上具備了對(duì)IEM HBsAg的檢測能力, 但迄今仍未能開發(fā)出檢測效果與雅培化學(xué)發(fā)光類似的診斷產(chǎn)品

30、。作者長期從事mAb制備與傳染病的臨床診斷研究, 經(jīng)較長時(shí)期努力成功地制備出抗HBs G6 mAb雜交瘤細(xì)胞株。系統(tǒng)的鑒定結(jié)果顯示該細(xì)胞株具有較高的抗體分泌能力, 其分泌產(chǎn)物的特異性、 強(qiáng)硬度及其與靶物質(zhì)的免疫親和力與當(dāng)前市售ELISA試劑所采用的抗體相當(dāng)或更優(yōu)（部分資料未顯</p><p>　　進(jìn)一步分析顯示該抗體對(duì)IEM rHBsAg的結(jié)合具有以下特點(diǎn)。（1）對(duì)IEM rHBsAg檢測的覆蓋面較既往多數(shù)報(bào)道明

31、顯為寬（12/15）, 其反應(yīng)強(qiáng)度呈現(xiàn)一種非高即低的鮮明特點(diǎn), 對(duì)IEM rHBsAg的檢測能力明顯優(yōu)于多數(shù)現(xiàn)行市售試劑[5]; （2）對(duì)“a”決定簇II環(huán)的139、 145、 144、 143、 142等位點(diǎn)替代性突變質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合能力與重組野生HBV S抗原大致相當(dāng), 對(duì)“a”決定簇I環(huán)起始部及其附近如120、 122、 123、 124等位點(diǎn)替代性突變質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合能力明顯降低; （3）對(duì)“a”決定簇I環(huán)內(nèi)126位點(diǎn)突變產(chǎn)

32、物的結(jié)合能力與野生株相當(dāng), 對(duì)129位點(diǎn)突變表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合視取代氨基酸不同而存在較大差別; （4）與多點(diǎn)突變質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合未表現(xiàn)出明顯的傾向性, 但“a”決定簇II環(huán)中后部的變異似乎可在一定程度上糾正因I環(huán)起始部變異造成的反應(yīng)性低下。突變部位在親水區(qū)“a”決定簇以外IEM產(chǎn)物與該抗體的結(jié)合與野生株雷同。有關(guān)IEM產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與抗原性漂移程度之間的關(guān)系已引起國內(nèi)外學(xué)者較多關(guān)注, 但其研究結(jié)果尚不足以闡述其間的內(nèi)在規(guī)律。國內(nèi)何建文、 劉芳等

33、在</p><p>　　阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 抗HBs A11與抗HBs MT mAb所對(duì)應(yīng)的是2個(gè)在血清學(xué)反應(yīng)上相互獨(dú)立的抗原位點(diǎn), 抗HBs G6 mAb能阻斷抗HBs A11與抗HBs MT二者對(duì)rwHBsAg的反應(yīng), 但其阻斷能力不強(qiáng), 對(duì)前者的阻斷作用明顯低于后者, 提示抗HBs G6 mAb所對(duì)應(yīng)抗原決定簇在一級(jí)結(jié)構(gòu)上與前二者無關(guān), 且與抗HBs A11 mAb對(duì)應(yīng)抗原位點(diǎn)的空間距離明顯大于與抗HBs

34、 MT mAb。鑒于抗HBs A11 mAb在我國早期HBsAg ELISA檢測中應(yīng)用較多, 其抗HBV“a”決定簇（或其附近位點(diǎn)）特異性最為明確, 推測抗HBs G6 mAb所對(duì)應(yīng)的抗原決定簇表位在氨基酸序列上與HBV“a”決定簇存在一定的距離。資料還顯示, 抗HBs G6對(duì)抗HBs MT mAb與rwHBsAg結(jié)合的阻斷效果明顯低于對(duì)其與G145R HBsAg結(jié)合的阻斷, 提示抗HBs G6 mAb對(duì)后者的親和力至少不低于對(duì)rw

35、HBsAg。而正是這種對(duì)G145R及其他IEM HBsAg的高親和力特征彰顯出該抗體在IEM HBsAg臨床診斷與流行病學(xué)研究中重要的理論與實(shí)用價(jià)值。</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　　[1] Ly TD, ServantDelmas A, Bagot S, et al. Sensitivities of four new com

36、mercial hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) assays in detection of HBsAg mutant forms[J]. J Clin Micro, 2006, 44(7): 2321-2326.</p><p>　　[2] Bernard W. Genetic variability of the S gene of hepatitis B

37、virus: clinical and diagnostic impact[J]. J Clini Virol, 2005, 32(2): 102-112</p><p>　　[3] 葛軍輝, 張樂芝, 姚玉成. 重組乙型肝炎病毒變異S基因的表達(dá)及其抗原性的分析[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2002, 18（6）: 108-110.</p><p>　　[4] 錢 超, 姜 平, 盧

38、春, 等. 抗SARS冠狀病毒M蛋白片段單克隆抗體的制備與初步鑒定[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2006, 22（2）: 213-215.</p><p>　　[5] 張建林, 陳 杰, 李夢南, 等. 抗變異乙型肝炎表面抗原單克隆抗體與8種乙型肝炎檢測試劑盒檢測效果的比較[J]. 中國藥物與臨床, 2005, 5(11): 814-815.</p><p>　　[6] 劉 芳, 張玉

39、萍, 馬張妹, 等. 乙肝病毒“a”決定簇129: Leu變異株免疫源性低下的機(jī)制及臨床意義[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2002, 22（3）: 279-283.</p><p>　　[7] Hou Jl, Karayiannis P, Waters J, et al. A unique insertion in the S gene of surface antigennegative hepati