大彈涂魚(yú)、彈涂魚(yú)的線粒體coi基因差異及系統(tǒng)發(fā)育【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　大彈涂魚(yú)、彈涂魚(yú)的線粒體COI基因差異及系統(tǒng)發(fā)育</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí)

2、 水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄<

3、;/b></p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1材料與方法1</b></p><p>　　1.1 樣品采集1</p><p>　　1.2 基因組DNA提取1</p><p>　　1.3 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定1</p&g

4、t;<p>　　1.4 基因序列信息的收集2</p><p>　　1.5 基因序列的分析2</p><p><b>　　2結(jié)果與分析2</b></p><p>　　2.1 大彈涂魚(yú)、彈涂魚(yú)COI基因序列特征及變異2</p><p>　　2.2 種間及種內(nèi)的遺傳距離4</p><

5、p>　　2.3 蝦虎魚(yú)科分類及其分子系統(tǒng)樹(shù)5</p><p><b>　　3討論6</b></p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)7</b></p><p>　　摘要：本研究探討將蝦虎魚(yú)科魚(yú)類線粒體COI基因作為DNA條形碼在物種鑒定上應(yīng)用的可

6、行性。采集蝦虎魚(yú)科中的大彈涂魚(yú)(B.pectinirostris)和彈涂魚(yú)(P.cantonensis)各6尾，從其肌肉抽提DNA，然后PCR擴(kuò)增線粒體COI基因，純化并測(cè)序。研究中獲得了這2種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類長(zhǎng)度約為650bp的COI基因序列。該序列與GenBank下載的其它12種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類的COI基因序列，經(jīng)ClustalX輔助校正，采用MEGA軟件以Kimura-2-parameter計(jì)算出種間及種內(nèi)距離，并基于NJ和MP法構(gòu)建出1

7、4種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類分子系統(tǒng)樹(shù)。大彈涂魚(yú)和彈涂魚(yú)種內(nèi)遺傳距離分別為0.002和0.008，而14種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類種間平均遺傳距離為0.224。在分子系統(tǒng)樹(shù)上，14個(gè)種均可形成單系，其中背眼蝦虎魚(yú)亞科的大彈涂魚(yú)和青彈涂魚(yú)間的遺傳距離較大彈涂魚(yú)和彈涂魚(yú)的小，所以在系統(tǒng)發(fā)育上大彈涂魚(yú)屬與青彈涂魚(yú)屬間的親緣性比大彈涂魚(yú)屬與彈涂魚(yú)屬間的親緣性高。</p><p>　　關(guān)鍵詞：大彈涂魚(yú)；彈涂魚(yú)；COI基因；系統(tǒng)發(fā)育</p&g

8、t;<p>　　Abstract: In this study, we discussed the validation of COI gene sequence to efficiently identify the species of genus Gobiidae. B.pectinirostris and P.cantonensis of Gobiidae species were collected each s

9、ix one for this study, their genomic DNAs was extracted from muscle, and the mitochondial COI gene fragments were amplifies with PCR. After purification, the amplifie d products were sequenced. The experimental results s

10、howed that a gene fragment of this two species with molecular size about 65</p><p>　　Key words: Boleophthalmus pectinirostris; Periophthalmus cantonensis; Cytochrome oxidase subunit I (COI); Phylogenesis<

11、/p><p><b>　　引言</b></p><p>　　蝦虎魚(yú)科（Gobiidae）屬鱸魚(yú)目，蝦虎魚(yú)亞目。蝦虎魚(yú)科魚(yú)類的特點(diǎn)是身體細(xì)長(zhǎng)，有兩條脊鰭，大多數(shù)蝦虎魚(yú)科魚(yú)類前鰭化為吸盤，可于岸邊爬行，如：彈涂魚(yú)，大彈涂魚(yú)。該科魚(yú)類分布于全世界，一共大約有800多種，它們大多棲息于熱帶的海水中，是一種體型較小的食肉魚(yú)類。</p><p>　　當(dāng)前，已經(jīng)

12、有很多人研究過(guò)COI基因序列作為DNA barcode用于系統(tǒng)分類及物種鑒定上的的應(yīng)用(王中華等，2010；肖武漢等，2000；許守明等，2009)。雖然因?yàn)樯婕熬€粒體的進(jìn)化歷史、遺傳特性和物種成種時(shí)間的默認(rèn)前提使得利用COI基因作為DNAbarcode并非完全成立，但是細(xì)胞色素C氧化酶1號(hào)基因（COI）的部分序列是目前在動(dòng)物中最適用的DNA barcode（柏干榮等，2003；李鐵華等，2003；李連之等，2001）。且隨著標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)

13、的建立，基于COI基因的DNA barcode在生物分類學(xué)和生態(tài)學(xué)中將得到廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，在魚(yú)類、昆蟲(chóng)、鳥(niǎo)類等動(dòng)物的鑒別分類研究中COI作為掃描生命的條形碼已被廣泛用到。</p><p>　　現(xiàn)今，因?yàn)镃OI條碼序列獲取很便捷，廣泛適用硬骨魚(yú)類物種鑒別，并可用于低級(jí)分類階元的系統(tǒng)進(jìn)化分析（劉楚吾等，2009；關(guān)申民等，2008），如：由青石斑魚(yú)COI與線紋刺尾鯛COI同源性很高，可判斷青石斑魚(yú)與線紋刺尾鯛親緣性

14、很高（施大衛(wèi)等，2009）；采自東海的銀鯧、翎鯧和中國(guó)鯧3種鯧屬魚(yú)類的線粒體COI基因序列片段進(jìn)行研究，能從分子水平研究中國(guó)東海海域鯧屬魚(yú)類的分類、遺傳關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化，以其了解鯧屬魚(yú)類以及與鯧科之間的親緣關(guān)系，又為鯧屬魚(yú)類保護(hù)生物學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化提供分子生物學(xué)依據(jù)（張鳳英等，2008）；Hebert等（2003b)對(duì)動(dòng)物界11個(gè)門13320個(gè)物種的研究結(jié)果顯示，線粒體COI基因(細(xì)胞色素氧化酶亞基1)靠近5 端的一段序列能夠?qū)?dòng)物界的物種進(jìn)

15、行有效的鑒定，并且在多數(shù)動(dòng)物類群中，COI基因都存在顯著的序列變異。彭居俐等（2009）研究了基于線粒體COI基因序列的DNA條形碼在鯉科鲌屬魚(yú)類物種鑒定中的應(yīng)用。目前，對(duì)動(dòng)物界物種進(jìn)行DNA條形碼研究所通常選擇的基因就是COI基因。因此，雖然現(xiàn)在對(duì)于用COI基因片段作為魚(yú)類分類鑒定的DNAbarcode研究還比較少，但魚(yú)類資源保護(hù)日益</p><p>　　本研究將通過(guò)對(duì)大彈涂魚(yú)、彈涂魚(yú)及另外12種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類C

16、OI基因序列的分析研究，從而分析大彈涂魚(yú)與彈涂魚(yú)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，并總結(jié)出14種蝦虎魚(yú)科的基因序列的差異，進(jìn)而為以后基于COI基因的DNAbarcode在魚(yú)類物種鑒定的研究奠定基礎(chǔ)，為魚(yú)類分類學(xué)及生態(tài)學(xué)的發(fā)展提供參考。</p><p><b>　　1材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 樣品采集</b></p>&l

17、t;p>　　本研究使用的大彈涂魚(yú)、彈涂魚(yú)各6個(gè)個(gè)體，大彈涂魚(yú)采集自浙江省寧?？h，而彈涂魚(yú)采集自浙江省慈溪市杭州灣。從其各取背部肌肉組織樣品放入液氮中過(guò)夜后，于－80℃保存?zhèn)溆茫P(guān)飛等，2007；陳虹等，2003；Gasse R B et a1.,1999）。</p><p>　　1.2 基因組DNA提取</p><p>　　取樣品背部肌肉100mg加液氮研磨，加500μL裂解液、20

18、μL蛋白酶K、1μLRNA酶，在55℃水浴至完全溶解。加等體積飽和酚，輕輕混勻于4℃、12000rpm離心20min后，小心移取上清液于新的滅菌離心管中，再加入等體積（500μL）酚二氯仿二異戊醇（25:24:1），混勻于4℃，12000rpm離心15min，再移取等體積（500μL）氯仿二異戊醇（24:1）上下顛倒混勻后于12000rpm離心15min。移取上清液，取剩余液的1/10體積（50μL）加入3M的NaAC和2倍體積（100

19、0μL）預(yù)冷的無(wú)水乙醇(－20℃)于－20℃冰箱過(guò)夜。24h后，4℃，10000rpm離心15min，棄上清液，然后加入70％酒精1mL反復(fù)洗滌，沉淀再次離心15min。將沉淀于放置至無(wú)酒精味。最后用適量的溶液TE溶解，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　1.3 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定</p><p>　　PCR擴(kuò)增的目的片段是COI基因靠近5’端的長(zhǎng)度為650左右的序列。其擴(kuò)增和

20、測(cè)序引物參照文獻(xiàn)(Ward et al.,2005)，由上海生工合成，引物序列為：F1：TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATTGGC AC; F2：TCG ACT AAT CAT AAA GAT ATCGGC AC;PCR反應(yīng)使用的每一樣品擴(kuò)增體積為50μL，其中無(wú)菌水17.5μL，引物各2.5μL，TAE緩沖液25μL，DNA模板2.5μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃ 5min，變性94℃ 30s,退火54℃ 30

21、s，延伸72℃ 30s，最后延伸72℃ 10min，保溫4℃。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％ 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送至Invitrogen公司完成測(cè)序工作。</p><p>　　1.4 基因序列信息的收集</p><p>　　除本研究所檢測(cè)的2種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類彈涂魚(yú)和大彈涂魚(yú)外，從 GenBank 下載12種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類及烏塘鱧科的烏塘鱧（Bostrychus sinensis）的COI

22、基因序列。利用本研究的2種蝦虎魚(yú)科和這另外的12 種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類的COI基因同源序列一起分析研究，將同為蝦虎魚(yú)亞目的烏塘鱧科烏塘鱧的COI基因同源序列用作外群（楊天燕等，2007；柳淑芳等，2010）。所分析物種的COI基因及其相關(guān)信息見(jiàn)表1。</p><p>　　1.5 基因序列的分析</p><p>　　獲得的測(cè)序結(jié)果先利用NCBI軟件中的Blast工具進(jìn)行相似性的檢索，以確認(rèn)實(shí)驗(yàn)所得

23、基因序列是目的片段（張儀等，2004）。用ClustalX 軟件對(duì)本研究所得序列和GenBank 下載的相關(guān)序列進(jìn)行排序并進(jìn)行手工校正剪切，然后用MEGA軟件計(jì)算出序列的堿基組成、種內(nèi)以及種間遺傳距離。分子系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建采用的是鄰接法(NJ)和最大簡(jiǎn)約法(MP)。鄰接法分析采用Kimura-2-parameter遺傳距離，進(jìn)行1000 次自展分支檢驗(yàn)。最大簡(jiǎn)約法分析使用啟發(fā)式搜索，構(gòu)樹(shù)方法采用二等分再連接(Tree-bisection r

24、econ-nection, TBR)，所有數(shù)據(jù)均未加權(quán)，獲得50%一致性的樹(shù)，可靠性由1000 次自展分支檢驗(yàn)（楊學(xué)明等，2006；柳淑芳等，2010；Murgia R et al.,2002）。</p><p>　　表1 本研究所分析物種的COI基因信息</p><p>　　Tab.1 Information of COI genes of analytical species in t

25、his study</p><p><b>　　*表示外群</b></p><p>　　*represent the outgroup</p><p><b>　　2結(jié)果與分析</b></p><p>　　2.1 大彈涂魚(yú)、彈涂魚(yú)COI基因序列特征及變異</p><p>　　

26、本研究所使用的引物位于COI 基因的5’端，采用上游引物F1與下游引物R1 對(duì)總DNA 進(jìn)行PCR。通過(guò)PCR可獲得的2種蝦虎魚(yú)科背眼蝦虎魚(yú)亞科的魚(yú)類，即彈涂魚(yú)和大彈涂魚(yú)各6個(gè)個(gè)體的線粒體COI基因部分片段，片段長(zhǎng)度約為650bp，表明COI基因通用引物在蝦虎魚(yú)科中具有一定的普遍適用性。</p><p>　　由圖1可見(jiàn)，本研究?jī)煞N蝦虎魚(yú)科魚(yú)類提取的基因組DNA及PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后都能較好的分離成像。</p&

27、gt;<p><b>　　A</b></p><p><b>　　B</b></p><p>　　圖1 提取的DNA電泳圖及PCR擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　Fig.1 The electrophoresis figures of extracting DNA and PCR product</p&g

28、t;<p>　?。翞榛蚪MＤＮＡ電泳圖；Ｂ為ＰＣＲ產(chǎn)物電泳圖。彈涂魚(yú)個(gè)體編號(hào)為：1，2，3，4，5，6；大彈涂魚(yú)個(gè)體編號(hào)為：B1，B2，B3，B4，B5，B6。Ａ圖Marker為1Kb DNA Marker；Ｂ圖Mark 為PCU 19 DNA Marker。</p><p>　　A is the Genomic DNA electrophoresis figure; B is the PCR pr

29、oducts electrophoresis figure. The individual B.pectinirostris Numbers for: 1, 2, 3, 4, 5, 6; the individual B.pectinirostris Numbers for: B1, B2, B3, B4, B5, B6. A figure Marker for 1Kb DNA Marker; B figure Marker for P

30、CU 19 DNA Marker.</p><p>　　采用ClustalX軟件對(duì)本研究所得的兩種COI部分序列和12個(gè)已發(fā)表蝦虎魚(yú)科魚(yú)類COI同源序列進(jìn)行聚類和排序，保留其共有序列，長(zhǎng)度為601bp，編碼200個(gè)氨基酸。用MEGA4計(jì)算這24條序列的堿基組成，平均堿基組成為：A：23.8%、T：29.2%、G：18.6%、C：28.4%，A+T含量(53.0%) 高于G+C(47.0%)。而對(duì)所研究的14種魚(yú)2

31、4個(gè)COI基因片段來(lái)說(shuō)，第1密碼子位點(diǎn)G+C 含量(57.1%)顯著高于第2和第3密碼子位點(diǎn)(44.0%和30.7%) (表2)。</p><p>　　所有個(gè)體序列核苷酸變異情況見(jiàn)表3。全部位點(diǎn)中不變位點(diǎn)有486個(gè)，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)有67個(gè)，顛換位點(diǎn)有48個(gè)。其中不變位點(diǎn)屬第2碼子位點(diǎn)最多，為200個(gè)；而轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和顛換位點(diǎn)均屬第3密碼子位點(diǎn)最多，分別為59個(gè)和47個(gè)。</p><p>　　由表 4

32、可以看出，這14種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類24個(gè)個(gè)體的COI基因平均 GC含量為39.6%—50.4%，其中第1密碼子位點(diǎn)的GC含量均較高(45.7%—58.2%)，第2密碼子的GC含量高度一致都為44.0%，第3密碼子的GC含量變化范圍最大(27.5%—49.0%)。而大彈涂魚(yú)和彈涂魚(yú)COI基因片段的GC含量相對(duì)較低，分別為40.6%和39.6%。</p><p>　　表2 所選蝦虎魚(yú)科個(gè)體的COI基因部分序列中各堿基平均

33、分布頻率(%)</p><p>　　Tab.2 Average nucleotide frequencies of COI partial sequences of the selected Gobiidae species (%)</p><p>　　表3 所選蝦虎魚(yú)科個(gè)體的COI部分序列各密碼子堿基變異情況</p><p>　　Tab.3 Sequences v

34、ariation of COI gene of the selected Gobiidae species</p><p>　　表4 本研究所選蝦虎魚(yú)科個(gè)體的COI基因密碼子位點(diǎn)GC 含量</p><p>　　Tab.4 The GC content for all codon position of the selected Gobiidae species COI gene in th

35、is study</p><p>　　2.2 種間及種內(nèi)的遺傳距離</p><p>　　14 種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類的種內(nèi)和種間遺傳距離,采用MEGA基于Kimura-2-parameter計(jì)算出來(lái)（柳淑芳等，2010）。結(jié)果，蝦虎魚(yú)科魚(yú)類種內(nèi)遺傳距離平均值為0.005種間遺傳距離平均值為0.224遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的44.8倍。彈涂魚(yú)和大彈涂魚(yú)的種內(nèi)遺傳距離分別為0.008和0.002，均未

36、超過(guò)Hebert 等(2003a)所推薦的物種鑒定最小種間遺傳距離0.020。除此之外，其余12 種蝦虎科魚(yú)類的種內(nèi)遺傳距離因只有一個(gè)樣品而未算出，以n/c表示(表5)。14 種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類中種間平均遺傳距離全部大于0.020，其中84.6%以上的種間平均遺傳距離大于0.200。遺傳距離最大的是蝦虎魚(yú)亞科絲蝦虎魚(yú)屬的絲蝦虎魚(yú)和同一亞科葉蝦虎魚(yú)屬的五線葉蝦虎魚(yú)，為0.292。遺傳距離最小的是背眼蝦虎魚(yú)亞科大彈涂魚(yú)屬的大彈涂魚(yú)和同一亞科青彈

37、涂魚(yú)屬的青彈涂魚(yú)，為0.148，大彈涂魚(yú)與彈涂魚(yú)的遺傳距離次之，為0.163。依據(jù)Hebert 等(2003a, b)的說(shuō)法，說(shuō)明這三種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類在遺傳上有較大親緣性。</p><p>　　表5 所選魚(yú)類兩兩比對(duì)的種間平均遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離</p><p>　　Tab.5 Genetic distance within-species and pairwise-species in

38、the selected species</p><p>　　2.3 蝦虎魚(yú)科分類及其分子系統(tǒng)樹(shù)</p><p>　　采用MEGA基于MP和NJ 法，對(duì)蝦虎魚(yú)科三個(gè)亞科14種魚(yú)類的24個(gè)COI基因序列構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)，得到的結(jié)果具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，但節(jié)點(diǎn)支持率相對(duì)較低，結(jié)果如圖2。從圖2 可見(jiàn)，大彈涂魚(yú)和彈涂魚(yú)的不同個(gè)體均可聚在同一分支內(nèi)，且14個(gè)種均可形成單系。NJ樹(shù)和MP樹(shù)具有較高的相似

39、性，且兩系統(tǒng)樹(shù)都顯示大彈涂魚(yú)與青彈涂魚(yú)分入同一分支，而彈涂魚(yú)位于另一分支。</p><p>　　在NJ和MP分子系統(tǒng)樹(shù)上， 還表現(xiàn)出一些與中國(guó)動(dòng)物志分類法不一致的結(jié)果。Gobionellus oceanicus，Gnatholepis thompsoni，Ctenogobius boleosoma，Oligolepis acutipennis這四種魚(yú)類按照國(guó)際分類法，應(yīng)被分入蝦虎魚(yú)科中的一個(gè)新的亞科——擬蝦虎魚(yú)亞

40、科，而中國(guó)動(dòng)物志則把它們歸入蝦虎魚(yú)亞科中。從本研究的分子系統(tǒng)樹(shù)上看，這四種魚(yú)類與蝦虎魚(yú)亞科的魚(yú)類已經(jīng)達(dá)到了亞科上的差異，也與背眼蝦虎魚(yú)亞科魚(yú)類的在分子系統(tǒng)樹(shù)上達(dá)到并列的位置，因而本研究結(jié)果在一定程度上支持國(guó)際分類法。</p><p><b>　　NJ樹(shù)</b></p><p><b>　　MP樹(shù)</b></p><p>　

41、　圖2 MP和NJ 法構(gòu)建的14種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類分子系統(tǒng)樹(shù)</p><p>　　Fig.2 MP and NJ tree resulting from 14 Gobiidae species</p><p><b>　　3討論</b></p><p>　　本研究的兩種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類大彈涂魚(yú)和彈涂魚(yú)采樣點(diǎn)分別為浙江寧海和浙江慈溪，且這兩種魚(yú)類的種內(nèi)

42、距離分別為0.002和0.008，種間距離為0.163，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Hebert 等(2003a)推薦的物種鑒定最小種間遺傳距離為0.020，說(shuō)明本研究中的兩種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類采樣正確。</p><p>　　研究中的14 種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類24個(gè)個(gè)體的COI基因GC含量為39.6%—50.4%，平均為45.3%；其中第1 密碼子位點(diǎn)的GC平均含量達(dá)52.1%，貢獻(xiàn)最大；第3 密碼子的GC 含量變化范圍最大 (27.5%—49

43、.0%)；第2密碼子的GC 含量高度一致均為44.0%。而Ward 等(2005)分析了澳大利亞207 種魚(yú)類的COI基因序列, 結(jié)果表明143 種硬骨魚(yú)類的GC 平均含量為47.1%，高于61 種軟骨魚(yú)類42.2%的GC 平均含量。其中第1、2、3 密碼子的GC 平均含量分別為57.1%、42.6%、41.1%，然而研究中的大彈涂魚(yú)、彈涂魚(yú)及青彈涂魚(yú)的GC含量各為40.6%，39.6%，43.2%，三種平均GC含量41.1%，低于報(bào)道

44、中的軟骨魚(yú)類42.2%。這種造成蝦虎魚(yú)科背眼蝦虎魚(yú)亞科的魚(yú)類GC平均含量低于軟骨魚(yú)類的現(xiàn)象還有待進(jìn)一步研究。另外，柳淑芳（2010）研究的石首魚(yú)科30 種石首魚(yú)科魚(yú)類的75 個(gè)COI基因序列GC 含量平均為48.3%，其中第2 密碼子位點(diǎn)GC 含量平均為56.6%，第1 密碼子的GC 平均含量為44.9%，第3 密碼子的GC 平均含量為42.</p><p>　　除此之外，較大的種間序列差異是對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的

45、先決條件(彭居俐等，2009)。Hebert 等(2003a)對(duì)動(dòng)物界的11個(gè)動(dòng)物門13320個(gè)物種進(jìn)行分析得出物種內(nèi)的遺傳距離很少有大于0.020 的，大部分的種內(nèi)遺傳距離小于0.010。Hebert 等(2003a，b)提出，利用COI基因序列有效鑒別物種的關(guān)鍵點(diǎn)是種間的遺傳距離必須大于種內(nèi)的遺傳距離，并且距離差異大約10 倍。本研究的14種蝦虎魚(yú)科魚(yú)類的種內(nèi)遺傳距離平均值為0.005，種間遺傳距離平均值為0.224，種間遺傳距離是

46、種內(nèi)遺傳距離的45.8倍。因此，可以說(shuō)明COI基因序列能夠?qū)ξr虎魚(yú)科魚(yú)類進(jìn)行有效的物種鑒定，可將蝦虎魚(yú)科的線粒體COI基因序列做成DNA條形碼（柳淑芳等，2010；譚曉玲等，2002）。</p><p>　　從分子系統(tǒng)樹(shù)中可看出，本研究的彈涂魚(yú)和大彈涂魚(yú)的各6個(gè)不同個(gè)體都能夠聚集在各自的同一分支內(nèi), 且14個(gè)種均可形成單系。更重要的是，本研究的三大亞科蝦虎魚(yú)亞科葉蝦虎魚(yú)屬的寬紋葉蝦虎魚(yú)、黃體葉蝦虎魚(yú)、五線葉蝦虎魚(yú)

47、，凡塘鱧屬的六斑凡塘鱧、絲條凡塘鱧、雙帶凡塘鱧，及絲蝦虎魚(yú)屬的絲蝦虎魚(yú)；背眼蝦虎魚(yú)亞科的彈涂魚(yú)、大彈涂魚(yú)、青彈涂魚(yú)；擬蝦虎魚(yú)亞科的Gobionellus oceanicus，Gnatholepis thompsoni，Ctenogobius boleosoma，Oligolepis acutipennis。在MP和NJ系統(tǒng)樹(shù)中這三個(gè)亞科的魚(yú)類都能夠分入各自的分支中，并能夠清楚地觀察出蝦虎魚(yú)科這三個(gè)亞科的魚(yú)類。說(shuō)明目前國(guó)際分類法將Gobi

48、onellus oceanicus，Gnatholepis thompsoni，Ctenogobius boleosoma，Oligolepis acutipennis分入一個(gè)新的亞科擬蝦虎魚(yú)亞科中，是比較合理的。另一方面，本研究的分子系統(tǒng)樹(shù)也充分證明了蝦虎魚(yú)科魚(yú)類在分子上分類和形態(tài)學(xué)上的分類基本一致（陳崢宏等，2009；董云偉等，2002）。</p><p>　　NJ和MP系統(tǒng)樹(shù)上，均可看出大彈涂魚(yú)和彈涂魚(yú)的遺

49、傳距離比大彈涂魚(yú)和青彈涂魚(yú)的大。表五中的大彈涂魚(yú)和彈涂魚(yú)的種間遺傳距離為0.163，而大彈涂魚(yú)和青彈涂魚(yú)的種間遺傳距離為0.148，前者種間的遺傳距離也大于后者。因此，本研究可證明大彈涂魚(yú)和青彈涂魚(yú)在系統(tǒng)發(fā)育上的關(guān)系較大彈涂魚(yú)和彈涂魚(yú)的關(guān)系較為密切。</p><p>　　綜上所述，基于蝦虎魚(yú)科魚(yú)類的線粒體COI基因構(gòu)建出的分類系統(tǒng)與形態(tài)學(xué)的分類單元?jiǎng)澐只疽恢?，所以可以根?jù)該基因的差異來(lái)探討蝦虎魚(yú)科屬、種分類單元

50、的系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題。但兩系統(tǒng)樹(shù)的節(jié)點(diǎn)值都比較低，可能蝦虎魚(yú)科魚(yú)類COI基因較為保守，這還需要大量的研究證明。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 柏干榮, 陸松敏. 線粒體DNA編碼細(xì)胞色素氧化酶亞基基因突變與疾病[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué):分子生物學(xué)分冊(cè),2003, 23(4):393-395. </p><p>

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