HBsAg-DCs疫苗對肝移植后免疫抑制狀態(tài)大鼠抗-HBs產生的影響.pdf

1、目的：如何有效預防乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)再感染仍是目前肝移植(1ivertransplantation,LT)術后亟待解決的一個難題。HBV的清除機制主要是細胞毒性T淋巴細胞(CTL)通過殺傷感染的肝細胞和釋放抗病毒的細胞因子(抗-HBs)來清除HBV，維持血清高滴度的抗-HBs是阻礙HBV復制的關鍵。但由于HBV感染受者常存在樹突狀細胞(Dendriticcells,DCs)功能缺陷，同時LT術后必需的

2、免疫抑制治療將進一步抑制受體DCs的功能，因此恢復DCs的強大免疫功能進行主動免疫治療可能成為預防HBV再感染的主要手段。但是，目前尚無在LT術后動物體內進行HBsAg-DCs疫苗實驗的報導，因此該疫苗是否可預防LT術后HBV再感染仍缺乏直接的證據。因此，在本實驗中，我們將開展如下工作：①HBsAg沖擊DCs制備HBsAg-DC疫苗，并檢測其免疫活性。②建立Lewis→BN的大鼠同種異體急性排斥反應(acuterejection,AR)

3、模型，并給予超大劑量免疫抑制劑FK506,模擬LT術后的極度免疫抑制狀態(tài)?？偨Y手術技巧和方法、并對比觀察急性排斥反應大鼠和處于免疫抑制狀態(tài)大鼠的基本病理變化和生理指標變化過程。⑧測定在LT術后處于免疫抑制狀態(tài)的大鼠體內，HBsAg-DCs疫苗能否誘導出高血清滴度的抗-HBs，以期為有效防治LT術后HBV復發(fā)提供新的途徑和思路。 方法：①收集Lewis大鼠骨髓細胞，加入重組粒細胞．巨噬細胞集落刺激因子(granulocytemac

4、rophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF)和白細胞介素4(Imerlcukin-4,IL-4)體外擴增誘導DCs。DCs培養(yǎng)第7天，加入完全培養(yǎng)基(1．0ml含10％胎牛血清的RPMI一1640內加入100gg的HBsAg)，繼續(xù)培育48h，制備HBsAg致敏的DCs疫苗(HBsAg-DCs)。光鏡下觀察其形態(tài)變化、流式細胞分選儀測定其表面CD40，CD80及OX-62表型變化、單向混合淋巴細胞反應判斷

5、制備的HBsAg-DCs的免疫活性。②采用改良兩袖套法建立大鼠原位肝移植動物模型，即肝上下腔靜脈用縫合法連續(xù)吻合，門靜脈、肝下下腔靜脈用袖套法吻合，膽管內支架法完成膽道重建。實驗分3組進行：正常對照組，同種異基因移植及急性排斥反應組(Lewis→BN)，Lewis→BN術后給予大劑量FK506(2mg．kg-1d-1)，連續(xù)14天，建立LT術后免疫抑制狀態(tài)的動物模型組。除觀察大鼠存活率外，分別于術后3d，5d，7d和10d活殺取標本，觀

6、察肝臟組織病理和超微結構變化，全自動生化分析法測定血清谷丙轉氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)和白蛋白(Alb)水平變化，ELISA檢測血清IL-2、IFN-y含量。③將LT術后處于免疫抑制狀態(tài)大鼠的動物模型，隨機分為兩組：術后14d及28d，經腹腔注入HBsAg-DCs疫苗者為HBsAg-DCs組(15只)；1W-I，連續(xù)12w，注入HBsAg疫苗200~d者為HBsAg組(15只)；另設未予免疫抑制的LT術后BN大鼠為對照組(5只

7、)。取肝臟組織行光、電鏡檢查；RT-PCR檢測脾臟IL-2、IFN-TmRNA表達水平；ELISA法檢測血清IL-2、IFN-7及抗-HBs水平；FCM檢測外周血T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+水平。 結果：①DC細胞培養(yǎng)2d-3d出現(xiàn)較多的貼壁簇狀生長，細胞形態(tài)小而圓，有少量短突起，形似“豆芽狀”的細胞；第5d開始細胞繼續(xù)變大，簇狀細胞團減少，懸浮的細胞不斷增多，突起增多；以HBsAg沖擊后的第7d—lOd,懸浮細胞明顯增多，

8、體積較大，“樹突”比較明顯，此時細胞活力好，培養(yǎng)瓶壁可見較多的呈“長條狀"貼壁生長的成纖維狀細胞和伸出多個“長偽足"的巨噬樣細胞。若繼續(xù)生長至14d以上，則細胞明顯變大，胞內開始出現(xiàn)囊泡，細胞出現(xiàn)活力減退跡象；流式細胞儀檢測結果發(fā)現(xiàn)，與DCs比較，HBsAg沖擊對大鼠DCs表面特異性標記OX62(MHC-II)的表達影響無顯著性，分別為82．5％及81．7％，P＞0．05；但明顯促進DC成熟程度的表面共刺激分子CD40、CD80的表達，

9、分別為24．6％,70．7％及30．7％,87．1％，P0．05)。同時，經HBsAg沖擊后第3d(培養(yǎng)第10d)的DCs，在異體T淋巴細胞增殖反應中能夠

10、誘導出很強的增殖應答反應，顯著強于培養(yǎng)7d,8d及9d的DCs(P

11、lliams標準)，14天生存率為100％；肝組織發(fā)生輕度形態(tài)學改變，光鏡下肝細胞輕度變性濁腫，肝血竇輕度擴張，匯管區(qū)少量炎細胞浸潤，整個肝小葉結構基本正常；電鏡下血竇內Kupffer細胞(KCs)數(shù)量少、體積小，超微結構無明顯異常，內皮細胞輕度腫脹，毛細膽管微絨毛基本正常。肝功能損害較輕，除ALT在術后第3天明顯升高外，TBIL和Alb水平無明顯變化，血清IL-2及IFN-7在正常范圍。異基因組大鼠14天內全部死亡，術后第7天肝組織病

12、理改變出現(xiàn)典型急排反應(Williams標準)，表現(xiàn)為肝細胞變性重，有較多壞死細胞，肝血竇顯著擴張充血，匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤，肝小葉結構破壞；KCs數(shù)量多、體積大、偽足增多，吞噬活躍，內皮細胞腫脹明顯，膽管上皮細胞腫脹，微絨毛脫落。肝臟功能損害較重，血漿ALT和TBIL含量明顯升高，Alb含量降低，血清IL-2及IFN-T持續(xù)性升高，并在第7天達峰值。異基因組各指標與FK506處理組比較，有顯著差異，P<0．01。③大劑量FK506使

13、HBsAg-DCs組及HBsAg組動物處于極度免疫抑制狀態(tài)，肝臟組織光鏡及電鏡檢查基本正常，無排斥反應發(fā)生的組織學改變；血清IL-2及IFN-7表達水平以及脾臟的IL-2及IFN-~表達水平明顯低于對照組，P<0．05；HBsAg-DCs疫苗組注射后1月外周血淋巴細胞中CD4+、CD8+T淋巴細胞增加，以CD8+T淋巴細胞增加更明顯，與HBsAg疫苗組比較有顯著差異性，P<0．01。 HBsAg-DCs疫苗組注射后1月外周血淋巴

14、細胞中CD4+、CD8+T淋巴細胞與疫苗注射前FK506處理組比較有顯著差異性，P<0．01；HBsAg-DCs組在疫苗注射后1mon，2mon及3mon均能檢測到高滴度的抗-HBs，明顯高于HBsAg組(抗-HBs幾乎為0)P<0．05。 結論：①從形態(tài)學、特異性表面標志、啟動基礎免疫應答幾方面證實，本研究所用方法可誘導擴增出較多數(shù)量和較高純度DC，負載HBsAg抗原的DC具有較強的抗原遞呈能力，并初步探索出較佳的體內試驗數(shù)據

15、。②我們用改良的“兩袖套法”成功建立了大鼠原位肝移植動物模型。在此基礎上，建立了Lewis---}BN的大鼠肝移植急性排斥反應模型，并給予超大劑量免疫抑劑FK506,根據肝臟組織病理學、肝功、血清細胞因子及組織細胞因子變化證實，大鼠LT術后肝臟排斥反應完全抑制，處于極度免疫抑制狀態(tài)。③在LT術后處于免疫抑制狀態(tài)的大鼠體內，HBsAg-DCs疫苗仍能誘導出高血清滴度的抗-HBsAg。表明即使處于術后極度免疫抑制狀態(tài)下，該疫苗仍能發(fā)揮其強大