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文檔簡介
1、目的:如何有效預防乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)再感染仍是目前肝移植(1ivertransplantation,LT)術后亟待解決的一個難題。HBV的清除機制主要是細胞毒性T淋巴細胞(CTL)通過殺傷感染的肝細胞和釋放抗病毒的細胞因子(抗-HBs)來清除HBV,維持血清高滴度的抗-HBs是阻礙HBV復制的關鍵。但由于HBV感染受者常存在樹突狀細胞(Dendriticcells,DCs)功能缺陷,同時LT術后必需的
2、免疫抑制治療將進一步抑制受體DCs的功能,因此恢復DCs的強大免疫功能進行主動免疫治療可能成為預防HBV再感染的主要手段。但是,目前尚無在LT術后動物體內(nèi)進行HBsAg-DCs疫苗實驗的報導,因此該疫苗是否可預防LT術后HBV再感染仍缺乏直接的證據(jù)。因此,在本實驗中,我們將開展如下工作:①HBsAg沖擊DCs制備HBsAg-DC疫苗,并檢測其免疫活性。②建立Lewis→BN的大鼠同種異體急性排斥反應(acuterejection,AR)
3、模型,并給予超大劑量免疫抑制劑FK506,模擬LT術后的極度免疫抑制狀態(tài)??偨Y(jié)手術技巧和方法、并對比觀察急性排斥反應大鼠和處于免疫抑制狀態(tài)大鼠的基本病理變化和生理指標變化過程。⑧測定在LT術后處于免疫抑制狀態(tài)的大鼠體內(nèi),HBsAg-DCs疫苗能否誘導出高血清滴度的抗-HBs,以期為有效防治LT術后HBV復發(fā)提供新的途徑和思路。 方法:①收集Lewis大鼠骨髓細胞,加入重組粒細胞.巨噬細胞集落刺激因子(granulocytemac
4、rophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)和白細胞介素4(Imerlcukin-4,IL-4)體外擴增誘導DCs。DCs培養(yǎng)第7天,加入完全培養(yǎng)基(1.0ml含10%胎牛血清的RPMI一1640內(nèi)加入100gg的HBsAg),繼續(xù)培育48h,制備HBsAg致敏的DCs疫苗(HBsAg-DCs)。光鏡下觀察其形態(tài)變化、流式細胞分選儀測定其表面CD40,CD80及OX-62表型變化、單向混合淋巴細胞反應判斷
5、制備的HBsAg-DCs的免疫活性。②采用改良兩袖套法建立大鼠原位肝移植動物模型,即肝上下腔靜脈用縫合法連續(xù)吻合,門靜脈、肝下下腔靜脈用袖套法吻合,膽管內(nèi)支架法完成膽道重建。實驗分3組進行:正常對照組,同種異基因移植及急性排斥反應組(Lewis→BN),Lewis→BN術后給予大劑量FK506(2mg.kg-1d-1),連續(xù)14天,建立LT術后免疫抑制狀態(tài)的動物模型組。除觀察大鼠存活率外,分別于術后3d,5d,7d和10d活殺取標本,觀
6、察肝臟組織病理和超微結(jié)構(gòu)變化,全自動生化分析法測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)和白蛋白(Alb)水平變化,ELISA檢測血清IL-2、IFN-y含量。③將LT術后處于免疫抑制狀態(tài)大鼠的動物模型,隨機分為兩組:術后14d及28d,經(jīng)腹腔注入HBsAg-DCs疫苗者為HBsAg-DCs組(15只);1W-I,連續(xù)12w,注入HBsAg疫苗200~d者為HBsAg組(15只);另設未予免疫抑制的LT術后BN大鼠為對照組(5只
7、)。取肝臟組織行光、電鏡檢查;RT-PCR檢測脾臟IL-2、IFN-TmRNA表達水平;ELISA法檢測血清IL-2、IFN-7及抗-HBs水平;FCM檢測外周血T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+水平。 結(jié)果:①DC細胞培養(yǎng)2d-3d出現(xiàn)較多的貼壁簇狀生長,細胞形態(tài)小而圓,有少量短突起,形似“豆芽狀”的細胞;第5d開始細胞繼續(xù)變大,簇狀細胞團減少,懸浮的細胞不斷增多,突起增多;以HBsAg沖擊后的第7d—lOd,懸浮細胞明顯增多,
8、體積較大,“樹突”比較明顯,此時細胞活力好,培養(yǎng)瓶壁可見較多的呈“長條狀"貼壁生長的成纖維狀細胞和伸出多個“長偽足"的巨噬樣細胞。若繼續(xù)生長至14d以上,則細胞明顯變大,胞內(nèi)開始出現(xiàn)囊泡,細胞出現(xiàn)活力減退跡象;流式細胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),與DCs比較,HBsAg沖擊對大鼠DCs表面特異性標記OX62(MHC-II)的表達影響無顯著性,分別為82.5%及81.7%,P>0.05;但明顯促進DC成熟程度的表面共刺激分子CD40、CD80的表達,
9、分別為24.6%,70.7%及30.7%,87.1%,P
10、誘導出很強的增殖應答反應,顯著強于培養(yǎng)7d,8d及9d的DCs(P 11、lliams標準),14天生存率為100%;肝組織發(fā)生輕度形態(tài)學改變,光鏡下肝細胞輕度變性濁腫,肝血竇輕度擴張,匯管區(qū)少量炎細胞浸潤,整個肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常;電鏡下血竇內(nèi)Kupffer細胞(KCs)數(shù)量少、體積小,超微結(jié)構(gòu)無明顯異常,內(nèi)皮細胞輕度腫脹,毛細膽管微絨毛基本正常。肝功能損害較輕,除ALT在術后第3天明顯升高外,TBIL和Alb水平無明顯變化,血清IL-2及IFN-7在正常范圍。異基因組大鼠14天內(nèi)全部死亡,術后第7天肝組織病 12、理改變出現(xiàn)典型急排反應(Williams標準),表現(xiàn)為肝細胞變性重,有較多壞死細胞,肝血竇顯著擴張充血,匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞;KCs數(shù)量多、體積大、偽足增多,吞噬活躍,內(nèi)皮細胞腫脹明顯,膽管上皮細胞腫脹,微絨毛脫落。肝臟功能損害較重,血漿ALT和TBIL含量明顯升高,Alb含量降低,血清IL-2及IFN-T持續(xù)性升高,并在第7天達峰值。異基因組各指標與FK506處理組比較,有顯著差異,P<0.01。③大劑量FK506使 13、HBsAg-DCs組及HBsAg組動物處于極度免疫抑制狀態(tài),肝臟組織光鏡及電鏡檢查基本正常,無排斥反應發(fā)生的組織學改變;血清IL-2及IFN-7表達水平以及脾臟的IL-2及IFN-~表達水平明顯低于對照組,P<0.05;HBsAg-DCs疫苗組注射后1月外周血淋巴細胞中CD4+、CD8+T淋巴細胞增加,以CD8+T淋巴細胞增加更明顯,與HBsAg疫苗組比較有顯著差異性,P<0.01。 HBsAg-DCs疫苗組注射后1月外周血淋巴 14、細胞中CD4+、CD8+T淋巴細胞與疫苗注射前FK506處理組比較有顯著差異性,P<0.01;HBsAg-DCs組在疫苗注射后1mon,2mon及3mon均能檢測到高滴度的抗-HBs,明顯高于HBsAg組(抗-HBs幾乎為0)P<0.05。 結(jié)論:①從形態(tài)學、特異性表面標志、啟動基礎免疫應答幾方面證實,本研究所用方法可誘導擴增出較多數(shù)量和較高純度DC,負載HBsAg抗原的DC具有較強的抗原遞呈能力,并初步探索出較佳的體內(nèi)試驗數(shù)據(jù) 15、。②我們用改良的“兩袖套法”成功建立了大鼠原位肝移植動物模型。在此基礎上,建立了Lewis---}BN的大鼠肝移植急性排斥反應模型,并給予超大劑量免疫抑劑FK506,根據(jù)肝臟組織病理學、肝功、血清細胞因子及組織細胞因子變化證實,大鼠LT術后肝臟排斥反應完全抑制,處于極度免疫抑制狀態(tài)。③在LT術后處于免疫抑制狀態(tài)的大鼠體內(nèi),HBsAg-DCs疫苗仍能誘導出高血清滴度的抗-HBsAg。表明即使處于術后極度免疫抑制狀態(tài)下,該疫苗仍能發(fā)揮其強大
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