三疣梭子蟹球狀病毒的人工感染與純化【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　三疣梭子蟹球狀病毒的純化與人工感染</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><p

2、>　　三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)，廣泛分布于我國沿海，是一種經(jīng)濟價值較高的大型海產(chǎn)經(jīng)濟蟹類。三疣梭子蟹肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，是人們極為喜愛的水產(chǎn)品，同時也是重要的出口創(chuàng)匯品種，已逐漸成為我國海水養(yǎng)殖的主導品種之一。目前,我國沿海各省均開展了三疣梭子蟹人工養(yǎng)殖, 尤其浙江省沿海地區(qū)養(yǎng)殖發(fā)展迅速，舟山市一帶

3、短短幾年就發(fā)展成了全國聞名的梭子蟹養(yǎng)殖基地。隨著三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖密度不斷增加，而又因其受海洋環(huán)境污染、養(yǎng)殖生產(chǎn)自身帶來的污染、養(yǎng)殖技術(shù)等多方面的原因制約，三疣梭子蟹的養(yǎng)殖過程中病害問題也日趨突出。各種疾病的發(fā)病率和危害程度有逐年上升的趨勢，并呈現(xiàn)出大規(guī)模發(fā)生和暴發(fā)性流行的趨勢。不但提高了水產(chǎn)養(yǎng)殖的投入產(chǎn)出比，危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者的經(jīng)濟利益，且由于對病原不了解而盲目用物，導致藥物濫用，打擊了消費信心，影響到出

4、口內(nèi)銷，嚴重困擾著梭子蟹水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。另外由于一些蝦蟹綜合養(yǎng)殖的推廣，一些廣宿主病毒如白斑綜合癥桿狀病毒等也成為侵害三疣梭子</p><p>　　國內(nèi)外已報道的蟹類病毒有：類呼腸孤病毒、微核糖核酸病毒、藍蟹皰疹病毒、藍蟹螺旋病毒、河蟹顫抖病毒及鋸緣青蟹桿狀病毒等。對蟹類病毒的研究多集中在形態(tài)觀察水平上，尚未進行分子鑒定及靈敏檢測方法構(gòu)建。國內(nèi)外有關(guān)三疣梭子蟹病毒研究的文獻極少，對三疣梭子蟹病毒的病原和病理

5、研究也尚不深入。其中以對蝦白斑癥病毒（WSSV）研究相對透徹：白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是對蝦白斑綜合癥的病原體,同時也是導致三疣梭子蟹大量死亡的主要傳染性病毒之一，具有宿主范圍廣、傳播快、感染后死亡率高等特點，國內(nèi)一些研究所通過實時熒光定量PCR測定試驗蟹體內(nèi)各器官中WSSV含量,病理切片觀察瀕死蟹各器官組織病理改變的方法，對WSSV進行了系統(tǒng)的研究。</p><

6、;p>　　近年來，梭子蟹養(yǎng)殖中大規(guī)模爆發(fā)性死亡現(xiàn)象的時有發(fā)生，至今還未得到微生物學、分子生物學、免疫學的明確鑒定。此類不明病害嚴重威脅著我國梭子蟹蟹類養(yǎng)殖業(yè)。通過對寧海三疣梭子蟹發(fā)生秋季大規(guī)模死亡樣品的病理觀察，發(fā)現(xiàn)組織細胞中存在大量球狀病毒。我們擬對人工養(yǎng)殖過程中的三疣梭子蟹秋季大量死亡的病樣進行病毒純化，對純化的病毒進行形態(tài)觀察，并用病毒對健康蟹進行人工感染研究，以期為三疣梭子蟹病毒病害快速診斷、防治提供理論與技術(shù)支撐。<

7、;/p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　研究的基本內(nèi)容：</b></p><p>　　建立由三疣梭子蟹感染組織純化球狀病毒的技術(shù)方法：</p><p>　　A采集患病三疣梭子蟹</p><p><b>　　B研制合適的緩沖液</b>

8、</p><p>　　C. 將病樣在緩沖液中勻漿，后建立多步驟差速離心純化病毒的技術(shù)，摸索、優(yōu)化純化條件</p><p>　　D 對純化的病毒進行負染、電鏡觀察其形態(tài)特征</p><p>　　2 三疣梭子蟹球狀病毒的人工感染研究：</p><p>　　A 由病樣粗提病毒，細菌濾器過濾后，注射健康梭子蟹，觀察感染、死亡情況</p>

9、<p>　　B 對人工感染發(fā)病的梭子蟹，抽樣解剖、固定后制作超薄切片電鏡觀察。</p><p><b>　　擬解決的主要問題：</b></p><p>　　1 建立由三疣梭子蟹感染組織純化球狀病毒的技術(shù)方法</p><p>　　2 確定三疣梭子蟹球狀病毒的致病力</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：

10、</p><p>　　1．采集發(fā)病梭子蟹，在緩沖液中勻漿，差速離心純化病毒，對純化的病毒進行負染、電鏡觀察，重復實驗，摸索、優(yōu)化相關(guān)純化條件。</p><p>　　2．由發(fā)病梭子蟹粗提病毒，細菌濾器過濾后，注射健康梭子蟹，觀察、記錄其感染、死亡情況。對人工感染發(fā)病的梭子蟹，抽樣解剖、固定后制作超薄切片電鏡觀察判斷其細胞中是否存在相應病毒。</p><p><b

11、>　　研究技術(shù)路線：</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進度：</p><p>　　2010.11-2010.12 查閱文獻，撰寫開題報告和綜述，熟悉實驗操作；</p><p>　　2010.12-2011.01 翻譯二篇外文文獻；</p><p>　　2011.01-2011.02 樣品采集，病毒

12、純化；</p><p>　　2011.02-2011.04 人工感染三疣梭子蟹，對發(fā)病的三疣梭子蟹組織切片后電鏡觀察；</p><p>　　2011.04-2011.05 實驗數(shù)據(jù)的整理、分析，撰寫論文，結(jié)題、答辯。</p><p><b>　　五、主要參考文獻：</b></p><p>　　[1]　閻斌倫，梁利

13、國，張曉君．三疣梭子蟹主要病害研究進展[J]．水產(chǎn)科技情報，2010(1)：29－37．</p><p>　　[2]　Kazuo Momoyama，Midori Hiraoka，Venegas et al.Pathogenicity of penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV)to juveniles of six crustacean species[C]．4．Symp. on

14、Diseases in Asian Aquaculture(DAA IV)，Cebu City(Philippines)：1999，22－26 Nov．</p><p>　　[3]　肖國華，趙春龍，崔兆進．三疣梭子蟹人工育苗及養(yǎng)成病害發(fā)生的主要原因及防治方法[J]．齊魯漁業(yè)，2006，23(3)：36－37．</p><p>　　[4]　王亞維． 三疣梭子蟹人工育苗中絲狀菌病和粘污病的防治

15、[M]．養(yǎng)殖技術(shù)，2006(2)：41．</p><p>　　[5]　Montanieh，Bonami J R，Comps M. Irido-like virus infection in the crab Macropipus depuratorL．(Crus-tacea, Decapoda) [J]．J Invertebr Pathol， 1993，61：320－322．</p><p&g

16、t;　　[6]　王光宇．三疣梭子蟹的健康養(yǎng)殖和白斑病毒病的防治[J]．水產(chǎn)科技情報，2005，32(5)：221－222．</p><p>　　[7]　王忠發(fā)，王志錚，許文軍． 蝦蟹混養(yǎng)塘中WSSV對三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)致死效應的定量研究[J]．海洋與湖沼，2008，(2)：184－189．</p><p>　　[8]　Mari J，Bonami

17、J R．PC84，a parvo-like virus from the crab Carcinus mediterraneus：Pathological aspects，ul-trastructure of the agent，and first biochemical Characterization [J]．J Inbertebr Pathol，1988(51)：145－156．</p><p>　　[9]

18、　徐國成，閻斌倫，徐加濤．蝦蟹擬阿腦蟲病的防治研究[M]．水利漁業(yè)，2006(26)：95－97．</p><p>　　[10]　施 慧，許文軍，徐漢祥．三疣梭子蟹感染血卵渦鞭蟲PCR檢測方法的建立[J]．上海水產(chǎn)大學學報，2008(17)：28－33．</p><p>　　[11]　王希升，曹建亭，李欣，等．才女蟲對三疣梭子蟹育苗的影響[M]．齊魯漁業(yè)．2008(28)：44－45．&l

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20、24－25．</p><p>　　[15]　丁朋曉，張連英．養(yǎng)殖蟹類病害的研究進展[M]．畜牧與飼料科學，2010(31)：33－35．</p><p>　　[16]　王高學，黃增榮， 顧忠旗．三疣梭子蟹“牛奶病”的流行病學調(diào)查與防治技術(shù)(上)[M]．科學養(yǎng)魚，2007(2)：83．</p><p>　　[17]　王國良，金珊，李政，等．三疣梭子蟹( Portunu

21、s tritubercu latus)乳化病的組織病理和超微病理研究[J]．海洋科學，2006，(4)：37．</p><p>　　[18] 陳寅兒，王國良，金珊，等．三疣梭子蟹肌肉乳化病的同工酶病理變化研究[M]．海洋科學，2008(32)：36－39．</p><p>　　[19] 許文軍，徐漢祥，施慧，等．梭子蟹假絲酵母菌病初步研究[M]．水產(chǎn)學報，2005(29)：831－83

22、6．</p><p>　　[20]　許文軍，徐漢祥， 施慧．三疣梭子蟹Portunus trituberculatus(Miers)血卵渦鞭蟲病診斷與綜合防治措施[M]．現(xiàn)代漁業(yè)信息，2006，(21)：11．</p><p>　　[21]　王廣成， 趙炳然，王權(quán)，等．對越冬期三疣梭子蟹擬阿腦蟲病的初步研究[J]．齊魯漁業(yè)，2005，22(3)：33－34．</p><

23、p>　　[22]　陳寅兒，王國良，金珊，等．梭子蟹乳化病病原菌聯(lián)合藥敏實驗[M]．水利漁業(yè)，2006(26)：13－15．</p><p>　　[23]　王世黨，周維武，宋宗巖，等．文登市中國對蝦白斑病發(fā)病監(jiān)測及分析[J]．齊魯漁業(yè)，2002(19)：10．</p><p>　　[24]　侯傳寶．梭子蟹育苗中“紅圈病”防治初探[M]．漁業(yè)致富指南，2007(2)：41．</p&

24、gt;<p>　　[25]　許文軍，徐漢祥，金海衛(wèi)梭子蟹“乳化病”病原的研究[J]．浙江海洋學院學報，2003(22)：209－213．</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　三疣梭子蟹病害研究進展</p><

25、;p>　　摘要：綜述了蟹類中常見的病害種類及其危害，包括細菌類疾病，真菌類疾病，病毒類疾病，寄生蟲疾病。對蟹類病害的防治進行了探討。</p><p>　　關(guān)鍵詞：蟹類；病害；研究方法；防治</p><p>　　三疣梭子蟹(Ponunus trituberculatus)隸屬于甲殼綱(Crustacea)，十足目(decapoda)，梭子蟹科(Portunidae)，梭子蟹屬(Port

26、unus)，是一種重要的海洋經(jīng)濟蟹類[1]。三疣梭子蟹肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，是人們極為喜愛的水產(chǎn)品，同時也是重要的出口創(chuàng)匯品種，已逐漸成為我國海水養(yǎng)殖的主導品種之一。隨著三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖密度不斷增加，同時由于海洋環(huán)境污染、養(yǎng)殖生產(chǎn)自身帶來的污染以及養(yǎng)殖技術(shù)制約等多方面的原因，三疣梭子蟹的養(yǎng)殖過程中病害問題日趨突出。各種疾病的發(fā)病率和危害程度有逐年上升的趨勢，并呈現(xiàn)出大規(guī)模發(fā)生和暴發(fā)性流行的勢態(tài)。</

27、p><p>　　各種疾病的爆發(fā)引起了研究者們的關(guān)注，許多梭子蟹疾病的病癥和病原得到了分析和鑒定，對三疣梭子蟹疾病的預防和治療的研究提供了積極、有效的指導，本文將對目前為止三疣梭子蟹主要病害及研究現(xiàn)狀進行綜述，旨在為海水養(yǎng)殖蟹類病害的防治提供科學依據(jù)。</p><p><b>　　1 三疣梭子蟹病害</b></p><p>　　三疣梭子蟹的常見疾病可

28、分為：細菌類疾病，真菌類疾病，病毒類疾病，寄生蟲疾病。</p><p><b>　　1.1 細菌類疾病</b></p><p><b>　　1.1.1 弧菌病</b></p><p>　　由鰻弧菌，副溶血弧菌及溶藻弧菌引起的弧菌病。大多數(shù)弧菌為條件致病菌，當環(huán)境污染，水質(zhì)惡化，弧菌大量繁殖達到一定數(shù)量時，體質(zhì)弱或受傷的梭子

29、蟹易發(fā)生弧菌病。絲狀細菌病的病原體為毛霉亮發(fā)菌，菌體為頭發(fā)絲狀，不分枝，基部略粗，頂端稍細，長度一般幾微米到1㎜以上，菌絲一般為透明無色。主要附著在抱卵蟹的受精卵表面及蚤狀幼體的鰓，附肢，體表[2]。</p><p><b>　　1.1.2 發(fā)光病</b></p><p>　　病原體為螢光假單胞和亮弧菌等發(fā)光細菌引起的發(fā)光病。主要危害蚤狀幼體的各個時期，幼體感染此病后

30、會陸續(xù)死亡，嚴重時死亡率在1~2天內(nèi)可高達80%以上[3]。</p><p>　　1.1.3 甲殼潰瘍病</p><p>　　一些能分解幾丁質(zhì)的細菌會引起甲殼潰瘍病。主要發(fā)生在養(yǎng)成期，并且甲殼上有數(shù)目補丁的黑褐色潰瘍性斑點，在蟹的腹部較多[4]。</p><p><b>　　1.2 真菌類疾病</b></p><p>　

31、　鏈壺菌病發(fā)病率不高但危害較重，是由鏈壺菌與鏈壺菌狀的真菌寄生引起的。主要寄生在抱卵蟹的受精卵表面及蚤狀幼體的體節(jié)處，一旦發(fā)病，菌絲快速生長，感染率高[5]。</p><p><b>　　1.3 病毒類疾病</b></p><p>　　2000年以來，以對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）[6]病原的“蝦蟹共死病”在浙江沿海蝦蟹混養(yǎng)池內(nèi)經(jīng)常大面積發(fā)生（王虹玲，2005），王

32、忠發(fā)等在2003—2005年間在舟山沿海對感染了白斑綜合癥瀕死的三疣梭子蟹病毒進行驗證，觀察分析，為三疣梭子蟹的高效安全養(yǎng)殖提供了基礎(chǔ)材料[7]。</p><p>　　1.4 寄生蟲疾病 </p><p>　　1.4.1 蟹棲擬阿腦蟲病</p><p>　　寄生蟲也是蟹類疾病的重要病原之一，常造成養(yǎng)殖蟹類大量死亡，給養(yǎng)殖戶帶來嚴重的損失。常見的蟹類寄生蟲蟹棲擬阿腦

33、蟲是一種兼性寄生蟲，有多種傳染途徑，最早報道于意大利的綠蟹和法國的一種黃道蟹中發(fā)現(xiàn)這種寄生蟲的存在。王廣成等于2005年首次在三疣梭子蟹中發(fā)現(xiàn)了蟹棲擬阿腦蟲，報道了該寄生蟲能引起蟹“纖毛蟲病”，并描述了其危害情況[8]擬阿腦蟲病在三疣梭子蟹越冬期經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，但多因診斷錯誤和和該蟲頻發(fā)而很難根治，造成越冬失敗。該病發(fā)作和流行幾率很大，貫穿親蟹整個越冬階段[9]。</p><p>　　1.4.2 血卵渦鞭蟲病</

34、p><p>　　自1931 年Chatton 等首次報道法國沿岸綠蟹的血卵渦鞭蟲H.perezi 感染以來，至今國內(nèi)外許多地區(qū)均發(fā)現(xiàn)和報道了該寄生蟲病的流行。國外許多地區(qū)包括澳大利亞、阿拉斯加、蘇格蘭、加拿大以及美國東部沿岸等地均發(fā)現(xiàn)和報道了血卵渦鞭蟲H.perezi 感染病的流行[10]。梭子蟹血卵渦鞭蟲病在溫鹽度環(huán)境變化較大的梅雨季節(jié)和臺風季節(jié)，會在短時間內(nèi)出現(xiàn)死亡高峰。</p><p>

35、　　1.4.3 才女蟲病</p><p>　　才女蟲(Polydora spp．)隸屬于隱居目(Sedentaria)，海稚蟲科(Spionidae)，才女蟲屬，系一類量附著在鰓上時，鰓絲變黑甚至腐爛，呼吸困難，用顯微鏡檢查可見鐘形蟲、累枝蟲、斜管蟲等纖毛蟲。水中溶氧量低時，病蟹向淺灘處爬行，最后窒息死亡[11]。</p><p>　　1.4.4 纖毛蟲類病</p><

36、p>　　引起蟹類寄生蟲病的纖毛蟲類病原體包括聚縮蟲，鐘形蟲，單縮蟲，累肢蟲等，此類寄生蟲主要寄生在抱卵蟹的受精卵表面及各個時期幼體的鰓，體表的各個部位[12]。</p><p><b>　　1.5 多病因疾病</b></p><p><b>　　1.5.1 掉腿病</b></p><p>　　趙春民報道，梭子蟹掉腿病

37、的病因是水質(zhì)惡化和細菌(如弧菌和痢疾桿菌等)感染。分為急性型和慢性型兩種，急性型發(fā)生的時間短，一般不超過2 d，親蟹附肢集中脫落2個以上，緊接著發(fā)生大量死亡；慢性型發(fā)生時間較長，貫穿于整個親蟹培育期，附肢逐漸脫落2個以上，親蟹陸續(xù)衰竭死亡。附肢脫落既可能是步足，也可能是螯足，或是步足、螯足同時脫落。急性型死亡率高，大部分會在短時間內(nèi)(一般不超過5 d)全部死亡；慢性型培育前期基本無死亡，中后期死亡逐漸增加，至破膜孵幼期會大量死亡，并且由

38、于親蟹的攝食、活動、自衛(wèi)能力和體質(zhì)下降，受精卵的發(fā)育受到很大的影響，孵出的幼體體質(zhì)弱、攝食能力差，死亡率高，很難培育出高質(zhì)量的蟹苗[13]。</p><p><b>　　1.5.2 蟹鰓病</b></p><p>　　鰓是三疣梭子蟹重要的呼吸器官。海洋環(huán)境污染和養(yǎng)殖生產(chǎn)自身帶來的污染使鰓病成為現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的通病, 鰓病可分為四種，由環(huán)境不良引起的鰓病，由絲狀細菌引起

39、的鰓病，由原生動物引起的鰓病，由絲狀藻類引起的鰓病[14]。由絲狀細菌引起的鰓病中絲狀細菌往往與纖毛蟲等共同附著在三疣梭子蟹的鰓部,影響鰓的呼吸功能,絲狀細菌也可能會分泌毒素對機體產(chǎn)生毒害作用,也稱“黑鰓病”[15]。</p><p>　　1.5.3 “乳化病” (也叫做“牛奶病”)</p><p>　　細菌中以革蘭氏陰性菌對蟹類影響較大，梭子蟹中的乳化病致病菌溶藻弧菌，是海水中的一種常見

40、的條件致病菌, 是近海養(yǎng)殖海洋生物致病的主要病原體之一。發(fā)病癥狀是血淋巴液變?yōu)槿榘咨?，折斷步足可流出大量白色粘液，患病嚴重時肌肉可全部化為粘液，也叫做“牛奶病”[16]。</p><p>　　早在1998年吳友呂等對“乳化病”的流行病學、病原及預防進行了研究，接下來又有不同的學者進行更深入的研究[17]。</p><p>　　2003年開始，王國良等為進一步分析該病的病理變化以及致病機理,

41、 采集大量典型病蟹樣品,對病蟹組織進行病理學研究。他們發(fā)現(xiàn)在乳化腔液涂片中觀察到的大量葡萄牙假絲酵母，只有在具有顯著乳化病癥的病蟹中才能分離到的結(jié)果相一致。說明酵母菌為繼發(fā)性感染,而典型的乳化病癥主要是由這種繼發(fā)感染引起[18]。</p><p>　　2005年許文軍等通過菌體形態(tài)、培養(yǎng)特性及生理生化反應，鑒定該菌為假絲酵母菌。溶藻弧菌和假絲酵母菌兩種病原之間的相互協(xié)同作用,可能是乳化病能在短時間內(nèi)迅速爆發(fā)造成大

42、面積死亡的重要原因之一[19]。通過流行病學調(diào)查、病原分離、感染試驗、組織病理、電鏡觀察以及分子生物學方法研究，許文軍還提出了血卵渦鞭蟲Hematodinium.sp 是近年來引起養(yǎng)殖梭子蟹規(guī)模性死亡 “牛奶病”的重要病原之一[20]。</p><p>　　2 三疣梭子蟹病害的防治</p><p>　　雖然國外已有較多關(guān)于蟹類病害研究的文獻， 但對病害防治的研究報道還特別少，許多傳染性蟹病

43、因缺乏有效的治療措施而長期流行蔓延， 造成了巨大的經(jīng)濟損失。</p><p>　　針對親蟹越冬危害巨大的蟹棲擬阿腦蟲病，王廣成等提出了一系列的預防措施以及治療方法，有鹽度抑制法，“甲醛+抗菌藥”治療法等[21]。王國良等提出由于三疣梭子蟹乳化病的致病機理復雜,且表現(xiàn)出細菌與酵母菌并發(fā)感染的特點,生產(chǎn)上很難直接應用針對性藥物來防治[22]。因此,在養(yǎng)殖生產(chǎn)上應從改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境、控制養(yǎng)殖密度和加強水質(zhì)管理等綜合防治

44、環(huán)節(jié)入手.文登市水產(chǎn)技術(shù)推廣站對蟹病進行監(jiān)測,王世黨等提出了治療對蝦白斑病的措施,把好苗種檢測關(guān),把好蟹池清池關(guān),把好水源關(guān)，把好苗種交叉感染關(guān)[23]。侯傳寶發(fā)現(xiàn)“ 紅圈病”主要發(fā)生在水質(zhì)清瘦的池子, 有單胞藻的池子未見發(fā)生, 因而育苗池培育起一定數(shù)量的有益藻類是預防該病的好措施，并且提出采用新潔爾滅治療“ 紅圈病”是可行的, 有效濃度為10 ppm[24]。許文軍等提出有關(guān)“乳化病”的防治，尚未有較好的方法，采用消毒藥物預防，減少放

45、養(yǎng)密度，改善養(yǎng)殖環(huán)境及各種應激反應，將起到較好的效果[25]。</p><p>　　三疣梭子蟹病害防治應堅持“以防為主、綜合防治”的方針，積極采取有效的防治措施，并自始至終貫徹到各個養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，才能控制疾病的發(fā)生和蔓延。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]　閻斌倫，梁利國，張曉君．三疣梭子蟹主要病害研究進展[

46、J]．水產(chǎn)科技情報，2010(1)：29－37．</p><p>　　[2]　Kazuo Momoyama，Midori Hiraoka，Venegas et al.Pathogenicity of penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV)to juveniles of six crustacean species[C]．4．Symp. on Diseases in Asian Aq

47、uaculture(DAA IV)，Cebu City(Philippines)：1999，22－26 Nov．</p><p>　　[3]　肖國華，趙春龍，崔兆進．三疣梭子蟹人工育苗及養(yǎng)成病害發(fā)生的主要原因及防治方法[J]．齊魯漁業(yè)，2006，23(3)：36－37．</p><p>　　[4]　王亞維． 三疣梭子蟹人工育苗中絲狀菌病和粘污病的防治[M]．養(yǎng)殖技術(shù)，2006(2)：41．

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58、>　　目錄</b></p><p><b>　　1引言2</b></p><p><b>　　2材料和方法2</b></p><p>　　2.1 材料、試劑、設備2</p><p>　　2.1.1 材料2</p><p>　　2.1.2 試劑2&l

59、t;/p><p>　　2.1.3 儀器、耗材3</p><p><b>　　2.2 方法3</b></p><p>　　2.2.1蟹病毒人工感染3</p><p>　　2.2.2病蟹組織超薄切片制作與觀察3</p><p>　　2.2.3 由蟹病組織純化病毒3</p><

60、p>　　2.2.4純化病毒的負染、電鏡觀察4</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析4</b></p><p>　　3.1人工感染后三疣梭子蟹病癥4</p><p>　　3.2 病蟹組織超薄切片的電鏡觀察4</p><p>　　3.3由病蟹組織純化病毒4</p><p>　　3

61、.4病毒致病性（致死性）驗證6</p><p><b>　　4 討論6</b></p><p>　　4.1病毒純化方法6</p><p>　　4.2病毒的致病性7</p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻8</b></

62、p><p>　　摘要：由寧波沿海采集患病三疣梭子蟹，勻漿后過濾，制備病毒勻漿液注射到健康梭子蟹中，同時設置PBS注射對照組。結(jié)果為實驗組全部死亡，對照組無死亡情況。證實此前在自然感染組織中觀察到的球狀病毒對三疣梭子蟹具有強感染力，并且致死性較強。采用差速離心法，由患病三疣梭子蟹組織純化病毒，對純化的病毒進行負染、電鏡下觀察，結(jié)果表明獲得了較純凈的病毒粒子，根據(jù)該病毒的形態(tài)、大小，此病毒疑似呼腸孤病毒。純化的病毒感染健

63、康梭子蟹，實驗組全部死亡，證實純化后病毒完整并且有活力，純化方法有效。</p><p>　　關(guān)鍵詞：三疣梭子蟹；人工感染；純化</p><p>　　Abstract: 窗體頂端</p><p>　　請鍵入文字或網(wǎng)站地址，或者上傳文檔。</p><p>　　Abtracts: Sick Portunus trituberculatus spe

64、cimens were collected from coastal of Ningbo. Infected tissues were homogenated. After filteration, the virus homogenate was injected into healthy crab. Control crab group was injected with PBS. As a result, the experime

65、ntal group were all died while no death appeared in the control group. It confirmed that the spherical virus has strong infectious and lethal effect to P. trituberculatus. The virus were purified from infected crab tissu

66、es by multi-step </p><p>　　顯示對應的拉丁字符的拼音</p><p>　　Keywords: Portunus trituberculatus; Artificial infection; Purification </p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　三疣梭子蟹(

67、Portunus trituberculatus)隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)，廣泛分布于我國沿海，是一種經(jīng)濟價值較高的大型海產(chǎn)經(jīng)濟蟹類[1]。三疣梭子蟹味道鮮美，營養(yǎng)價值極為豐富，是人們非常喜愛的水產(chǎn)品之一，同時也是很重要的出口品種，已逐漸成為我國海水養(yǎng)殖的主導品種之一。浙江省沿海地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，寧波市一帶短短幾年內(nèi)就發(fā)展成了全國聞名的梭子蟹養(yǎng)殖基地。隨著三疣梭子

68、蟹養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖密度不斷增加，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，又因為它受到海洋環(huán)境的污染、養(yǎng)殖生產(chǎn)自身所帶來的污染、養(yǎng)殖技術(shù)水平等多方面的原因制約，三疣梭子蟹在養(yǎng)殖的過程中病害問題日趨突出[2]。各類疾病的發(fā)病率和危害程度有逐年上升的趨勢，并呈現(xiàn)出大規(guī)模發(fā)生和暴發(fā)性流行的趨勢。由于對病原不了解而盲目用藥，導致藥物濫用，不但提高了水產(chǎn)養(yǎng)殖的投入產(chǎn)出比，危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者的經(jīng)濟利益，而且打擊了消費信心，影響到出口內(nèi)銷，嚴重困擾著梭子蟹水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健

69、康發(fā)展［3］。另外由于一些蝦蟹綜合養(yǎng)殖的推廣，一些廣宿主病毒如白斑綜合癥桿狀病毒等也成為侵害三疣梭子蟹的病原</p><p>　　國內(nèi)外已報道的蟹類病毒有：水生呼腸孤病毒[5]、微核糖核酸病毒、藍蟹皰疹病毒、藍蟹螺旋病毒、河蟹顫抖病毒［6］，鋸緣青蟹桿狀病毒［7］，黃頭病毒等。對蟹類病毒的研究多集中在形態(tài)觀察水平上，尚未進行分子鑒定及靈敏檢測方法構(gòu)建[8]。研究發(fā)現(xiàn)蟹類對黃頭病毒YHV具有較高的抵抗力，并不容易感

70、染［9］。</p><p>　　國內(nèi)外有關(guān)三疣梭子蟹病毒研究的文獻極少，對三疣梭子蟹病毒的病原和病理研究也尚不深入。其中以對蝦白斑癥病毒（WSSV）[10]研究相對透徹：國內(nèi)一些研究所通過實時熒光定量PCR測定試驗蟹體內(nèi)各器官中WSSV含量,病理切片觀察瀕死蟹各器官組織病理改變的方法，對WSSV進行了系統(tǒng)的研究。</p><p>　　近年來，梭子蟹養(yǎng)殖中大規(guī)模爆發(fā)性死亡現(xiàn)象時有發(fā)生，至今還

71、未得到微生物學、分子生物學、免疫學的明確鑒定。此類不明病害嚴重威脅著我國梭子蟹蟹類養(yǎng)殖業(yè)。通過對奉化三疣梭子蟹發(fā)生秋季大規(guī)模死亡樣品的病理觀察，發(fā)現(xiàn)組織細胞中存在大量球狀病毒。我們對人工養(yǎng)殖過程中的三疣梭子蟹秋季大量死亡的病樣進行病毒純化，對純化的病毒進行形態(tài)觀察，并用病毒對健康蟹進行人工感染研究，以期為三疣梭子蟹病毒病害快速診斷、防治提供理論與技術(shù)支撐。</p><p><b>　　2材料和方法<

72、;/b></p><p>　　2.1 材料、試劑、設備</p><p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　患病三疣梭子蟹由奉化市池養(yǎng)和灘涂梭子蟹養(yǎng)殖場采集。</p><p>　　梭子蟹及喂養(yǎng)梭子蟹的縊蟶購自寧波水產(chǎn)批發(fā)、零售市場。</p><p><b>　

73、　2.1.2 試劑</b></p><p>　　TNE緩沖液：50 mM Tris-HCl，400 mM NaCl，5 mM EDTA，pH＝7.6;</p><p>　　TM緩沖液：50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，pH 7.6，Tris 6.0578g，MgCl2.6H2O 2.0338g，H2O 1000ml;</p><p>

74、　　0.1mol/lPBS緩沖液：NaCl 8g，KCl0.2 g，Na2HPO4 1.44g，Na2HPO4?12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，H2O 400ml，調(diào)節(jié)pH＝7.6，補水至500ml;</p><p>　　混合蛋白酶抑制劑（PMSF）：用異丙醇配成100mg/ml;</p><p>　　Trizol試劑購自invitrogen，EDTA購置上海生工，青霉素

75、，鏈霉素，Tris-HCl，NaCl，EDTA，MgCl2，25%戊二醛，1%鋨酸，酒精，苯甲酸二丙烯醋，醋酸雙氧鈾一檸檬酸鉛，3%磷鎢酸鉀（PTA）。</p><p>　　2.1.3 儀器、耗材</p><p>　　高速離心機（beckman Avanti J-E由美國貝克曼庫爾特公司制造），低速離心機（D-37520 Dsterode 德國Thermo），超低溫冰箱（Thermo 99

76、1），勻漿機（PT 1600E POLYTRON Made in Switzerland by KENEMATICA/G），過濾器（AP-01P VACUUM PUMP 天津奧特賽思斯儀器有限公司），精密電子天平（JA12002 上海恒平科學儀器有限公司），超薄切片機(RMC POWER TOME XL)、透射電子顯微鏡（日立H－7650），0.45um、0.22um濾膜，濾紙，冰箱，針式濾頭，冰盒，注射針，剪刀，移液槍，覆有Formv

77、ar膜的銅網(wǎng)。</p><p><b>　　2.2 方法</b></p><p>　　2.2.1蟹病毒人工感染</p><p>　　取病蟹組織進行勻漿；勻漿液在4℃下，6000g離心10min；沉淀用少量PBS重新懸浮后再次離心；合并上清，經(jīng)0.45um、0.22um濾膜先后抽濾除雜；用0.22um針式濾器濾頭過濾除菌后按1000IU/ml加入

78、青霉素和鏈霉素；插入冰盒，放4℃病箱過夜，即為攻毒用病毒懸液。</p><p>　　將梭子蟹隨機分為實驗組和對照組，每組四只蟹，對照組注射生理鹽水，實驗組每只由第四步足基部注射0.2ml病毒液并且每日投喂縊蟶，換水，觀察死亡情況。</p><p>　　2.2.2病蟹組織超薄切片制作與觀察</p><p>　　取人工感染發(fā)病的病蟹的鰓、胃和腸組織，切成１mm3的小塊,

79、 按常規(guī)方法經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸雙固定, 濃度梯度酒精脫水，苯甲酸二丙烯醋包埋，聚合。于切片機上制備超薄切片。經(jīng)醋酸雙氧鈾一檸檬酸鉛雙染色，在日立S-3400N電鏡下觀察、拍照并分析。</p><p>　　2.2.3 由蟹病組織純化病毒</p><p>　　取病蟹腮和肌肉，快速剪成碎塊，加200ml預先冰浴過的TNE緩沖液（50 mM Tris-HCl，400 mMNaCl，5 mM

80、 EDTA，pH 7.6）；0℃充分勻漿；緩沖液中添加了1x的混合蛋白酶抑制劑（1mM PMSF）[6]。4℃下6000g離心10min，收集上清，沉淀用TNE重懸，勻漿1min, 6000 g離心10min合并上清。8000g，4℃離心20min,取上清。4℃下35000g離心1.5h，棄部分上清液，將沉淀的上層疏松部分用上清洗掉。下層結(jié)實的略帶白色的部分重懸于1ml的TM緩沖液（50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，

81、pH 7.5）中。TM緩沖液中添加了1mM PMSF。冰浴過夜。4℃下3500g離心5min，去除沉淀。上清在4℃下38000g離心1.5h。將沉淀的上層疏松部分用TM緩沖液沖洗掉。下層結(jié)實的白色的部分即純化的病毒粒子。取少量病毒固定于100ul25%的戊二醛中。</p><p>　　2.2.4病毒純化后的負染以及電鏡觀察</p><p>　　取蟹病組織純化后的病毒懸液，滴一滴此病毒懸液在

82、載玻片上，把覆有Formvar膜的銅網(wǎng)反扣在病毒懸液上，20min后，取下銅網(wǎng)，然后晾干。在病毒懸液中滴加的3%磷鎢酸鉀（PTA）負染5min，用濾紙吸去多余的染液，室溫下風干，在日立H－7650透射電子顯微鏡下觀察。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1人工感染后三疣梭子蟹病癥</p><p>　　實

83、驗組梭子蟹攻毒后全部發(fā)病，病蟹臨死前呈現(xiàn)活力差、四肢無力、肌肉顫抖、食欲差、行動遲緩。腮絲呈黑化趨勢，肝臟部位稍呈紅色，部分步足變紅，個別可見肌肉渾濁，其他臟器肉眼觀察無明顯異常。上述癥狀出現(xiàn)后很快死亡，死亡率100%。對照組梭子蟹沒有出現(xiàn)死亡情況。</p><p>　　3.2 病蟹組織超薄切片的電鏡觀察</p><p>　　將三疣梭子蟹的組織進行超薄切片，在電鏡下可以觀察到在切片中有明顯

84、的病毒粒子的存在。各組織、器官包括腮、腸、肌肉、心臟、肝胰腺、性腺均有感染，其中腸、肌肉、心臟感染嚴重，存在大量病毒，病毒核心直徑約20nm。感染情況及病毒粒子形態(tài)與自然感染一致。</p><p>　　圖1. 人工感染健康三疣梭子蟹超薄組織切片的電鏡觀察圖片</p><p>　　Fig1. Electron micrograph picture of viral particles fro

85、m various tissue of infected health crabs顯示對應的拉丁字符的拼音</p><p>　　3.3由病蟹組織純化病毒</p><p>　　將患病三疣梭子蟹組織勻漿后經(jīng)過兩次差速離心，從患病三疣梭子蟹的組織，主要是內(nèi)臟中提取純化得到了大量病毒，經(jīng)過電鏡負染后可以觀察到大量的病毒粒子，且純度較高。成熟病毒粒子直徑約為60-120 nm，病毒呈球形。</

86、p><p>　　圖2-a　 圖2-b　 </p><p>　　圖2-c 圖2-d</p><p>　　圖2-e 圖2-f

87、 </p><p>　　圖2：純化的病毒粒子的負染電鏡照片</p><p>　　Fig2: Purified viral particles (negative stain)</p><p>　　3.4病毒致病性（致死性）驗證</p><p>　　在人工感染實驗中，我們用純化的病毒對三疣梭子蟹進行注射感染，同時設立對照組，每組四只蟹，在感染發(fā)

88、病的周期內(nèi)，三疣梭子蟹全部死亡，且死亡率高達100%，對照組沒有出現(xiàn)死亡情況。與養(yǎng)殖業(yè)中該病爆發(fā)時蟹群大量快速死亡現(xiàn)象相符，實驗結(jié)果表明，該病毒對三疣梭子蟹具有致病性，且致死率極高。應該引起水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重視。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p><b>　　4.1病毒純化方法</b></p><p&g

89、t;　　為了研究病毒的本質(zhì)并對病毒性疾病進行診斷，必須對病毒顆粒的物理化學性質(zhì)和病毒遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行研究，需要高度純凈的病毒制品并且獲得一定量純病毒顆粒[11]。因而當前迫切任務之一仍是進一步改進病毒提純技術(shù)。目前，從感染動物組織內(nèi)純化病毒的方法，主要有離心法、沉淀法和透析法等，其中超速離心法是應用最為廣泛的一種純化病毒的方法［12］。超速離心法可分為平衡密度梯度離心法和等密度梯度離心法，較常使用的梯度材料有甘油、氯化銫、蔗糖和重水等

90、。氯化銫［13］主要用于平衡密度梯度離心法，其成本很高、價格較貴；蔗糖用于等密度梯度離心法，因為它溶于水，對蛋白質(zhì)和核酸無不良影響，應用相對來說更為普遍。密度梯度離心法［14］雖然是一種常用的病毒純化方法，但是它的缺點是操作復雜并且成本較高。差速離心是利用了不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分步沉淀。病毒純化時離心力的選擇通常是根據(jù)病毒大小

91、、密度來確定的，對于中、大型病毒，在8O000g離心60min，即能沉淀[15]。利用差速離心法提純各種大小的顆粒和病毒是一種有</p><p>　　在純化病毒的工作中，我們必須根據(jù)需要分離的病毒的特點，選擇適宜的純化方法。我們從對三疣梭子蟹分離純化的這種球狀病毒的研究結(jié)果表明，該病毒個體較小，一般的高速離心較難獲得純凈病毒。通過參考文獻[16][17]，我們設計了純化流程。在實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過多次低速離心時去除大

92、部分的組織碎片后，通過調(diào)整病毒純化緩沖液中鹽離子濃度，可以促進病毒的沉降。同時在第一次高速離心后及時更換較低鹽離子濃度的緩沖液，可以更好的保護裸露的病毒粒子，盡量保持病毒粒子的完整性。通過上述方法獲得了較好的病毒純化效果：電鏡下觀察病毒較純凈、結(jié)構(gòu)完整；用純化的病毒對健康蟹進行人工感染，致死率高。用純化的病毒進行核酸分析發(fā)現(xiàn)其為RNA病毒，基因組分節(jié)，為呼腸孤病毒，這進一步表明純化獲得成功，這也是在國內(nèi)外首次在三疣梭子蟹中發(fā)現(xiàn)呼腸孤病毒

93、（另文發(fā)表）。雖然從核酸分析其為呼腸孤病毒，但形態(tài)上該病毒與以往報導的呼腸孤科病毒有較大差異，可能是新病毒。</p><p><b>　　4.2病毒的致病性</b></p><p>　　在人工感染試驗中，對照組未出現(xiàn)死亡。病毒注射感染組，所有個體均成功感染，出現(xiàn)食欲減退甚至停食、反應遲緩等癥狀，且在感染后全部死亡，這與自然狀況下發(fā)病死亡的三疣梭子蟹的情況一致。通過對人

94、工感染實驗的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，此球狀病毒為三疣梭子蟹發(fā)病死亡的病原，而且這種病毒對三疣梭子蟹有很強的致死性，三疣梭子蟹一旦感染這種病毒，經(jīng)過短暫的潛伏期后，快速死亡。由于這種疾病具有潛伏期短，發(fā)病快等特點，使得在該病的防治過程中存在一定的難度。</p><p>　　對感染瀕死個體三疣梭子蟹的組織病理觀察可見，病蟹肝胰腺、肌肉、鰓組織的靶細胞核腫大、變形，并出現(xiàn)以壞死為主的病變，電鏡下可在瀕死蟹的肝胰腺、肌肉等組織細胞

95、中觀察到大量病毒粒子。成熟病毒粒子直徑約為60-120 nm，病毒呈球形。</p><p>　　呼腸孤病毒是蟹類病毒中常見的一種病毒。呼腸孤病毒在鋸緣青蟹、中華絨螯蟹以及河蟹中曾被報道[18－20]。WENG 等[18]報道了一種新的鋸緣青蟹病毒性疾病“睡眠病(sleeping disease)”，病蟹的典型特征是肝胰腺萎縮。2004年5-11月該病在東南沿海福建省和廣東省廣泛流行，致螃蟹的死亡率非常高(在養(yǎng)殖塘

96、中青蟹死亡率接近70%)。WEN G 等通過一系列的實驗證實青蟹類呼腸孤病毒是“睡眠病”發(fā)生的主要病原。該病毒在病蟹的心臟、鰓、肝胰腺和腸細胞等組織中廣泛分布，且在細胞漿中分散分布或呈晶格狀排列。貢成良[19]等在對江蘇等地的患顫抖病的中華絨螯蟹進行研究后發(fā)現(xiàn)，該病的病原為一種球狀病毒，大小約為55nm。經(jīng)核酸電泳后證實該病毒為呼腸孤病毒。陳吉剛[20]等在對浙江省三門縣等地區(qū)患病鋸緣青蟹的組織電鏡切片觀察中發(fā)現(xiàn)大量的呼腸孤病毒，該病毒

97、粒子的大小為60 nm 左右，二十面體對稱，無囊膜。我們的研究發(fā)現(xiàn)，此次三疣梭子蟹中所純化得到的病毒在大小和形態(tài)等方面與已報道的蟹中感染的呼腸孤病毒均類似。在其后對該病毒進行的進一步研究結(jié)果證實了該病毒確實為呼腸孤病毒（另文闡述）。</p><p>　　此次對三疣梭子蟹病害的研究結(jié)果表明，呼腸孤病毒正是浙江地區(qū)三疣梭子蟹爆發(fā)性死亡的致病原，這在國內(nèi)外的三疣梭子蟹病害研究報道中尚屬首次。</p>&l

98、t;p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 丁朋曉, 張連英. 養(yǎng)殖蟹類病害的研究進展[M]. 畜牧與飼料科學, 2010(31): 33－35.</p><p>　　[2] Momoyama K，Hiraoka M，Venegas, et al. Pathogenicity of penaeid rod-shaped DNA viru

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