人腦金屬硫蛋白MT3結構對其性質和功能的影響.pdf

1、復旦大學博士學位論文人腦金屬硫蛋白MT3結構對其性質和功能的影響姓名：鄭起申請學位級別：博士專業(yè)：無機化學指導教師：黃仲賢20030508應的速率常數(shù)約為MTl的四倍，這進一步證明MT3中的金屬硫簇較MTl中的更不穩(wěn)定，部分金屬硫鍵更弱。MT3與DTNB的反應也比MTl要快，這～結果顯示MT3中的金屬硫簇暴露于溶劑中的程度更大，這部分是由于其p一結構域本身結構較為松散，同時還源于其D結構域中特有的CPCPmotif，兩個連續(xù)的Pro使蛋

2、白肽鏈在此產(chǎn)生明顯的彎折，導致金屬硫簇更加暴露。我們推測，這種暴露性對于MT3的性質和功能有著決定性的意義。此外，MT3也更容易被生物酶所降解，如采用Trypsin進行1周的模擬消化，MTl能夠維持完整結構不被破壞的約占60％，而等同條件下仍能保持完整的MT3只有約18％。為了揭示性質差異的起源，我們通過多種譜學方法來考察了Cd7MT3的結構。實驗結果表明，Cd7一MT3能夠很好保持其結構的完整性，UV、cD光譜都呈現(xiàn)出特征的金屬硫簇電

3、荷轉移吸收帶，沒有明顯的氧化朕兆。Raman光譜顯示，蛋白中的巰基都參與了金屬離子的配位，既不存在自由的巰基，也沒有二硫鍵形成。然而，與MTl相比，MT3的結構明顯比較松散。柱層析的結果顯示，MT3的Stoke’S半徑較大，在等同實驗條件下其保留時間較短。通過NMR對蛋白的三級結構進行解析可以說明為什么存在這種松散性。研究發(fā)現(xiàn)：MT3中a名；構域折疊較為緊密，而B一結構域中長程NOE信號非常少。0【結構域中，除53—60位以外，蛋白的肽

4、鏈可變性都不大且總體走向與MTl極為相似，然而，G53一E60一段肽鏈卻沒有一種能量上占明顯優(yōu)勢的構象，它可以隨環(huán)境條件的變動較為靈活的調整。這點是造成MT3獨特性質的重要因素之一。同時，柔性的G53一E60肽段也可能是蛋白一蛋白相互作用中理想的結合位點。與Cd7一MT3相比，Zn7一MT3的穩(wěn)定性明顯較低，其酸滴定曲線的突躍中點大約在49而且Zn”在pH70時就開始發(fā)生解離。在pH60時重組、純化的Zn7MT3在Raman光譜上可明顯

5、看到507nm處的二硫鍵吸收。Zn7MT3與EDTA的反應速率比Cd7一MT3要快得多，EDTA濃度為1mM時，其快反應速率為5110≈s～，約是Cd7MT3(11210。s。1)的4倍，而同DTNB的反應速率則與Cd7MT3相近，預示著金屬硫簇的暴露程度Zn7一MT3與Cd7一MT3差不多。為了進一步求證其結構對性質和功能所產(chǎn)生的影響，我們有目的地構建了～系列突變體蛋白。通過對突變體蛋白和野生型MT3的比較，我們可以進～步加深對MT3

6、結構一性質一功能之間相互關系的認識。MT3在一級結構上最顯著的特征之一就是在第5560位之間插入了一段富含Glu的六肽，為考察這個酸性六肽loop對蛋白性質的影響，我們構建了一組突變體，包括六肽缺失突變體△E(55)E(60)，酸性殘基置換突變體E55158t60Q和E58K，以及cc—helixmaker或breaker的突變體G53／54A和E55D，A56G，A56G，E58D／A59G，E60D，A61G／E62D。通過對比上述