金屬硫蛋白mt2a與cd和cu絡(luò)合的電噴霧質(zhì)譜表征

1、<p>　　金屬硫蛋白MT2a與Cd和Cu絡(luò)合的電噴霧質(zhì)譜表征</p><p>　　作者：沈金燦 葉衛(wèi)翔　康海寧 葛麗雅 莊峙廈 王小如 </p><p>　　【摘要】 采用電噴霧質(zhì)譜法（ESIMS）研究金屬硫蛋白（MT，存在α和β兩種結(jié)構(gòu)域）2a與金屬離子Cd和Cu的絡(luò)合作用。MT2a由反相色譜分離純化制得，并以電噴霧質(zhì)譜鑒別。通過ESIMS考察MT2a與不同

2、量的Cd和Cu的絡(luò)合，結(jié)果表明，Cd能夠優(yōu)先與MT的α結(jié)構(gòu)域絡(luò)合，形成M2+4S11結(jié)構(gòu)，并且該絡(luò)合過程存在著明顯的協(xié)同效應(yīng)；Cd與MT的β結(jié)構(gòu)域的絡(luò)合形式為M2+4S9，其呈現(xiàn)出明顯的隨機松散絡(luò)合特性；Cu優(yōu)先與MT的β結(jié)構(gòu)域絡(luò)合，其絡(luò)合形式由Cu4逐漸過渡到更高結(jié)合態(tài)；在Cu含量較高的條件下，Cu與MT呈現(xiàn)出多種絡(luò)合方式。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 電噴霧質(zhì)譜, 金屬硫蛋白, 鎘離子,

3、銅離子, 絡(luò)合作用</p><p>　　Abstract Mammal metallothionein(MT) folds into two separate domains that exhibit different structure and metal binding propertity independently, the study of the strategy of metal ions b

4、inding with MT would give better understanding of their exact biological functional mechanisms. In this study, a method using eletrospray ionization mass spectrometry (ESIMS) had been developed and employed to study the

5、 stoichiometries of Cd and Cu binding with MT2a. MT2a was purified from MT mixture by rev</p><p>　　Keywords Electrospray ionization mass spectrometry, metallothionein, cadmium, copper, complexation&l

6、t;/p><p><b>　　1 引 言</b></p><p>　　金屬硫蛋白（metallothionein, MT）的分子量約為6～7 kDa，富含巰基（SH）基團（每MT分子中的半胱氨酸約占其氨基酸總量的30%），不含芳香氨基酸。它是能絡(luò)合大量金屬離子的熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)，具有廣泛的生理功能，如參與微量元素的儲存、運輸和代謝，對重金屬離子的解毒，清除體內(nèi)自由基等[1,2

7、]。自1957年MT被發(fā)現(xiàn)以來，其結(jié)構(gòu)一直是科學(xué)家關(guān)注的熱點。MT具有很強的金屬絡(luò)合能力,哺乳動物每分子MT可絡(luò)合7個二價金屬離子或12個一價金屬離子，其中Cd7MT和Cd5Zn2MT的三維結(jié)構(gòu)已分別用NMR[3]和X射線衍射法[4]測定。文獻[3～6]報道, 在MT中二價金屬離子全部與硫原子呈四面體配位,并通過橋聯(lián)的硫原子形成M2+4S11和M2+3S9兩個金屬硫醇簇,相應(yīng)組成α和β兩個結(jié)構(gòu)域; 而哺乳類動物MT與Cu+絡(luò)合

8、的方式是多樣化的。在體內(nèi)，MT與Cu+的最大絡(luò)合數(shù)是12；而在體外，MT能絡(luò)合更多的Cu+。</p><p>　　在MT與金屬的結(jié)構(gòu)研究中，常采用的表征方法有紫外光譜、圓二色譜和NMR等光譜技術(shù)[7～9]。然而，采用光譜技術(shù)只能提供MT中形成的金屬團簇與巰基的絡(luò)合性質(zhì)信息，而不能提供絡(luò)合量的信息。電噴霧質(zhì)譜法（ESIMS）是一種新的軟電離質(zhì)譜技術(shù)，在生命科學(xué)領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用[10～14]。由于ESIMS能

9、夠提供分子量信息，故通過ESIMS檢測得到的分子量變化信息可以推斷MT與金屬的絡(luò)合信息及其絡(luò)合的金屬的數(shù)量的變化[13,14]。</p><p>　　Cd是常見的重金屬元素，而Cu是動物體內(nèi)必需的微量元素，這兩種金屬均能誘導(dǎo)動物體內(nèi)產(chǎn)生MT，通過MT捕獲并貯存進人體內(nèi)的Cd和Cu, 以緩解這些金屬元素對細胞和組織的毒害作用[1]。本研究以ESIMS技術(shù)研究Cd和Cu與MT2a的絡(luò)合作用，所得結(jié)果有助

10、于進一步理解MT的的解毒機理及其與微量元素間的作用。</p><p><b>　　2 實驗部分</b></p><p><b>　　2.1 儀器與試劑</b></p><p>　　1100型四極桿質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），蛋白分子量的計算及質(zhì)譜的解析采用Agilent Chemistation 軟件。</p

11、><p>　　三羥甲基氨基甲烷（Tris）、醋酸銨、乙酸，均為優(yōu)級純（Alfa Aesar, USA）；Cd（國家標準物質(zhì)研究中心）；Cu(CH3CN)4PF6（Aldrich公司）。實驗用水由Nanopure Diamond (Barnstead, USA)超純水裝置制備。所用流動相和溶劑都經(jīng)氬氣脫氣除氧，避免MT被氧化。</p><p><b>　　2.2 樣品制備</b

12、></p><p>　　0.01 mol/L Cd溶液；Cu溶解在30％（V/V）乙腈溶液中，其濃度為0.01 mol/L。儲備液存放于4 ℃冰箱，工作液按需要以緩沖液適當稀釋。</p><p>　　所用Zn誘導(dǎo)兔肝金屬硫蛋白（湖南麓谷生物有限公司），該樣品為經(jīng)排阻色譜分離所得到混合MT。由于混合MT含有多種MT的亞型異構(gòu)體，采用混合MT進行實驗將使所得質(zhì)譜結(jié)果的譜峰難以確認和歸

13、屬，因此先將混合MT通過反相色譜柱進行分離，收集19 min洗脫組分。所用色譜柱為Zorbax 300 SB C18柱（150 mm×2.1 mm, 5 μm，30 nm）（Agilent，USA），色譜條件為：流速0.25 mL/min，流動相A為10 mmol/L Tris 緩沖液（pH 7.4），流動相B為乙腈?；旌螹T采用0～50 min內(nèi)由5% B上升到10% B的梯度洗脫程序進行分離。將收集到的洗脫液冷凍干燥后，加

14、少量水溶解，樣品轉(zhuǎn)移到截流分子量為3 kDa的超濾離心管中（Millipore，USA），超濾離心脫鹽。脫鹽后的樣品作為儲備液于－4℃中保存。目前用于MT濃度測定的方法有電感耦合等離子體法和Ellman法等[15,16]，以Ellman法測定儲備液中MT的濃度為2.5 g/L。實驗所用MT2a濃度為0.20 g/L。</p><p>　　2.3 色譜質(zhì)譜條件</p><p>　　采用流動

15、注射進樣，進行閥為7725i 型帶有5 μL采樣環(huán)的六通閥（rheodyne, CA, USA），流動相為50%(V/V）乙腈溶液，流速為0.1 mL/min，實驗前質(zhì)譜進行調(diào)諧以使儀器達到最優(yōu)狀態(tài)，連續(xù)進樣3次達到穩(wěn)定后才開始質(zhì)譜實驗。掃描范圍為800～2000 Da，掃描步長0.15 amu，毛細管電壓4 kV，碰撞電壓為100 V，干燥氣體溫度為300 ℃。 </p><p><b>　　3

16、結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.1 MT2a的質(zhì)譜鑒別</p><p>　　MT2a經(jīng)反相液相色譜分離制得，采用電噴霧質(zhì)譜對MT2a樣品進行鑒別。在0.1%甲酸溶液中，絡(luò)合在蛋白上的主要金屬（Zn）將被脫去，從而檢測得到脫金屬硫蛋白的分子量。圖1為經(jīng)色譜純化得到的MT2a樣品的質(zhì)譜圖，由圖1可見，脫金屬MT以4+、5+、6+和7+的電荷狀態(tài)存在，并且強度逐漸

17、遞增。通過質(zhì)譜軟件解析得分子量為6125，與MT2a的理論分子量（6125）一致。</p><p>　　3.2 Cd與apoMT的絡(luò)合</p><p>　　哺乳動物MT分子存在α和β兩種結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域與金屬絡(luò)合的能力不同，β結(jié)構(gòu)域中的9個半胱氨酸與二價金屬形成M2+3S9團簇，而α結(jié)構(gòu)域中的11個氨基酸與二價金屬以M2+4S11形式絡(luò)合，在這兩個結(jié)構(gòu)域中二價金屬離子以四面體形式

18、與巰基進行配位。</p><p>　　為了研究金屬離子與脫金屬MT的絡(luò)合形式，在酸性條件下（1%甲酸）將制備得到的Zn7MT2a，進行脫金屬，并經(jīng)凝膠色譜純化得到apoMT2a。所用0.20 g/L MT2a在10 mmol/L 醋酸銨溶液（pH 6.0）中進行反應(yīng)。Cd與apoMT2a的絡(luò)合如圖2所示。</p><p>　　由圖2可見，隨著Cd量的增多，Cd與MT的絡(luò)

19、合數(shù)量逐漸發(fā)生變化。當樣品中加入2或4倍MT量的Cd時，ESIMS質(zhì)譜圖上出現(xiàn)了Cd4MT絡(luò)合信號，并且隨著Cd的增多，Cd4MT的信號逐漸增強，而apoMT的信號逐漸減弱。Stillman等[17]的研究表明，Cd可以優(yōu)先與α結(jié)構(gòu)域中的11個氨基酸絡(luò)合形成M2+4S11，所得質(zhì)譜結(jié)果亦印證了本結(jié)果。當加入Cd的量小于MT量的4倍時，并未檢測到Cd1～3MT的絡(luò)合物，Cd與MT的唯一絡(luò)合方式是Cd4，即Cd與MT的

20、絡(luò)合表現(xiàn)為“全有”或“全無”的絡(luò)合形式，Cd在該結(jié)構(gòu)域絡(luò)合呈現(xiàn)明顯的協(xié)同效應(yīng)[18,19]。當加入Cd的量超過MT量（α結(jié)構(gòu)所能絡(luò)合的Cd的數(shù)量）的4倍時，過量的Cd將與β結(jié)構(gòu)域上的巰基絡(luò)合；當加入Cd的量為MT量的5.5倍時，質(zhì)譜上出現(xiàn)了Cd5和Cd6與MT的絡(luò)合信號；繼續(xù)加入Cd，質(zhì)譜上出現(xiàn)了Cd6和Cd7與MT的絡(luò)合信號；當加入Cd的量超過MT量的7倍時，質(zhì)譜上只出現(xiàn)絡(luò)合7個Cd的MT的信號。與Cd在α結(jié)構(gòu)域的絡(luò)合

21、不同，Cd在β結(jié)構(gòu)域的絡(luò)合相對松散，單個Cd的絡(luò)合并沒有促進后續(xù)Cd</p><p>　　綜上可知，Cd與MT的α、β結(jié)構(gòu)的絡(luò)合能力不同，優(yōu)先與α結(jié)構(gòu)域絡(luò)合，其絡(luò)合形式為Cd4MT，并且呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)；而在β結(jié)構(gòu)域，Cd的絡(luò)合能力較弱，并且其絡(luò)合呈現(xiàn)出較為松散和無規(guī)則的狀態(tài)。α、β結(jié)構(gòu)域與金屬的絡(luò)合能力的差異與其具有不同的生物功能有關(guān)，由于α結(jié)構(gòu)域與重金屬具有較強的絡(luò)合作用，故其在重金屬（如Cd和Hg）的

22、解毒方面具有重要作用，而β結(jié)構(gòu)域在金屬交換過程中起了重要作用[20]。</p><p>　　3.3 Cu與apoMT的絡(luò)合</p><p>　　文獻[21]指出，每個MT能絡(luò)合7～15個或更多的Cu；而在體外研究中，Nielson[18]和Winge[22]通過酶解研究發(fā)現(xiàn)，哺乳類動物1分子MT可以絡(luò)合12個Cu，MT的α、β結(jié)構(gòu)域均可以絡(luò)合6個Cu。Cu與兩個結(jié)構(gòu)域的絡(luò)合能力

23、相同，β結(jié)構(gòu)域的絡(luò)合能力優(yōu)于α結(jié)構(gòu)域。</p><p>　　Cu與MT間具有較強的絡(luò)合力，即使在pH 1.5下也能與MT絡(luò)合[23]，酸性條件不僅有利于MT的ESIMS檢測，還能使apoMT穩(wěn)定存在，故Cu與apoMT的絡(luò)合實驗在0.2%甲酸溶液（pH 2.5）中進行。</p><p>　　由圖3可見，在apoMT中加入2倍于MT量的Cu時，質(zhì)譜圖上出現(xiàn)了Cu4MT的信號；

24、當加入Cu的量達到MT量的4倍時，Cu與MT的絡(luò)合表現(xiàn)為Cu4MT、Cu5MT、Cu6MT、Cu7MT和Cu8MT，其中豐度最大的質(zhì)譜離子對應(yīng)于Cu4MT；當加入Cu的量為MT量的6倍時，質(zhì)譜上同時出現(xiàn)Cu4MT、Cu5MT、Cu6MT、Cu7MT和Cu8MT的質(zhì)譜信號，Cu5MT、Cu6MT、Cu7MT和Cu8MT的信號逐漸增強，其中以Cu8MT的信號增強最為明顯；當Cu的量10倍于MT的量時，

25、Cu4MT、Cu5MT、Cu6MT 和Cu7MT的信號消失，檢測到的質(zhì)譜信號對應(yīng)于Cu8MT、Cu9MT、Cu10MT、Cu11MT和Cu12MT，其中Cu8MT的信號強度最高；繼續(xù)加入Cu，檢測到的Cu絡(luò)合MT離子的信噪比較低，使得對Cu絡(luò)合MT的質(zhì)譜解析十分困難。因此，本實驗只考察了10倍于MT量范圍內(nèi)Cu與MT2a的絡(luò)合。</p><p>　　由以上結(jié)果可知，當apoMT中加入

26、極少量Cu時，Cu與MT的絡(luò)合形式為Cu4MT，此結(jié)果與文獻[24]一致。Cu4MT的絡(luò)合形式被認為是Cu與MT的β結(jié)構(gòu)域上的9個半胱氨酸以四面體形式絡(luò)合而產(chǎn)生的，并且該絡(luò)合過程存在著協(xié)同效應(yīng)，因而，即使只加入少量Cu也會形成(Cu4)βMT。樣品中加入4倍于MT量的Cu后，出現(xiàn)Cu4～8系列結(jié)構(gòu)，表明該條件下Cu與MT存在著多種絡(luò)合形式。由于(Cu4)βMT較穩(wěn)定，因而再加入的Cu主要參與了α結(jié)構(gòu)域的絡(luò)合，從而形

27、成(Cu4)β(Cu1～4)α結(jié)構(gòu)。這也表明Cu在α結(jié)構(gòu)域的結(jié)合較為松散且無規(guī)則，具有一定的動力學(xué)特性。當加入的Cu為MT量的6倍時，質(zhì)譜上沒有產(chǎn)生新的結(jié)合信號，Cu與α結(jié)構(gòu)域的絡(luò)合量不斷增加，其中以Cu8MT的增加最為顯著。Cu8MT的快速增加表明，Cu在α絡(luò)合域的絡(luò)合更傾向于生成Cu4結(jié)構(gòu)，從而形成(Cu4)α(Cu4)β結(jié)構(gòu)。繼續(xù)加入Cu，生成Cu9～14，表明Cu4結(jié)構(gòu)被破壞進而轉(zhuǎn)變成更高結(jié)合態(tài)的結(jié)構(gòu)。此結(jié)果也表明

28、Cu與MT存在多種絡(luò)合方式。</p><p><b>　　4 結(jié) 論</b></p><p>　　哺乳動物MT分子中包含α和β兩種結(jié)構(gòu)域，兩者相互獨立，結(jié)構(gòu)不同，能獨立的行使功能。本實驗采用電噴霧質(zhì)譜考察了金屬離子Cd和Cu與MT的絡(luò)合方式。研究發(fā)現(xiàn)，Cd能夠優(yōu)先與MT的α結(jié)構(gòu)域絡(luò)合，形成M2+4S11結(jié)構(gòu)，絡(luò)合過程存在著明顯的協(xié)同效應(yīng)；Cd與β結(jié)構(gòu)域的絡(luò)合

29、形式為M2+3S9，對Cd與apoMT的絡(luò)合研究表明，Cd與MT的β結(jié)構(gòu)域的絡(luò)合呈現(xiàn)出明顯的隨機松散絡(luò)合特性。Cu與MT的絡(luò)合實驗表明，Cu優(yōu)先與MT的β結(jié)構(gòu)域絡(luò)合，其絡(luò)合形式由Cu4逐漸過渡到更高結(jié)合態(tài)，在Cu 含量較高的條件下，Cu與MT的絡(luò)合呈現(xiàn)出多種絡(luò)合方式。本研究還表明，選擇合適的條件，ESIMS能夠用于金屬與蛋白絡(luò)合的快速表征。</p><p><b>　　【參考文獻】<

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