HBsAg-DCs疫苗對(duì)肝移植后免疫抑制狀態(tài)大鼠抗-HBs產(chǎn)生的影響.pdf

1、目的：如何有效預(yù)防乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)再感染仍是目前肝移植(1ivertransplantation,LT)術(shù)后亟待解決的一個(gè)難題。HBV的清除機(jī)制主要是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)通過(guò)殺傷感染的肝細(xì)胞和釋放抗病毒的細(xì)胞因子(抗-HBs)來(lái)清除HBV，維持血清高滴度的抗-HBs是阻礙HBV復(fù)制的關(guān)鍵。但由于HBV感染受者常存在樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendriticcells,DCs)功能缺陷，同時(shí)LT術(shù)后必需的

2、免疫抑制治療將進(jìn)一步抑制受體DCs的功能，因此恢復(fù)DCs的強(qiáng)大免疫功能進(jìn)行主動(dòng)免疫治療可能成為預(yù)防HBV再感染的主要手段。但是，目前尚無(wú)在LT術(shù)后動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行HBsAg-DCs疫苗實(shí)驗(yàn)的報(bào)導(dǎo)，因此該疫苗是否可預(yù)防LT術(shù)后HBV再感染仍缺乏直接的證據(jù)。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們將開(kāi)展如下工作：①HBsAg沖擊DCs制備HBsAg-DC疫苗，并檢測(cè)其免疫活性。②建立Lewis→BN的大鼠同種異體急性排斥反應(yīng)(acuterejection,AR)

3、模型，并給予超大劑量免疫抑制劑FK506,模擬LT術(shù)后的極度免疫抑制狀態(tài)?？偨Y(jié)手術(shù)技巧和方法、并對(duì)比觀察急性排斥反應(yīng)大鼠和處于免疫抑制狀態(tài)大鼠的基本病理變化和生理指標(biāo)變化過(guò)程。⑧測(cè)定在LT術(shù)后處于免疫抑制狀態(tài)的大鼠體內(nèi)，HBsAg-DCs疫苗能否誘導(dǎo)出高血清滴度的抗-HBs，以期為有效防治LT術(shù)后HBV復(fù)發(fā)提供新的途徑和思路。 方法：①收集Lewis大鼠骨髓細(xì)胞，加入重組粒細(xì)胞．巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocytemac

4、rophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF)和白細(xì)胞介素4(Imerlcukin-4,IL-4)體外擴(kuò)增誘導(dǎo)DCs。DCs培養(yǎng)第7天，加入完全培養(yǎng)基(1．0ml含10％胎牛血清的RPMI一1640內(nèi)加入100gg的HBsAg)，繼續(xù)培育48h，制備HBsAg致敏的DCs疫苗(HBsAg-DCs)。光鏡下觀察其形態(tài)變化、流式細(xì)胞分選儀測(cè)定其表面CD40，CD80及OX-62表型變化、單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)判斷

5、制備的HBsAg-DCs的免疫活性。②采用改良兩袖套法建立大鼠原位肝移植動(dòng)物模型，即肝上下腔靜脈用縫合法連續(xù)吻合，門(mén)靜脈、肝下下腔靜脈用袖套法吻合，膽管內(nèi)支架法完成膽道重建。實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行：正常對(duì)照組，同種異基因移植及急性排斥反應(yīng)組(Lewis→BN)，Lewis→BN術(shù)后給予大劑量FK506(2mg．kg-1d-1)，連續(xù)14天，建立LT術(shù)后免疫抑制狀態(tài)的動(dòng)物模型組。除觀察大鼠存活率外，分別于術(shù)后3d，5d，7d和10d活殺取標(biāo)本，觀

6、察肝臟組織病理和超微結(jié)構(gòu)變化，全自動(dòng)生化分析法測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)和白蛋白(Alb)水平變化，ELISA檢測(cè)血清IL-2、IFN-y含量。③將LT術(shù)后處于免疫抑制狀態(tài)大鼠的動(dòng)物模型，隨機(jī)分為兩組：術(shù)后14d及28d，經(jīng)腹腔注入HBsAg-DCs疫苗者為HBsAg-DCs組(15只)；1W-I，連續(xù)12w，注入HBsAg疫苗200~d者為HBsAg組(15只)；另設(shè)未予免疫抑制的LT術(shù)后BN大鼠為對(duì)照組(5只

7、)。取肝臟組織行光、電鏡檢查；RT-PCR檢測(cè)脾臟IL-2、IFN-TmRNA表達(dá)水平；ELISA法檢測(cè)血清IL-2、IFN-7及抗-HBs水平；FCM檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+水平。 結(jié)果：①DC細(xì)胞培養(yǎng)2d-3d出現(xiàn)較多的貼壁簇狀生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)小而圓，有少量短突起，形似“豆芽狀”的細(xì)胞；第5d開(kāi)始細(xì)胞繼續(xù)變大，簇狀細(xì)胞團(tuán)減少，懸浮的細(xì)胞不斷增多，突起增多；以HBsAg沖擊后的第7d—lOd,懸浮細(xì)胞明顯增多，

8、體積較大，“樹(shù)突”比較明顯，此時(shí)細(xì)胞活力好，培養(yǎng)瓶壁可見(jiàn)較多的呈“長(zhǎng)條狀"貼壁生長(zhǎng)的成纖維狀細(xì)胞和伸出多個(gè)“長(zhǎng)偽足"的巨噬樣細(xì)胞。若繼續(xù)生長(zhǎng)至14d以上，則細(xì)胞明顯變大，胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)囊泡，細(xì)胞出現(xiàn)活力減退跡象；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與DCs比較，HBsAg沖擊對(duì)大鼠DCs表面特異性標(biāo)記OX62(MHC-II)的表達(dá)影響無(wú)顯著性，分別為82．5％及81．7％，P＞0．05；但明顯促進(jìn)DC成熟程度的表面共刺激分子CD40、CD80的表達(dá)，

9、分別為24．6％,70．7％及30．7％,87．1％，P0．05)。同時(shí)，經(jīng)HBsAg沖擊后第3d(培養(yǎng)第10d)的DCs，在異體T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)中能夠

10、誘導(dǎo)出很強(qiáng)的增殖應(yīng)答反應(yīng)，顯著強(qiáng)于培養(yǎng)7d,8d及9d的DCs(P

11、lliams標(biāo)準(zhǔn))，14天生存率為100％；肝組織發(fā)生輕度形態(tài)學(xué)改變，光鏡下肝細(xì)胞輕度變性濁腫，肝血竇輕度擴(kuò)張，匯管區(qū)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，整個(gè)肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常；電鏡下血竇內(nèi)Kupffer細(xì)胞(KCs)數(shù)量少、體積小，超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常，內(nèi)皮細(xì)胞輕度腫脹，毛細(xì)膽管微絨毛基本正常。肝功能損害較輕，除ALT在術(shù)后第3天明顯升高外，TBIL和Alb水平無(wú)明顯變化，血清IL-2及IFN-7在正常范圍。異基因組大鼠14天內(nèi)全部死亡，術(shù)后第7天肝組織病

12、理改變出現(xiàn)典型急排反應(yīng)(Williams標(biāo)準(zhǔn))，表現(xiàn)為肝細(xì)胞變性重，有較多壞死細(xì)胞，肝血竇顯著擴(kuò)張充血，匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞；KCs數(shù)量多、體積大、偽足增多，吞噬活躍，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯，膽管上皮細(xì)胞腫脹，微絨毛脫落。肝臟功能損害較重，血漿ALT和TBIL含量明顯升高，Alb含量降低，血清IL-2及IFN-T持續(xù)性升高，并在第7天達(dá)峰值。異基因組各指標(biāo)與FK506處理組比較，有顯著差異，P<0．01。③大劑量FK506使

13、HBsAg-DCs組及HBsAg組動(dòng)物處于極度免疫抑制狀態(tài)，肝臟組織光鏡及電鏡檢查基本正常，無(wú)排斥反應(yīng)發(fā)生的組織學(xué)改變；血清IL-2及IFN-7表達(dá)水平以及脾臟的IL-2及IFN-~表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，P<0．05；HBsAg-DCs疫苗組注射后1月外周血淋巴細(xì)胞中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞增加，以CD8+T淋巴細(xì)胞增加更明顯，與HBsAg疫苗組比較有顯著差異性，P<0．01。 HBsAg-DCs疫苗組注射后1月外周血淋巴

14、細(xì)胞中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞與疫苗注射前FK506處理組比較有顯著差異性，P<0．01；HBsAg-DCs組在疫苗注射后1mon，2mon及3mon均能檢測(cè)到高滴度的抗-HBs，明顯高于HBsAg組(抗-HBs幾乎為0)P<0．05。 結(jié)論：①?gòu)男螒B(tài)學(xué)、特異性表面標(biāo)志、啟動(dòng)基礎(chǔ)免疫應(yīng)答幾方面證實(shí)，本研究所用方法可誘導(dǎo)擴(kuò)增出較多數(shù)量和較高純度DC，負(fù)載HBsAg抗原的DC具有較強(qiáng)的抗原遞呈能力，并初步探索出較佳的體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)

15、。②我們用改良的“兩袖套法”成功建立了大鼠原位肝移植動(dòng)物模型。在此基礎(chǔ)上，建立了Lewis---}BN的大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型，并給予超大劑量免疫抑劑FK506,根據(jù)肝臟組織病理學(xué)、肝功、血清細(xì)胞因子及組織細(xì)胞因子變化證實(shí)，大鼠LT術(shù)后肝臟排斥反應(yīng)完全抑制，處于極度免疫抑制狀態(tài)。③在LT術(shù)后處于免疫抑制狀態(tài)的大鼠體內(nèi)，HBsAg-DCs疫苗仍能誘導(dǎo)出高血清滴度的抗-HBsAg。表明即使處于術(shù)后極度免疫抑制狀態(tài)下，該疫苗仍能發(fā)揮其強(qiáng)大