三疣梭子蟹蛻皮周期中mih表達研究【畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH表達研究</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 生

2、物技術(shù) </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b>

3、</p><p>　　三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH基因的表達錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　引言4</b></p><p><b>　　1材料與方法7</b></p><p><b>　　1.1 材料7</b></p><p>　　

4、1.2 主要試劑7</p><p><b>　　1.3 方法7</b></p><p>　　1.3.1 總RNA提取7</p><p>　　1.3.2 第一鏈cDNA合成7</p><p>　　1.3.4 熒光定量PCR7</p><p><b>　　2 結(jié)果8</b&

5、gt;</p><p><b>　　3．討論12</b></p><p>　　3.1 MIH的作用及其作用機制12</p><p>　　3.2 影響三疣梭子蟹蛻皮的各種因素研究13</p><p>　　3.2.1 激素13</p><p>　　3.2.2 能量13</p>

6、<p>　　3.2.3 其他因素14</p><p><b>　　4.總結(jié)14</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻15</b></p><p>　　摘要：在本次研究中，以實時熒光定量PCR技術(shù)（quantitative real

7、-time PCR, qRT-PCR）相對定量2 - △△Ct方法，對MIH基因表達出的mRNA進行檢測。實驗結(jié)果表明，隨三疣梭子蟹蛻皮周期進行，蛻皮周期中MIH表達水平變化呈一個明確變化的趨勢，從蛻后A期MIH表達量開始上升，直到蛻皮C期達到頂峰，然后慢慢下降到蛻前D3/D4期達到最低，完成一個蛻皮過程，然后進入下一個蛻皮周期。其中以蛻皮周期中的蛻前D0期為對照，采用2 - △△Ct方法計算另外各個蛻皮時期MIH基因mRNA的相對表達

8、量。2 - △△Ct 結(jié)果表示，MIH基因在蛻皮周期中的表達情況，相對對照組蛻前D0期表達量，蛻后A期為0.42±0.08倍，蛻后B期為1.09±0.09倍，蛻皮C期為1.35±0.16倍，蛻前D1期0.78±0.07倍，蛻前D2期為0.27±0.08倍，蛻前D3/4期為0.20±0.04倍。三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH基因表達量的變化差異用SPSS軟件(13.0)中的Denne

9、tt 檢驗法進行分析，蛻皮周期中各個時期的MIH的表達量在(P<0.05)存在顯著性差異的。結(jié)果表明</p><p>　　關(guān)鍵字：三疣梭子蟹；蛻皮；MIH；實時熒光定量PCR</p><p>　　Abstract：The method for the determination of the expression levels of molt-inhibiting hormone m

10、RNA in crustaceans (Portunus trituberculatus,) has been developed using relative quantification of quantitative real-time PCR（ qRT-PCR ）and we will use 2 - △△Ct method to analyze the expression of the mRNA of MIH. The ex

11、perimental results indicated that the expression levels of MIH changed clear tendency with the molt cycle of Portunus trituberculatus progressed, MIH transcripts increased in post-molt </p><p>　　Keywords: Po

12、rtunus trituberculatus; molt; MIH; qRt-PCR</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　三疣梭子蟹隸屬于軟甲綱，是中國沿海重要的大型海產(chǎn)經(jīng)濟蟹類，近年來三疣梭子蟹人工育苗與養(yǎng)成的研究及實踐得到了較快的發(fā)展，但是仍舊面臨著存活率低（平均養(yǎng)殖成活率5%），病害頻發(fā)，養(yǎng)殖產(chǎn)量低，產(chǎn)品品質(zhì)不高等問題。其中當年性早熟現(xiàn)

13、象的危害尤其嚴重，以這種蟹種養(yǎng)殖商品蟹，死亡率高達60%-90%，從而導致養(yǎng)殖規(guī)格下降，效率低下[1]等問題。因此研究甲殼動物蛻皮周期的機制就顯得尤為重要，直接影響著養(yǎng)殖區(qū)域的產(chǎn)量。</p><p>　　在甲殼動物個體發(fā)育過程中，存在蛻皮現(xiàn)象，即蛻去舊的外骨骼并長出新的外骨骼的過程。蛻皮是甲殼動物生長和發(fā)育的標志特征，它貫穿甲殼動物個體發(fā)育的始終，它受神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)[2]。根據(jù)游泳足趾節(jié)末端新舊表皮

14、基線間距與舊表皮厚度的比值（R值）結(jié)合甲殼硬度、解剖后新殼的生長狀況、蛻皮縫的開裂狀況等形態(tài)學特征對三疣梭子蟹蛻皮周期進行了劃分，將蛻皮前期細分為D0、D1、D2、D3和D4五個亞期。</p><p>　　R= 趾節(jié)新舊表皮基線間距（D）/ 舊表皮厚度（C）</p><p>　　從表1中可以看出，蛻皮可以分為蛻殼前(Proeedysis stage，即D期，D0-D4) 、蛻殼期(Molt

15、 stage，即E期)、軟殼期(Soft-shelled stage，即A期)、薄殼期(Papershell stage，即B期) 、硬殼期(Hard stage，即C期，C1 - C4) 5 個時相[3]。</p><p>　　表1 三疣梭子蟹蛻皮周期分期特征描述</p><p>　　Tab.1 Description of molt stages of Portunus tritub

16、erculatus</p><p>　　甲殼動物的蛻皮過程是由眾多激素拮抗控制的，這一點已經(jīng)被大量的研究所證明，而這些激素大部分屬于一種被稱作為CHH（甲殼動物增血糖激素）家族的蛋白家族。研究表明在甲殼動物的眼柄中分泌著各種各樣的神經(jīng)內(nèi)激素[1]，他們中的大部分是在X-器官中合成的并且運送到鼻竇腺，在那里他們釋放到血淋巴之中。其中的神經(jīng)內(nèi)激素，包括甲殼動物增血糖激素（CHH），蛻皮抑制激素（MIH），卵黃生成抑制

17、激素（VIH）和顎器官抑制激素（MOIH），他們彼此都是十分相似的，因而組成了一個被稱為CHH家族的蛋白質(zhì)家族[4-5]。CHH家族中蛋白有著大致相同的蛋白質(zhì)序列，形成了3個穩(wěn)定的二硫鍵保守的6個半胱氨酸殘基，擁有著大概72-78個氨基酸殘基的相似數(shù)量，并且他們分子的重量都處在7000-9500 Da之間。因此，有科學家認為他們是從同一個祖先基因進化而來 [6]。 目前國內(nèi)外對于這類激素的研究主要在基因的獲得以及表達方面，很少能夠把基

18、因的表達與蛻皮的周期變化聯(lián)系起來，目前已經(jīng)得到了美洲黃道蟹 （Cancer magister）、可口美青蟹（Callinectes sapidus）、三葉真蟹（Carcinus mae</p><p>　　其中，對于以三疣梭子蟹為代表的甲殼動物中，蛻皮的過程中由MIH基因編碼的蛻皮抑制激素起著十分重要的作用。但是，目前很少有研究 MIH 基因與蛻皮周期變化之間的關(guān)系，在紅陸蟹（Gecarcinus lateral

19、is）的研究中表明，經(jīng)原核表達的MIH蛋白能對蛻皮過程產(chǎn)生抑制作用，從而對其蛻皮調(diào)控產(chǎn)生影響[9]。有研究者以Northern Bolt的方法對可口美青蟹蛻皮周期中MIH mRNA水平變化進行了測定分析，發(fā)現(xiàn)在蛻皮前期MIH的mRNA水平逐漸降低，蛻皮以后MIH的水平突然升高，在蛻皮期間持續(xù)升高，這在mRNA水平證實了MIH的生理功能[10]。MIH的靶器官是Y-器官，新產(chǎn)生的MIH通過抑制已形成的Y-器官的合成和分泌蛻皮激素，起到抑制

20、蛻皮的作用[11]。MIH通過和受體結(jié)合，激活了位于細胞膜上的腺甘酸環(huán)化酶而提高細胞內(nèi)cAMP水平，或是激活了位于細胞膜上的鳥甘酸環(huán)化酶而升高細胞內(nèi)cGMP水平，cAMP(或是cGMP)進而激活蛻皮激素生成途徑上的一種起重要負調(diào)控作用的激酶，進而抑制Y-器官蛻皮酮的合成，使甲殼動物體內(nèi)蛻皮激素保持在較低水平[12]。</p><p>　　MIH基因有6個半胱氨酸殘基在嚴格的保守區(qū)域存在（圖1），有這6個半胱氨酸（

21、Cys7–Cys44， Cys24–Cys40和 Cys27–Cys53）組成的二硫鍵對于維持其分子結(jié)構(gòu)起著十分重要的作用[13]。其他的存在于MIH及MIH類似片段的一些保守的殘基基本上分布在12，13，19，20，48，56，59，61，62，69，72，73和76位處。對于MIH基因而言，其N末端比C末端顯得更加保守，C末端一般被修飾或自由存在，而N末端經(jīng)常是游離的。一般情況下，對于MIH基因的檢測，我們通常采用cDNA序列分析的

22、方法，而已知的一些CHHⅠ家族的序列也能夠給予我們一些關(guān)于MIH基因序列的借鑒，但是最近的研究證明關(guān)于MIH分子的一些特征在CHHⅡ家族的分子中也有所體現(xiàn)。通過對于MIH基因的cDNA序列進行分析研究表明，發(fā)現(xiàn)cDNA包含210 bp的5 ’端非編碼區(qū)、342 bp的編碼區(qū)和1020 bp的3’ 端非編碼區(qū)。</p><p>　　圖1 多種MIH基因的生物信息學比對</p><p>　　

23、Fig 1 Bioinformatics comparison of various MIH genes</p><p>　　注：6個半胱氨酸殘基已經(jīng)用*標出，通過對Chf-MIH，Mee-MIHA， Mee-MIHB， Pem-MIH1， Pem-MIH2， Pem-SGP-C1， Pem-SGP-C2， Live-MIH1,和 Liv-MIH2的分析，內(nèi)含子的部分已經(jīng)用↓標出。</p><

24、;p>　　3’端非編碼區(qū)包含一個保守的加尾信號（AATAAA），距離下游的Poly (A)12 bp。編碼區(qū)序列編碼113個氨基酸，包括35個氨基酸組成的信號肽和78個氨基酸組成的成熟肽[8]。MIH基因的序列，目前在國內(nèi)外已經(jīng)被研究的比較清楚，朱冬發(fā)等通過cDNA的克隆與序列分析等方法對其進行了比較系統(tǒng)的研究[8]。雖然如此，但是很少有人去研究MIH在蛻皮周期中各個分期時的分泌情況，因此本次試驗擬以此為研究目標，希望能夠為以后的

25、研究者提供借鑒，并對于甲殼動物在蛻皮周期中可能出現(xiàn)的一些癥狀進行判斷。</p><p><b>　　1材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 材料</b></p><p>　　從海里捕撈新鮮的三疣梭子蟹，暫養(yǎng)于寧海得水育苗場。根據(jù)Drach 和Tchernigovtzeff（1967）劃分把蛻皮周期標準：為

26、蛻殼前期（Proeedysis stage，即D期，D0 - D4） 、蛻殼期（Molt stage，即E期）、軟殼期（Soft-shelled stage，即A期）、薄殼期（Papershell stage，即B期） 、硬殼期（Hard stage，即C期，C1 - C4）5 個時相，選取生長旺盛體重在40-80 g之間，頭胸甲寬為8 - 12 cm之間的三疣梭子蟹，采集蛻皮周期中各個時期的眼柄 X 器-竇腺復合體，迅速保存于液氮中。

27、</p><p><b>　　1.2 主要試劑</b></p><p>　　DEPC（RNase Free），Trizol，購自Sangon公司(加拿大) ；引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司（Invitrogen）完成；DNase I（RNase Free），PrimeScript RT reagent Kit，SYBR Premix Ex Taq II，試劑盒均購

28、自Takara公司（日本）。</p><p><b>　　1.3 方法</b></p><p>　　1.3.1 總RNA提取 </p><p>　　按 Trizol 試劑說明書提取相同時期 8 個 X 器-竇腺復合體 Total RNA，Total RNA經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，紫外分光光度計進行純度分析。提取 Total RNA

29、 后，再使用 DNase I 分解混入的基因組DNA，最后進行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等純化 Total RNA。</p><p>　　1.3.2 第一鏈cDNA合成 </p><p>　　每個Total RNA樣品取1.0μg，5×PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL，Oligo（dT） Primer

30、（50μmol/L）0.5μL，Random 6 mers（100μmol/L）0.5μL，RNase Free dH2O ，補足10 μL。具體操作參照PrimeScript RT reagent Kit說明書。</p><p>　　表 2 內(nèi)參基因與目的基因的引物序列</p><p>　　Table 2 Primer sequences for internal control gen

31、es and targeted genes</p><p>　　注:A:產(chǎn)物大小(bp) Note: A: Product size (bp)</p><p>　　1.3.4 熒光定量PCR </p><p>　　熒光定量PCR在Mastercycler ep realplex real-time PCR (Eppendorf)上完成，25 μL PCR的反應體

32、系包括SYBR Premix Ex Taq II(2×)緩沖液12.5 μL，正向和反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL（參見表2）。cDNA模板1 μL，dH2O 10.5 μL。程序采用三步法：為95 ℃ 30 s （1個循環(huán)），隨后進行40個循環(huán)，每一循環(huán)包括，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s。PCR結(jié)束后對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析，以確保特異性擴增，條件是95 ℃ 30 s，55 ℃

33、s，95 ℃ 15 s（1個循環(huán)）從55 ℃上升到95 ℃的過程耗時20min。</p><p>　　1.3.5 相對定量 </p><p>　　相對定量采用 2- △△Ct 方法，△△Ct =（Ct 目的基因 –Ct 管家基因）實驗組-（Ct 目的基因 –Ct 管家基因）對照組 ，計算實驗組目的基因的相對表達量。本實驗研究三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH表達變化，18S rRNA用于內(nèi)參基

34、因。為保證熒光定量PCR 結(jié)果的準確性，每一個樣品重復分析3次，包括目標基因（MIH）和內(nèi)參基因（18S rRNA）。熒光定量的結(jié)果采用儀器自帶程序讀取，三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH基因表達的變化差異用 SPSS 軟件（13.0）中的 Dunnett 檢驗法進行分析，以P < 0.05為顯著性差異，試驗結(jié)果均以平均值 ± 標準差（M ± SD）的形式表示。</p><p><b>

35、;　　2 結(jié)果</b></p><p>　　以三疣梭子蟹蛻皮周期中各個時期的 X 器-竇腺復合體為材料提取總RNA，在本次實驗中我們進行Genomic DNA污染的去除，因為此方法可以有效的獲得MIH基因的總RNA，并且可以通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，部分總RNA提取后的電泳結(jié)果見圖2。通過這種方法，我們獲得的總RNA濃度為：300~1000ng/μl，它在260nm和280nm處得吸光值的比值為1.80

36、~2.05。</p><p>　　圖2 提取RNA的瓊脂糖凝膠電泳分析</p><p>　　Fig2 Agarose gel electrophoresis analysis of mRNA </p><p>　　提取的總 RNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈直接用做熒光定量RT-PCR的模板，進行 RT-PCR 反應（圖 3），結(jié)果顯示，內(nèi)參基因達到所需熒光閾值

37、的 ct 值遠遠小于MIH 基因所需的 ct 值。因此可知，在三疣梭子蟹整個蛻皮周期中 MIH 基因的表達有著顯著的變化，相比較于內(nèi)參基因更是有著顯著的差異。對于得到的結(jié)果進行溶解曲線分析，發(fā)現(xiàn) MIH 基因與18S內(nèi)參基因有著顯著差異的兩個峰（圖 4），內(nèi)參基因在前，MIH基因在后，兩者達到峰值所需的溫度不同，內(nèi)參基因達到最高點的問題約為84±0.1 ℃，而MIH基因到達最高點的溫度約為86.7±0.1 ℃。兩者的

38、峰值均比較顯著，表示通過 RT-PCR 得到的產(chǎn)物純度比較高，沒有引物二聚體和其它非特異擴增產(chǎn)物的干擾，因此實驗結(jié)果比較理想。在電泳條件下對于得到的產(chǎn)物進行驗證，得到的MIH 的條帶 約為370bp，18s RNA 內(nèi)參條帶為110bp，均在可接受范圍之內(nèi)，符合預期目標，同時又一次驗證，得到的兩個片段純度較高（圖 5）。</p><p>　　圖 3 對于MIH和18S內(nèi)參基因進行RT-PCR分析，二者的表達量顯

39、著差異。</p><p>　　Fig 3 The RT-PCR analysis of MIH and 18S Reference gene which has a significant difference</p><p>　　其中以蛻皮周期中的蛻前 D0 期為對照，采用2 - △△Ct方法計算各個蛻皮時期 MIH 基因 mRNA 的相對表達量。qRT-PCR 實驗表明（圖3），三疣梭

40、子蟹蛻皮周期中各個時期 MIH 基因mRNA表達量差異性顯著（P<0.05），在整個蛻皮階段MIH 基因 mRNA 的變化趨勢還是比較明顯的，隨著蛻皮行為的接近，MIH 基因 mRNA 表達量有所波動，但是整體上還是基本處于逐漸降低的趨勢，蛻皮行為結(jié)束后MIH基因 mRNA 表達量逐漸升高到蛻皮C期達到頂峰，然后又慢慢下降開始新一輪的蛻皮行為（圖6）。</p><p>　　圖4 Real time PCR

41、 實驗結(jié)果溶解曲線分析</p><p>　　Fig 4 RT-PCR melting curve analysis of experimental results</p><p>　　圖5 對于產(chǎn)物進行電泳條件下驗證</p><p>　　Fig 5 Authentication of product On the conditions of the elect

42、rophoresis</p><p>　　圖6 實時熒光定量PCR分析研究三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH基因mRNA表達變化</p><p>　　Fig 6 qRT-PCR analysis of Molt cycle portunus MIH gene mRNA expression</p><p>　　本實驗應用熒光定量 PCR 技術(shù)研究三疣梭子蟹蛻皮周期中 M

43、IH 基因 mRNA 表達變化經(jīng)過統(tǒng)計學分析，差異性較為顯著，結(jié)果符合要求（表3）。與 Kara J. Lee 等（1998）用 Northen blot 方法對可口美青蟹蛻皮周期中MIH mRNA 水平變化進行測定的方法所得出的結(jié)論，從蛻皮周期 MIH mRNA 水平變化并沒有很大的差異，基本規(guī)律還是一致的。</p><p>　　表 3 三疣梭子蟹蛻皮周期中各個時期 MIH 基因 mRNA 表達量差異性顯著，蛻

44、前 D0 期為對照組。</p><p>　　Table 3molt-inhibiting hormone mRNA expression Significant differences during the molt cycle of the Portunus trituberculatus, the control group D0</p><p><b>　　3．討論<

45、/b></p><p>　　3.1 MIH的作用及其作用機制</p><p>　　經(jīng)過試驗中觀察到的結(jié)果可知，在蛻皮周期中，其進程的變化中一直伴隨著 MIH 基因表達量的波動。在進入蛻前 D0 期后，MIH基因的表達逐步的降低，蛻皮行為結(jié)束后 MIH 基因 RNA 的表達量逐步的升高，直到蛻皮C 期達到頂峰。這說明了，蛻皮抑制激素對于甲殼動物的蛻皮有著明顯的調(diào)節(jié)作用的，在蛻皮周期中，

46、 MIH mRNA 水平在蛻皮前期穩(wěn)定下降，達到一個最小值后，在蛻皮后期上升，在蛻皮間期一直保持上升水平，正好與血淋巴中蛻皮激素的水平成負相關(guān)[14]。國內(nèi)外相關(guān)方面的研究中曾經(jīng)證明，切除眼柄可縮短蛻皮間期，促進蛻皮，從而推測眼柄中存在某種蛻皮抑制因子，隨后其他人發(fā)現(xiàn)切除眼柄不僅可以促進蛻皮，還可產(chǎn)生其他一系列顯著的生理變化。Okumura 等對日本囊對蝦（Kuruma Prawn）的研究發(fā)現(xiàn)，通過在蝦蛻皮間期注射具有生物活性的重組MI

47、H蛋白，日本囊對蝦的蛻皮C 期由（9.0 ± 0.4）d延長到（9.5 ± 0.5）d，而且血淋巴中蛻皮激素的含量從（1.94±1.09）ng下降到（1.28 ± 0.39）ng。這一結(jié)果表明，MIH基因表達過量可以延長日本囊對蝦的蛻皮間期并且抑制Y器蛻皮</p><p>　　MIH 控制甲殼動物的蛻皮，在蛻皮間期血淋巴中高水平的 MIH 抑制Y-器官的蛻皮酮的合成和釋放，

48、因此，MIH 在蛻皮周期的多數(shù)時間內(nèi)抑制 Y 器官的活動．只有當 MIH的分泌量減少或停止時蛻皮現(xiàn)象才會發(fā)生。MIH 能抑制甲殼動物蛻皮是由于它能顯著抑制Y-器官分泌蛻皮激素．體外培養(yǎng)試驗結(jié)果充分證明了這一點：將眼柄抽提物加人體外培養(yǎng)Y-器官的培養(yǎng)液中，Y-器官的分泌功能大大降低[16]。</p><p>　　一般認為 MIH 的受體主要有兩種可能：一種認為受體是鳥甘酸環(huán)化酶，而另一種是G蛋白偶聯(lián)受體。組織表達研

49、究表明 CsGC-YO1 在 Y 器以及其他組織中都有所表達，因此認為這種cDNA編碼MIH受體，將抗 CsGC-YO1的抗體結(jié)合到Y(jié) 器的膜蛋白上，表明 CsGC-YO1的免疫學活性嚴格位于細胞外圍區(qū)域，而并沒有出現(xiàn)在細胞質(zhì)或是在核內(nèi)，這就表明 CsGC-YO1是一個膜關(guān)聯(lián)蛋白。而受過抗體處理的Y器中，MIH對于蛻皮的抑制作用受到抑制；而且，利用實時定量 PCR 對 CsGC-YO1的含量進行測定，發(fā)現(xiàn)其在蛻皮間期含量上升，而進入蛻皮

50、前期含量下降。這些結(jié)果也表明 CsGC-YO1 即為MIH受體 [17]。</p><p>　　而有些研究者卻認為G蛋白偶聯(lián)受體是 MIH 的受體，Han等通過對普通濱蟹的研究發(fā)現(xiàn)，Y器中蛋白質(zhì)的分泌受G蛋白偶聯(lián)受體的調(diào)控；用霍亂毒素活化G蛋白，可以通過抑制蛋氨酸與Y器的結(jié)合，從而顯著減少 Y 器蛋白的分泌量[18]。Lee 等在對于側(cè)向地蟹的研究中發(fā)現(xiàn)了GC蛋白的三種構(gòu)型，分別是對于NO敏感的含有β亞基的GC蛋

51、白（Gl-GC-Iβ），膜受體GC蛋白 （Gl-GC-II），以及對于NO不敏感的可溶性GC蛋白（Gl-GC-III）。他們對切除眼柄后Y器中三種GC蛋白mRNA水平進行觀測，發(fā)現(xiàn)Gl-GC-Iβ和Gl-GC-III表達水平上升，而Gl-GC-II水平不變。他們認為這是由于動物血淋巴組織對于眼柄神經(jīng)肽含量過低的一種補償[19]。MIH能夠促使Y器中cGMP含量的大量增加，而NO合酶在Y器中的磷酸化表明，由MIH引起的cGMP的大量增加是

52、由NO敏感的GC調(diào)控。這也證明了細胞內(nèi)GC -Ⅰ參與了細胞調(diào)控[20-21]。</p><p>　　3.2 影響三疣梭子蟹蛻皮的各種因素研究</p><p><b>　　3.2.1 激素</b></p><p>　　如本次試驗中所證實的那樣，MIH對于三疣梭子蟹的蛻皮有著重要的調(diào)控作用，但不僅僅只與 MIH 一種激素有關(guān)，事實證明三疣梭子蟹的蛻

53、皮是由多種激素共同起作用完成的。甲殼動物的蛻皮是受多激素系統(tǒng)調(diào)控的，但是卻受蛻皮激素的直接調(diào)控[22]。在十足類甲殼動物成體，蛻皮周期的蛻皮間（C 相）附肢自切將使蛻皮加速，并伴隨著附肢的快速再生,而且這種效應還與自切和再生的附肢數(shù)目相關(guān)；在蛻皮周期的D0-D1相后的自切不會引起再生，也不會延期蛻皮；在D0-D1相前的自切會稍微延長蛻皮周期，而附肢再生也很快完成：射肢的再生包括肢芽的生長和蛻皮前的快速生長相兩個過程，而第二個過程是與激素

54、控制的蛻皮復雜地結(jié)合在一起的。附肢自切和再生對幼體蛻皮影響的報道較少．泥蟹大眼幼體和仔蟹都具有附肢再生的能力，附肢開始再生的數(shù)目與自切的附肢數(shù)及自切發(fā)生在蛻皮周期的哪一時相有關(guān)；自切而沒有再生的個體呈現(xiàn)了蛻皮加快的趨勢；蛻皮周期的延長至少部分地與附肢的再生抑制了YO蛻皮酮的合成有關(guān)[23]，從而對蛻皮周期的各時相進行重新調(diào)整；這種YO蛻皮酮合成的抑制是非眼柄因子或MIH調(diào)控的，可能是附肢神經(jīng)，或胸部神經(jīng)節(jié)，或頭部食道下神經(jīng)節(jié)的</

55、p><p><b>　　3.2.2 能量</b></p><p>　　能量對于甲殼動物幼體的發(fā)育起著十分重要的作用，食物中的一些能夠積儲能量的物質(zhì)如甾類化合物以及長鏈的不飽和的脂肪酸是與蛻皮周期分泌調(diào)控作用息息相關(guān)的重要外源性的因子，能量和一些重要物質(zhì)一樣同樣與蛻皮周期中的關(guān)鍵點有關(guān)聯(lián)。Anger 和Dawirs[24] 從幼體能學研究提出飽和儲存點（Point of R

56、eserve Saturation , PRS）和不可恢復點（Point of No Return , PNR）兩個概念,解釋幼體蛻皮的能量調(diào)控。PRS 是蛻皮或孵化后就給予餌料，到蛻皮周期的某一點，此時幼體積累了足夠的能量儲備（或營養(yǎng)），允許蛻皮進入下一個蛻皮周期，而無論此點后有無餌料供應； PNR 是蛻皮或孵化后就饑餓到蛻皮周期的某一點，即使再給餌料幼體也無法蛻皮進入下一個蛻皮周期。PRS 和PNR 是幼體蛻皮周期內(nèi)的兩個關(guān)鍵點，而

57、餌料是蛻皮啟動的主要限制因子。有些研究者對于濱蟹和蛤蟆蟹從孵化到PRS50 的生物量進行控制，實驗組相較于對照組的 62 % 和 62 % - 69 %，即使在不再供應能量的情況下，仍然大概有一半的幼體可以順利的發(fā)育。幼體剛孵化或剛蛻皮就饑餓達到PNR ,</p><p>　　3.2.3 其他因素</p><p>　　溫度在甲殼動物的蛻皮周期中起著十分重要的作用，不僅僅對于蛻皮周期的長短以

58、及蛻皮的啟動有影響，甚至還有影響到幼體期的發(fā)育期數(shù)，當外界溫度超過 30 ℃ 時，長臂蝦沒有第四幼體，也就是所說的后期幼體，而在低溫17 - 20 ℃ 時候，長臂蝦幼體的發(fā)育被延長，對于三疣梭子蟹蛻皮周期中溫度的影響，至今沒有看到有關(guān)方面的具體報道。</p><p><b>　　4.總結(jié) </b></p><p>　　本次試驗主要采用實時熒光定量 PCR 技術(shù)進行的，

59、通過對于 MIH 表達過程中mRNA 的測定我們基本上得到了與預期一致的結(jié)果，得到了關(guān)于MIH基因表達與蛻皮周期變化的量上的一致性，與其他的研究者的成果比較還是比較接近的，得出的變化趨勢基本一致，但是也存在細微的差異。與 Kara J. Lee等研究報道存在差異主要是在蛻皮后期A，B期，同樣與本實驗室后續(xù)利用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS / MS）法測定三疣梭子蟹血淋巴中蛻皮激素所得出的結(jié)論在蛻皮后期 A，B 期存在不是完全

60、相互拮抗的差異。上述MIH表達量的差異：與 Kara J. Lee 等應用 Northern blot 方法對可口美青蟹蛻皮周期中MIH mRNA水平變化進行測定的方法所得出的所得出的實驗數(shù)據(jù)相比，物種差異性是一方面原因，另外本文采用的是未發(fā)育的三疣梭子蟹在蛻皮周期中本身分泌的MIH含量可能也會有所差異。而另外一方面因素在于測定方法的不同，本文應用熒光定量PCR測得的數(shù)據(jù)使用相對定量 2- △△Ct 方法計算得出結(jié)論會有所誤差，但是在能

61、夠接受的范圍[25]。 而相對于Kara J. Lee等應用North</p><p>　　在解剖三疣梭子蟹的過程中，我們發(fā)現(xiàn)在蛻皮后期 A，B 期的三疣梭子蟹體內(nèi)含水量較高，體積比蛻皮前增加 30 - 40 %，剛蛻完殼的軟殼蟹處于蛻后 A 期，繼續(xù)吸水，身體柔軟，此階段一般持續(xù)2~3個小時。蛻皮后4 - 30 小時的梭子蟹進入蛻后 B 期，水分較蛻后 A 期明顯減少，表面粗糙，背甲邊緣變硬，腮區(qū)、心區(qū)稍軟。這

62、些因素可能導致采集的樣品 MIH的表達量會有所下降，最后通過熒光定量PCR分析時，會呈現(xiàn)與 Kara J. Lee等所測得的實驗數(shù)據(jù)相比時存在差異，同時與本實驗室通過高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS / MS）法所測得實驗數(shù)據(jù)成不完全拮抗。理論上是蛻后 A 期MIH 的表達量達到最高，隨后慢慢下降，但是在實際的操作過程，通過熒光定量 PCR分析所得出的結(jié)論，卻是蛻后 A 期 MIH 的表達量沒有達到最高，比蛻前 D3 / D4

63、期MIH的表達量高出一點。隨著進入蛻后 B 期，梭子蟹體內(nèi)的水分慢慢減少，從而MIH的表達量上升。最后進入蛻皮C期，梭子蟹體內(nèi)的多余的水分完全排除，從而致使MIH的表達量達到最高。究竟以上原因會給實驗數(shù)據(jù)造成多大的誤差，需要進一步比對試</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 劉昌杰，侯艷麗，王緯等．蝦池養(yǎng)殖三疣梭子蟹當年性早熟初報[

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