相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)(srap)在農(nóng)作物遺傳育種中的應(yīng)用

1、<p>　　相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)(SRAP)在農(nóng)作物遺傳育種中的應(yīng)用</p><p>　　摘要:相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)(SRAP)是近幾年發(fā)展起來(lái)的新型分子標(biāo)記技術(shù),具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、高共顯性、易于得到選擇條帶序列等優(yōu)點(diǎn)。闡述了SRAP的原理和流程,論述了SRAP在作物遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性、基因定位等方面的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景。 </p><p>　　關(guān)鍵詞:相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài);原理;遺傳

2、圖譜;遺傳多樣性;基因定位 </p><p>　　AbstractSequence-Related Amplified Polymorphism(SRAP) is a new kind of DNA molecular markers,which possesses characteristics such as simplicity,reliability,high co-dominance and easil

3、y getting sequence of selected bands. SRAP principles and protocols were described and its research advances and application in such aspects as genetic mapping,genetic diversity,gene tagging and so on were overviewed. &l

4、t;/p><p>　　Key wordsSequence-Related Amplified Polymorphism;principles;genetic mapping;genetic diversity;gene tagging </p><p>　　我國(guó)有豐富的農(nóng)作物品種,但天然品種總是在某些性質(zhì)方面存在缺陷,如容易受到病蟲(chóng)害感染、產(chǎn)量低等。因此,選育和推廣優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物新品種是農(nóng)作物研

5、究的重要任務(wù)。分子標(biāo)記輔助育種是利用分子遺傳標(biāo)記,借助于目標(biāo)基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記的基因型分析鑒定含有目標(biāo)基因的個(gè)體,從而提高選擇效率,減少盲目性,加速育種進(jìn)程,在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)育種缺陷[1]。 </p><p>　　目前,用于植物基因組分析的分子標(biāo)記有RFLP(restr-ication fragment length polymorphism,限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)、RAPD(random amplif

6、ied polymorphic DNA,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)、AFLP(amplified fragment length polymorphism,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)、SSR(simple sequence repeat,簡(jiǎn)單重復(fù)序列)、SRAP(sequence-related amplified polymorphism,相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài))等。其中RFLP標(biāo)記雖然以共顯性方式遺傳,但由于它對(duì)DNA需求量大、實(shí)驗(yàn)操作較繁瑣、檢測(cè)

7、周期長(zhǎng)、成本費(fèi)用高等限制了其廣泛引用;RAPD方法雖然簡(jiǎn)單易行,需DNA量極少,但由于RAPD標(biāo)記是一個(gè)顯性標(biāo)記,不能識(shí)別純合子和雜合子,且其操作重復(fù)性較差;SSR具有高度的多態(tài)性、共顯性遺傳、選擇中性、易于操作等優(yōu)點(diǎn),但SSR座位的篩選和特異引物的開(kāi)發(fā)工作繁瑣且耗時(shí)費(fèi)力,限制了其廣泛應(yīng)用;AFLP技術(shù)發(fā)揮了檢測(cè)位點(diǎn)多、多態(tài)水平高、靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn),但其</p><p>　　1SRAP標(biāo)記簡(jiǎn)介 <

8、;/p><p>　　SRAP標(biāo)記是由美國(guó)加州大學(xué)作物系Li[2]于2001年在研究蕓薹作物時(shí)開(kāi)發(fā)出來(lái)的一種標(biāo)記技術(shù),在油菜、水稻、小麥、棉花等農(nóng)作物上的研究已體現(xiàn)出一定的應(yīng)用價(jià)值[3-7]。 </p><p>　　1.1SRAP標(biāo)記原理 </p><p>　　SRAP主要對(duì)植物基因組中ORFs(open reading frames,開(kāi)放閱讀框)進(jìn)行擴(kuò)增,利用外顯子富含

9、GC而啟動(dòng)子、內(nèi)含子富含AT的特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。上游引物(也叫正向引物,forward primer)長(zhǎng)17 bp,引物的3′端為3個(gè)選擇堿基,引物的5′端為14 bp的核心序列,由一段填充序列和CCGG構(gòu)成,主要結(jié)合在外顯子區(qū)域,對(duì)外顯子進(jìn)行特異擴(kuò)增。下游引物(也叫反向引物,reverse primer)長(zhǎng)18 bp,引物的3′端仍為3個(gè)選擇堿基,引物的5′端為14 bp的核心序列,其中核心序列前11 bp是一段填充序列,緊接著是AATT

10、,下游引物的結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)含子區(qū)域或啟動(dòng)子區(qū)域,對(duì)內(nèi)含子區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。由于內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔序列長(zhǎng)度在物種間或同一物種的不同個(gè)體間是不等的,因此用SRAP分析時(shí)會(huì)產(chǎn)生多態(tài)性[2]。 </p><p><b>　　1.2DNA擴(kuò)增 </b></p><p>　　DNA擴(kuò)增采用復(fù)性變溫法擴(kuò)增,主要是為了保證引物與靶DNA配對(duì),并且保證擴(kuò)增片段的重復(fù)性。反應(yīng)

11、體系中包括DNA 150 ng、dNTPs 0.2 mmoL/L、1.5 mmoL/L MgCl2、0.3 μmoL/L引物、1 U TaqDNA聚合酶。反應(yīng)參數(shù):94 ℃預(yù)變性5 min;循環(huán)30次,前5次循環(huán):95 ℃變性30 s,35 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸30 s;后25次循環(huán):94 ℃變性30 s,50 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸7 min[8]。不同的物種進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增的最優(yōu)

12、條件并非相同,因此在進(jìn)行具體研究時(shí)應(yīng)對(duì)PCR中反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,對(duì)相關(guān)參數(shù)做濃度梯度研究以確定研究對(duì)象的最優(yōu)擴(kuò)增條件,達(dá)到最好的反應(yīng)效果[9]。 </p><p><b>　　1.3產(chǎn)物檢測(cè) </b></p><p>　　擴(kuò)增產(chǎn)物通常用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,也可用瓊脂糖檢測(cè)多態(tài)性。分離完畢后用放射自顯影方法、銀染方法或EB方法檢測(cè)[8]。 </p&g

13、t;<p>　　2SRAP技術(shù)在農(nóng)作物遺傳育種中的應(yīng)用 </p><p>　　近年來(lái),由于SRAP引物的大量開(kāi)發(fā),并且在分子標(biāo)記輔助育種中體現(xiàn)出了優(yōu)于A(yíng)FLP、ISSR、RAPD等特點(diǎn)[10-11],因此備受遺傳育種學(xué)家的青睞,被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物遺傳多樣性評(píng)價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建和品種鑒定等方面。 </p><p>　　2.1遺傳多樣性研究 </p><p>

14、;　　遺傳多樣性是指物種中不同個(gè)體遺傳變異的總和。遺傳多樣性的研究是植物種質(zhì)資源保護(hù)、品種改良和開(kāi)發(fā)利用的基礎(chǔ)。分析種質(zhì)資源的遺產(chǎn)多樣性,探討遺傳基礎(chǔ)和親緣關(guān)系,為種質(zhì)資源的利用提供理論基礎(chǔ)。何鳳發(fā)等[12]隨機(jī)選用了27對(duì)SRAP引物對(duì)44份馬鈴薯(Solanum tubero-sum)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,有23對(duì)引物可產(chǎn)生104條多態(tài)性條帶,平均每對(duì)引物產(chǎn)生4.5個(gè)多態(tài)性條帶,表明SRAP標(biāo)記有較高的多態(tài)性比率,多態(tài)性豐富,可用

15、于馬鈴薯遺傳多樣性的分析。李曉慧等[13]采用SRAP分子標(biāo)記對(duì)西瓜(Citrullus lanatus)進(jìn)行遺傳多樣性分析,8對(duì)引物組合共產(chǎn)生多態(tài)性條帶37條,平均4.7條,每對(duì)引物平均多態(tài)性比率為28.675%,結(jié)果表明SRAP標(biāo)記具有較高的多態(tài)性,適合于分析西瓜等遺傳差異小的物種。 </p><p><b>　　2.2標(biāo)定基因 </b></p><p>　　標(biāo)定

16、基因?qū)τ诤蠡蚪M學(xué)的研究和作物育種具有重要意義。育種工作的目的就是實(shí)現(xiàn)品種改良,品種改良的實(shí)質(zhì)就是對(duì)目的基因進(jìn)行選擇并實(shí)現(xiàn)優(yōu)異基因集成的過(guò)程。因而實(shí)現(xiàn)目的基因的快速定位、提高其選擇效率,是加快育種進(jìn)程的關(guān)鍵。農(nóng)作物的一些重要性狀都是由一個(gè)或多個(gè)基因決定的。如果能夠找到與目的性狀相關(guān)聯(lián)的基因或是找到與目的基因連鎖的分子標(biāo)記,在雜交育種時(shí)就可以有目的地選擇親本,并且對(duì)于子代可以快速地鑒定,提高育種效率。在甘藍(lán)型油菜(Brassica nap

17、us)的育種過(guò)程中,選擇黃色籽粒是一個(gè)重要的任務(wù)。Fu等[14]利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)在不同環(huán)境中生長(zhǎng)的2個(gè)重組品系的雜交品種進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了19個(gè)數(shù)量相關(guān)性狀基因,其中一個(gè)主要的基因與標(biāo)記EM11ME20/200相鄰,通過(guò)比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這個(gè)重要的QTL基因兩側(cè)的標(biāo)記序列與擬南芥第5條染色體中定位于A(yíng)t5g44440基因和At5g49640基因間的一個(gè)重要的QTL基因的兩側(cè)序列有高度的同源性。 </p><p&

18、gt;　　產(chǎn)量性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀,對(duì)油菜產(chǎn)量性狀進(jìn)行分析,可確定其在染色體上的位置及其遺傳效應(yīng),可以探討油菜雜種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生原因,提高育種中對(duì)產(chǎn)量性狀優(yōu)良基因型選擇的效率。Chen等[15]對(duì)油菜的雙單倍體群體和F2群體進(jìn)行SRAP分析,發(fā)現(xiàn)了與6個(gè)生產(chǎn)性狀相關(guān)的QTL基因,包括植株高度、最低有效分枝的高度、主花序長(zhǎng)度、角果長(zhǎng)度、有效分枝數(shù)和角果密度,在某些染色體的區(qū)域中有多個(gè)性狀的QTL,與觀(guān)察到的部分表型性狀的相關(guān)性是一致的,表明QT

19、Ls的緊密連鎖是相關(guān)性遺傳的基礎(chǔ)。燕麥?zhǔn)侨藗兂Ｓ玫墓任?但是現(xiàn)在在谷物生長(zhǎng)的土壤中經(jīng)常會(huì)含有一些重金屬物質(zhì),如鎘。鎘是非必需的重金屬,在低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞就是高毒性的,而植物自身有一套機(jī)制可以負(fù)責(zé)鎘的解毒,并控制鎘的含量,但是對(duì)于同一種植物的不同品種可能由于遺傳因素的原因,它們的鎘含量是有差異的,因此培育低鎘含量的植物是育種的重要目標(biāo),試圖找到與低鎘含量連鎖的分子標(biāo)記,作為表型選擇的依據(jù)。在對(duì)燕麥(Avena sativa)的分析中運(yùn)用混合

20、群分離分析,發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與鎘含量相關(guān)的分子標(biāo)記:1個(gè)SRAP,2個(gè)RAPDs,1個(gè)REMAP,這4個(gè)標(biāo)記同屬于一個(gè)連鎖群,代表著與谷</p><p>　　2.3構(gòu)建遺傳圖譜 </p><p>　　遺傳圖譜是確定基因或DNA標(biāo)志在染色體上的相對(duì)位置和遺傳距離,是研究基因組遺傳與變異的重要手段。衡量遺傳圖譜質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)記分布的均勻程度,而標(biāo)記類(lèi)型是影響連鎖群上的標(biāo)記均勻分布與否的重要因

21、素之一。李媛媛等[17]利用SRAP、SSR和AFLP 3種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)甘藍(lán)型油菜進(jìn)行遺傳分析,構(gòu)建了1張包含21個(gè)連鎖群的遺傳圖譜,其中涉及137個(gè)SRAP標(biāo)記、143個(gè)SSR標(biāo)記和118個(gè)AFLP標(biāo)記,圖譜長(zhǎng)1949.8 cM。在此研究中,雖然SSR和SRAP標(biāo)記在圖譜上呈間隔分布,并且在所有21條連鎖群上,僅N7連鎖群上的標(biāo)記分布不均勻,但SSR標(biāo)記僅分布于非編碼區(qū),并且開(kāi)發(fā)費(fèi)時(shí)費(fèi)力;AFLP標(biāo)記與SRAP標(biāo)記相比,AFLP標(biāo)記

22、操作復(fù)雜,需要經(jīng)過(guò)酶切、連接等步驟,成本較高,并且AFLP容易密集分布,在研究中約有1/2的AFLP標(biāo)記僅分布在4條連鎖群上。因此,相比之下SRAP更適合于圖譜構(gòu)建。Sun等[18]利用1 634對(duì)SRAP引物組合對(duì)雙單倍體甘藍(lán)型油菜群體作圖,共產(chǎn)生了13 551條SRAP條帶,構(gòu)建的遺傳圖譜中基本上每1 cM就有8.45個(gè)SRAPs,比物理圖譜中每100 k</p><p><b>　　2.4品種鑒定

23、 </b></p><p>　　由于育種工作的大力推廣與開(kāi)展,幾乎每個(gè)農(nóng)作物中都培育了很多品種,有些品種從形態(tài)上看較為相似,并且也存在同物不同名的現(xiàn)象。為了有效地區(qū)分這些品種就必須建立分子鑒別機(jī)制。王燕等[19]利用15個(gè)引物組合對(duì)番茄(Cyphomandra betacea)11個(gè)主要品種以及1個(gè)近緣野生種進(jìn)行種質(zhì)鑒定的SRAP分析,雙引物組合me8/em8-1與me6-1/em14-1可以區(qū)分所有

24、供試材料,表明SRAP可有效用于番茄品種資源鑒定。Hao等[20]利用24對(duì)SRAP引物組合對(duì)芍藥屬(Paeonia)的29份栽培品種進(jìn)行研究,這29份品種分別屬于不同組,有14個(gè)為芍藥組植株,有13個(gè)為牡丹組植株,還有2個(gè)芍藥組和牡丹組的雜交植株,擴(kuò)增共產(chǎn)生了197條帶,其中187條多態(tài)性條帶。擴(kuò)增條帶結(jié)果顯示,用獨(dú)特的擴(kuò)增條帶和特殊的引物組合鑒定芍藥栽培品種是有效的,可以用35條SRAP條帶把14個(gè)芍藥栽培品種兩兩相互區(qū)分,并且還通

25、過(guò)Me8/Em8和Me8/Em1這2對(duì)引物組合把芍藥和牡丹樣品全部分離。 </p><p><b>　　3展望 </b></p><p>　　綜上可以看出,SRAP標(biāo)記已被應(yīng)用到農(nóng)作物研究的很多領(lǐng)域,是一種簡(jiǎn)單有效的分子標(biāo)記。與其他分子標(biāo)記相比,由于SRAP標(biāo)記擴(kuò)增對(duì)象是基因組中的開(kāi)放閱讀框,可以體現(xiàn)開(kāi)放閱讀框區(qū)域的多態(tài)性,也可更好地解釋物種性(下轉(zhuǎn)第82頁(yè)) <

26、;/p><p><b>　　(上接第80頁(yè)) </b></p><p>　　狀差異的原因。對(duì)研究中獲得的SRAP差異片段可以測(cè)序,把它轉(zhuǎn)化成SCAR(sequence characterized amplified region)標(biāo)記,這將更加有利于種質(zhì)資源的篩選鑒定工作?？傊?相信隨著檢測(cè)手段的精確度不斷提高和分析方法的逐步改進(jìn),SRAP標(biāo)記會(huì)更加完善、更為廣泛地用于物

27、種分子遺傳水平的研究。 </p><p><b>　　4參考文獻(xiàn) </b></p><p>　　[1] 鄧麗琴,祝朋芳,陳長(zhǎng)青.試論常規(guī)育種與分子育種的研究應(yīng)用[J]. 雜糧作物,2004,24(5):280-281. </p><p>　　[2] LI G,QUIROS C F. Sequence-related amplified poly

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