海蜇酶溶性膠原蛋白的提取工藝研究【畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　海蜇酶溶性膠原蛋白的提取工藝研究</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 食品質(zhì)量與

2、安全 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</b><

3、;/p><p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　1.1 膠原蛋白概述1</p><p>　　1.1.1 膠原蛋白的結構1</p><p>　　1.1.2 膠原蛋白的提取方法的研究進展1</p><p>　　1.1.3 膠原蛋白的應用2</p>&l

4、t;p>　　1.2 海蜇膠原蛋白的概述2</p><p>　　1.2.1 海蜇的生物學特性2</p><p>　　1.2.2 海蜇膠原蛋白的研究進展3</p><p>　　1.3 研究的目的和意義3</p><p>　　2 材料與方法3</p><p>　　2.1 材料與試劑3</p

5、><p>　　2.2 儀器與設備4</p><p><b>　　2.3 方法4</b></p><p>　　2.3.1 工藝流程4</p><p>　　2.3.2 樣品的前處理4</p><p>　　2.3.3 酶溶性膠原蛋白的提取4</p><p>　　2

6、.3.4 膠原蛋白提取率的測定4</p><p>　　2.3.5 單因素的確定5</p><p>　　2.3.6 提取工藝參數(shù)優(yōu)化5</p><p>　　2.3.7 膠原蛋白的理化分析5</p><p>　　3 結果與分析6</p><p>　　3.1 羥脯氨酸標準曲線的繪制6</p>

7、;<p>　　3.2 提取時間對酶溶性膠原蛋白提取率的影響6</p><p>　　3.3 液料比對膠原蛋白提取率的影響6</p><p>　　3.4 胃蛋白酶濃度對膠原蛋白提取率的影響7</p><p>　　3.5 響應面優(yōu)化實驗設計及結果7</p><p>　　3.6 氨基酸組成10</p>

8、<p>　　3.7 紫外光譜分析11</p><p>　　3.8 紅外光譜分析12</p><p><b>　　4 小結13</b></p><p>　　致 謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻14</b></p><p>　　

9、摘要：我國海蜇資源豐富，分布廣泛，并具有很高的營養(yǎng)及經(jīng)濟價值，本文以東海海域新鮮海蜇為原料，通過響應面實驗對海蜇膠原蛋白酶法提取進行優(yōu)化，并研究了PSC的部分理化性質(zhì)。以膠原蛋白得率為指標，酶法提取的最佳工藝為：4 ℃條件下提取時間為41h，液料比19:1，酶濃度為4%，在此條件下海蜇膠原蛋白的預測提取率為0.411%，與預測值的誤差為4.42%，由此可見，響應面法優(yōu)化的最佳提取工藝可靠。在膠原蛋白特性研究結果中顯示：該膠原蛋白氨基酸含

10、量豐富，其中Gly含量最高，約占總氨基酸的22%；紫外光譜掃描顯示酶促溶性膠原蛋白（PSC）的最大吸收峰在208 nm；紅外光譜掃描顯示膠原蛋白基本保留了三股螺旋結構。</p><p>　　關鍵詞：海蜇；酶溶性膠原蛋白；提取工藝</p><p>　　Abstract: Jellyfish is one of the most important fishery resources in C

11、hina, which has high nutritional and economic value. In this paper, the extracting conditions of pepsin-soluble collagen (PSC) from jellyfish were optimized based on response surface method. The result shows that the opt

12、imal condition of PSC extraction was obtained as following: extraction time 41h, the solid/water ratio of 19:1, enzyme concentration of 4% at 4℃, under these condition the prediction extraction rate of jellyfi</p>

13、<p>　　Keywords: Jellyfish; Pepsin-soluble collagen; Extraction</p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　1.1 膠原蛋白概述</p><p>　　膠原蛋白是動物體內(nèi)含量最豐富，分布最廣泛的蛋白質(zhì)，占人體內(nèi)總蛋白質(zhì)的25%~30%[1]，存在于

14、動物的骨、皮、腱、韌帶和軟骨中，是結締組織中極其重要的一種結構蛋白[2]。膠原蛋白的作用是支撐器官和保護肌體，同時也是組成細胞間質(zhì)的最重要的功能蛋白質(zhì)。</p><p>　　1.1.1 膠原蛋白的結構</p><p>　　膠原蛋白種類繁多，結構復雜。但是膠原蛋白的基本組成卻是大同小異：三條左手螺旋的α肽鏈在氨基酸殘基的作用下以右手螺旋方式形成的蛋白質(zhì)[3]。在膠原蛋白的肽鏈甘氨酸占總氨基

15、酸的1/3，與另外兩個氨基酸形成三肽Gly-X-Y（X，Y經(jīng)常是脯氨酸或者羥脯氨酸）的重復區(qū)域，各肽鏈以肽鏈之間Gly殘基形成的氫鍵連接到一起。其中Gly殘基位于螺旋的中心軸線上，其他氨基酸則占據(jù)三股螺旋的外圍位置。另外，膠原蛋白也可通過羥脯氨酸殘基分子內(nèi)氫鍵來穩(wěn)定自身。另外膠原蛋白還具有非三螺旋結構域。絕大部分蛋白質(zhì)幾乎不含羥脯氨酸，所以將羥脯氨酸可以作為膠原蛋白的特征氨基酸[4]。</p><p>　　1.1

16、.2 膠原蛋白的提取方法的研究進展</p><p>　　膠原蛋白的提取方法主要有：酸法浸提、熱水浸提、堿法浸提與酶法浸提，其基本的原理都是根據(jù)膠原蛋白本身的特性，改變蛋白質(zhì)所處的外界環(huán)境，將膠原蛋白從其他蛋白質(zhì)中分離出來。因為各種方法本身缺點的限制[5]，實際提取過程中經(jīng)常將不同方法相互結合。另外高壓技術在膠原蛋白提取中的應用也引起了越來越多研究者的興趣。</p><p>　　1.1.2

17、.1 酶法浸提</p><p>　　酶法提取時得到的是酶溶性膠原蛋白( Pepsin soluble collagen, 簡稱PSC)，是采用對膠原作用較弱的酶處理樣品，這種酶只作用于膠原蛋白的非螺旋端肽，而不會改變膠原蛋白的三螺旋結構。目前應用于實際生產(chǎn)中的酶主要有胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等[6-8]。酶解膠原蛋白的工藝可以分為單酶水解法和多酶水解法[9]。影響酶法浸提的因素有溫

18、度、時間、酶量、pH、料液比等。</p><p>　　胡建平[10]采用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶三種不同蛋白酶提取鰱魚磷膠原蛋白，選取效果最好的酶用正交試驗優(yōu)化膠原蛋白制備工藝。結果表明，胃蛋白酶提取鰱魚磷膠原蛋白效果最好，其最佳提取工藝條件為：40℃、48h、酶量4%和pH2，提取率為56.8%。陳小娥等[11]以安康魚皮為原料，采用酶法提取膠原蛋白，用正交實驗堆安康魚皮膠原蛋白提取工藝進行優(yōu)化，結果表明

19、，當胃蛋白酶質(zhì)量分數(shù)l%，料液比1:10，酶解時間6h，酶解溫度5℃，平均提取率為11.01%，純度為96.5%。</p><p>　　1.1.2.2 酸法浸提</p><p>　　酸法浸提，所用酸大多數(shù)是醋酸，有的還用檸檬酸、磷酸等[12]，其中檸檬酸因不產(chǎn)生顏色和異味得以在視屏工業(yè)的膠原蛋白提取中廣泛的應用。酸法提取膠原蛋白的工藝流程為：水產(chǎn)品→預處理→酸萃取→離心（上清液）→鹽析（

20、NaCl）→ 透析→ASC濃縮液→冷凍干燥，即可得到酸溶性膠原蛋白（Acid-soluble collagen ，ASC)[13]。張虹、桌素珍等[14]采用0.5 mol/L 醋酸提取，結合NaCl沉淀法從鮟鱇魚皮中提取酸溶性膠原蛋白（ASC），凍干魚皮與0.1 mol/L NaOH以1:10（W/V）的料液比混合，磁力攪拌器攪拌24 h，用蒸餾水洗至樣液呈弱堿性。加入10%丁醇攪拌浸泡，用蒸餾水沖洗除盡丁醇后，加入0.5mol/L醋

21、酸溶液浸泡提取24h，離心，沉淀用醋酸溶液繼續(xù)提取24h，提取物也按上述方法處理。兩次提取、離心得到的上清液混合后用0.9mol/LNaCl鹽析，沉淀物以0.5mol/L醋酸溶液復溶、鹽析來達到提純膠原蛋白的目的。</p><p>　　1.1.2.3 堿法浸提</p><p>　　堿法提取膠原蛋白，常采用石灰、氫氧化鈉等處理劑。一般都是把樣品勻漿后，用堿溶液多次溶脹，然后再離心提取。關于

22、堿法提取膠原蛋白的報道相對較少，大多都是和其他提取方法結合使用。</p><p>　　1.1.2.4 熱水浸提</p><p>　　熱水提取法是先將原料經(jīng)除雜蛋白等前處理，然后在熱水中直接提取已經(jīng)變性的膠原蛋白或者膠原蛋白水解物[15]。李聞欣，楊明來等[16]研究了淡水魚鱗水法制膠原蛋白。結果表明：制膠條件為溫度60~70℃、時間2~3h。并通過研究發(fā)現(xiàn)：溫度高些有助于提膠，但溫度過高

23、抽提率還有所下降。</p><p>　　1.1.2.5 結合法提取</p><p>　　由于季節(jié)的不同，不同水產(chǎn)品中含有羥脯氨酸與脯氨酸的量不同。而這兩種氨基酸的含量直接影響膠原蛋白的穩(wěn)定性，含量越高，膠原蛋白就越穩(wěn)定，則越難提取出來。所以可以考慮酸酶聯(lián)用來提取膠原蛋白。曾嶸等新鮮草魚魚鱗、魚鰭為原料將酸、堿法提取與酸、酶結合提取作了比較，結果發(fā)現(xiàn)：用傳統(tǒng)的酸、堿提取法產(chǎn)率較低，然而酸酶

24、結合提取法除了有較高的產(chǎn)率，且反應條件溫和，蛋白結構不易被破壞。此外還有酸堿結合法，酸堿與熱水結合法等。結合法是現(xiàn)在很多研究者正在研究的工作，希望通過該法克服單一方法的不足，從而得到高提取率的膠原蛋白[17、18]。</p><p>　　1.1.2.6 其他方法在膠原蛋白提取中的應用</p><p>　　另一些技術也逐漸應用到膠原蛋白的提取當中，例如高壓、微波[19]。莊永亮、李八方等[

25、20]研究了高壓輔助熱水提取海蜇膠原蛋白的工藝條件。以膠原蛋白得率（用羥脯氨酸含量計算）為指標，分別研究了高壓功率、高壓處理的時間、熱水溫度以及熱水提取時間對膠原蛋白得率的影響，得到優(yōu)化的工藝條件：料液比l:4（W/V），高壓功率250MPa，高壓處理時間10 min，熱水處理溫度70℃，熱水提取時間1.5 h。此條件下，海蜇膠原蛋白的得率為68.2%。與傳統(tǒng)的膠原蛋白提取方法比較，高壓輔助提取方法操作工藝簡單易控制，產(chǎn)品無小分子鹽摻入

26、，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)環(huán)保無污染。</p><p>　　1.1.3 膠原蛋白的應用</p><p>　　膠原蛋白具有較強的生物活性和生物功能，能參與細胞的遷移、增殖和分化，使骨、腱、軟骨和皮膚具有一定程度的機械強度。同時膠原蛋白還能促進細胞的生長，具有止血，生物相容性和生物降解性。因其具有這些性質(zhì)，膠原蛋白在創(chuàng)傷、燒傷、眼角膜疾病、美容、矯形、硬組織修復、創(chuàng)面止血等醫(yī)藥衛(wèi)生領域有著廣泛的應用

27、。</p><p>　　由于膠原蛋白及其水解物與人皮膚膠原的結構相似，相容性較好，可以擴散到皮膚深層，對人的皮膚有很好的營養(yǎng)作用，且膠原蛋白分子外側(cè)存在大量的羧基和羥基，同時存在大量的甘氨酸等天然保濕因子，能夠提高組織細胞的貯水能力，使皮膚保濕；膠原蛋白溶液還有很強的抗輻射作用，因而膠原蛋白還廣泛應用于化妝品行業(yè)[21-23]。膠原蛋白也可以作為功能食品和保健食品，也可以生產(chǎn)可食性包裝材料[24]。</p&

28、gt;<p>　　1.2 海蜇膠原蛋白的概述</p><p>　　近年來，由于瘋牛病等疾病的暴發(fā)以及宗教因素的影響[25]，人們開始尋求從水產(chǎn)動物中提取膠原蛋白。我國海蜇資源豐富，因此，如能從海蜇廢棄物中提取膠原蛋白加以利用，既能促進海蜇加工廢棄物的綜合利用，又能開發(fā)一種新的膠原蛋白源。</p><p>　　1.2.1 海蜇的生物學特性</p><p&

29、gt;　　海蜇(Rhopilem esculentum)，又稱為刺胞動物，屬腔腸動物門、缽水母綱、根口水母目、海蜇屬[26]，是暖水沿岸物種，在海洋內(nèi)分布廣泛。海蜇在海洋中營浮游生活，棲息于近岸水域，喜居河口附近，主要分布于中國、日本、朝鮮半島沿岸及俄羅斯遠東海域。海蜇體呈傘蓋狀，通體半透明，白色、青色或微黃色，傘徑超過45cm，最大可達1m，呈半球形，上傘隆起，中膠層發(fā)達；下傘較薄，邊緣具發(fā)達環(huán)肌，能收縮運動[27]。</p&g

30、t;<p>　　1.2.2 海蜇膠原蛋白的研究進展</p><p>　　海蜇除可食用外，全身都可入藥，根據(jù)《本草綱目》所述，海蜇“氣味咸溫無毒、主治婦人勞損、積血帶下，小兒風疾丹毒，燙火傷”，對哮喘、氣管炎、胃潰瘍、單純性甲狀腺腫大、高血壓等癥均有療效[26、28]。新鮮海蜇含水量約為96%，蛋白質(zhì)含量約2.92%，脂肪含量小于0.01%。除水外，蛋白質(zhì)是海蜇的主要成分，而且主要是膠原蛋白[26]

31、。因此海蜇的藥理功能與其蛋白質(zhì)組成必然有一定的聯(lián)系，已有研究表明，從海蜇中提取的膠原蛋白可用于治療風濕性關節(jié)炎。因此對海蜇的膠原蛋白及其氨基酸組成進行測定也是很有必要的，這將有助于海蜇的營養(yǎng)評價和保健功能的研究。</p><p>　　莊永亮等[29]研究海蜇傘部胃蛋白酶促溶性膠原蛋白的提取及其部分理化性質(zhì)，氨基酸組成及SDS-PAGE顯示，海蜇傘部膠原蛋白(PSC)為Ⅰ型膠原蛋白；含糖量為2.8%；熱變性溫度和熱

32、收縮溫度分別為28.8℃和51.6℃，均低于牛皮Ⅰ型膠原；紅外光譜顯示PSC保留了大量的三股螺旋結構；溶解性表明PSC 的等電點為pH6，在pH3 時有最大溶解度；酸性條件下鹽濃度高于4%(m/V)時，PSC的溶解度急劇下降。安桂香對新鮮海蜇的頭部和腕部進行了氨基酸成分的分析，海蜇的蛋白占其干重的50%，其氨基酸成分種類齊全，必須氨基酸含量豐富。分別用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶以及復合酶對海蜇的蛋白部分進行了酶

33、解，確定出堿性蛋白酶酶解的最適反應條件為酶用量。金桂芬等分別采用酸法和酶法從海蜇提取膠原蛋白，結果表明，酶法提取相對于酸法提取可獲得較高含量的膠原蛋白。</p><p>　　1.3 研究的目的和意義</p><p>　　如今海蜇養(yǎng)殖業(yè)得興起和發(fā)展為膠原蛋白的提取豐富了新的原料來源，且海蜇經(jīng)加工后產(chǎn)生的大量廢棄物是制備高蛋白食物的優(yōu)良原料，開發(fā)利用廢棄物也有利于提高海蜇的附加值。從海蜇中提

34、取得到的膠原蛋白因其特殊的氨基酸組成及理化性質(zhì)而具有獨特的生理功能，包括抗菌、抗過敏、降血壓、降膽固醇、抗衰老、治療關節(jié)炎癥和保健等功效[30]，可用作藥品、食品、化妝品等相關制品原料。隨著科技進步、經(jīng)濟發(fā)展和生活質(zhì)量的普遍提高，人們崇尚綠色、回歸自然意識的增強，高附加值海蜇膠原蛋白將越來越受到人們的廣泛青睞。</p><p>　　本文采用胃蛋白酶提取海蜇中的酶溶性膠原蛋白，考察了提取時間、酶用量、液料比對酶法提

35、取率的影響，再結合響應面分析得出膠原蛋白提取的工藝優(yōu)化條件。同時也對提取的膠原蛋白的理化性質(zhì)進行分析：氨基酸分析、紅外光譜分析、紫外光譜分析，為海蜇酶溶性膠原蛋白的應用提供理論基礎。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p>　　2.1 材料與試劑</p><p>　　海蜇，購于浙江省岱山縣水產(chǎn)市場；</p&

36、gt;<p>　　L-羥脯氨酸，購于Sigma公司；</p><p>　　檸檬酸鈉、氫氧化鈉、檸檬酸、氯胺T、對二甲基氨基苯甲醛、冰乙酸、乙二醇獨甲醚、濃硫酸、高氯酸、鹽酸、無水乙醇、溴化鉀、醋酸、溴酚藍、乙醚、戊巴比妥鈉，均為AR級，購于寧波奧博科學儀器有限公司；</p><p>　　胃蛋白酶，由國藥集團化學試劑有限公司提供；</p><p>　　十

37、二烷基硫酸鈉、過硫酸胺、丙烯酰胺、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍R-25，購自上海生物工程有限公司；</p><p>　　相關實驗試劑的配置：</p><p>　　檸檬酸緩沖液：檸檬酸鈉120g、冰醋酸12mL、檸檬酸46g、氫氧化鈉34g溶解于蒸餾水中，調(diào)整pH值至6.0，然后定容至1000mL；</p><p>　　0.05mol/L氯胺T溶液：稱取氯胺T 7.05g

38、，溶解于100mL蒸餾水中，然后加入乙二醇獨甲醚150 mL，再加入250mL檸檬酸緩沖液混合均勻；</p><p>　　對二甲基氨基苯甲醛：試劑A：取無水乙醇20mL，慢慢加入濃硫酸2.74mL；試劑B：取對二甲基氨基苯甲醛12.0g，慢慢加入無水乙醇40mL，水浴加熱使其完全溶解并冷卻至室溫，然后將A液慢慢加入B，混合均勻；</p><p>　　3.5 mol/L高氯酸溶液：取27mL

39、高氯酸，以蒸餾水定容到100mL。</p><p>　　2.2 儀器與設備</p><p>　　臺式高速冷凍離心機（Heraeus，德國科峻儀器公司）</p><p>　　真空冷凍干燥機（Freezing Dry，美國LABCONCO公司）</p><p>　　可見分光光度計（T6新悅，北京普析通用儀器有限責任公司）</p>

40、<p>　　傅里葉紅外光譜儀（TENSOR 27型，德國Bruker公司）</p><p>　　紫外分光光度計（Cary50，美國Varian公司）</p><p>　　液相色譜儀（Agilent1200，美國安捷倫科技公司）</p><p>　　微波消解系統(tǒng)（MARS，美國CEM公司）</p><p><b>　　2.3

41、 方法</b></p><p>　　2.3.1 工藝流程</p><p>　　采樣→前處理→酸溶性膠原蛋白提取后的沉淀→酸萃?。用福x心→上清液→鹽析→透析→PSC濃縮液→冷凍干燥</p><p>　　2.3.2 樣品的前處理</p><p>　　將海蜇頭和海蜇皮分離，用蒸餾水浸泡洗滌海蜇皮以去除鹽分并瀝干，切成小塊，用

42、20倍體積0.5%的氫氧化鈉溶液浸泡2h左右，再用蒸餾水沖洗至中性，瀝干留以備用。</p><p>　　2.3.3 酶溶性膠原蛋白的提取</p><p>　　膠原存在的原始狀態(tài)為：中間是規(guī)則的三股螺旋區(qū)域，兩端是非螺旋區(qū)，非螺旋區(qū)是導致膠原蛋白不溶的根源，因此需要采用合適的方法去除非螺旋區(qū)。本實驗選擇胃蛋白酶作為催化劑，在酸性條件下作用與膠原端肽非螺旋區(qū)，有選擇性的切斷苯丙氨酸、亮氨酸或

43、谷氨酸羧基側(cè)的肽鍵，將非螺旋區(qū)去除，則含三螺旋結構的主體部分可溶解有機酸而以近完整分子的形式釋放出來，從而提高膠原蛋白溶解量。</p><p>　　實驗步驟如下：取一定量搗碎均勻的海蜇，先用醋酸提取酸溶性膠原蛋白。提取后的沉淀，加入適量0.5mol/L醋酸，加入胃蛋白酶，浸提一定時間后，在10000r/min離心30min，離心后得到的上清液即為酶促溶性膠原蛋白粗制液，再加入NaCl使?jié)舛葹?.9mol/L，攪拌

44、后再次在10000r/min離心30min，并將離心得到的沉淀溶于少量的0.5mol/L醋酸，再轉(zhuǎn)入透析袋對去離子水透析2d，冷凍干燥即得酶促溶性膠原蛋白（PSC）制品。以上操作都在低溫（4℃）下進行。</p><p>　　2.3.4 膠原蛋白提取率的測定</p><p>　　膠原蛋白含有大量的甘氨酸，脯氨酸，羥脯氨酸，羥賴氨酸，其中羥脯氨酸（Hyp)和羥賴氨酸在其它蛋白中很少見，為膠原

45、蛋白所特有。通過測定羥脯氨酸的含量，然后乘以相應的系數(shù)可以得到膠原蛋白的含量。</p><p>　　膠原蛋白得率（%）=11.1×A×稀釋倍數(shù)/M×100</p><p>　　M：海蜇質(zhì)量（mg）</p><p>　　A：羥脯氨酸含量（mg）</p><p>　　羥脯氨酸通過分光光度計來測量。首先配置羥脯氨酸標準

46、工作液，準確稱取L-羥基脯氨酸標準品11mg，加入0.01mol/L鹽酸中溶解，稀釋并定容到100mL，濃度為110μg/ mL，在冰箱中保存。</p><p>　　吸取羥脯氨酸標準工作液1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL，分別用蒸餾水定容到100mL。以蒸餾水為空白，分別吸取上述標準液1mL，加入1mL檸檬酸緩沖液和1mL 0.05mol/L氯胺T溶液，25℃氧化10min后，加入高氯酸

47、1mL（3.5mol/L），放置10min，加入對二甲基氨基苯甲醛試劑1mL，在65℃水浴顯色10min，冷卻后在560nm處測吸光度。以羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。測定樣品在560nm處得吸光度，查標準曲線得樣品的羥脯酸含量。</p><p>　　2.3.5 單因素的確定</p><p>　　2.3.5.1 提取時間的選擇</p><p&

48、gt;　　在酶濃度2%，液料比為20，4℃條件下提取膠原蛋白，提取結束后，離心，濃縮干燥。研究提取時間分別為12h、34h、36h、48h和60h對海蜇膠原蛋白得率的影響。</p><p>　　2.3.5.2 液料比的確定</p><p>　　在酶濃度2%，提取時間為36h，4℃下液料比分別為5、10、15、20、25和30時，測定膠原蛋白的提取率。</p><p&g

49、t;　　2.3.5.3 酶濃度的選擇</p><p>　　提取時間36h，液料比為15，酶濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%和4%，確定酶濃度與膠原蛋白提取率的關系。</p><p>　　2.3.6 提取工藝參數(shù)優(yōu)化</p><p>　　在單因素實驗的基礎上，確定Box-Behnken設計的自變量，以膠原蛋白的提取得率為響應值，通

50、過響應曲面分析進行提取條件的優(yōu)化。</p><p>　　2.3.7 膠原蛋白的理化分析</p><p>　　2.3.7.1 氨基酸分析</p><p>　　氨基酸分析采用高效液相色譜法。各氨基酸組分由于極性，等電點或分子大小的不同，先后分別被洗脫。稱取一定量膠原蛋白樣品于四氟乙烯消解罐中，加入6 mol/LHCL，進行消解，消解程序見表1。消解結束后調(diào)節(jié)pH值至

51、7.2，定容至25mL，取1mL過0.22μm微孔濾膜，備用。</p><p>　　儀器工作條件是Hypersil AA-ODS 2.1×200mm×5μm氨基酸柱，進樣量為2 μL，流速為0.45 mL/min，柱溫為40℃，后運行時間為2min，VWD檢測器波長為338nm。流動相A為20mmol/L醋酸鈉溶液，pH=7.20±0.05；流動相B為醋酸鈉，乙腈，甲醇混合液，體積比

52、為100mmol/L醋酸鈉溶液：乙腈：甲醇=20:40:40，pH=7.20±0.05；衍生化試劑分別為OPA（鄰苯二甲醛）和FMOC（9-氯甲酸芴甲酯）。</p><p><b>　　表1 樣品消解程序</b></p><p>　　Tab.1 Sample hydrolysis process</p><p>　　2.3.7.2

53、 紫外光譜分析</p><p>　　用蒸餾水將制備的海蜇膠原蛋白溶解，在200nm-400nm的近紫外光區(qū)進行全波長掃描。</p><p>　　2.3.7.3 紅外光譜分析</p><p>　　利用膠原蛋白肽鍵中的分子結構與紅外光譜吸收帶的波長位置與吸收譜帶的吸收強度相對應的特點[31]，采用傅立葉變換紅外光譜對膠原蛋白進行透射掃描。在紅外燈照射下將少量樣品和適量

54、的干燥的KBr，混合均勻并研成分粉末狀。取少許樣品壓片，全反射光譜測定法（ATR）進行測定。傅里葉紅外光譜儀在4000~400cm-1范圍內(nèi)掃描，分辨率設置為4cm-1。</p><p><b>　　3 結果與分析 </b></p><p>　　3.1 羥脯氨酸標準曲線的繪制</p><p>　　根據(jù)測定的數(shù)值，以羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標，

55、吸光值為縱坐標繪制標準曲線（見圖1），求出回歸方程y=0.0979+0.0043，R2=0.9988，曲線線性良好。</p><p>　　圖1 羥脯氨酸標準曲線</p><p>　　Fig.1 The standard curve of Hyp</p><p>　　3.2 提取時間對酶溶性膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　在酶濃度2

56、%，液料比為20，4℃條件下分別設定水解時間為12h、34h、36h、48h和60h來研究膠原蛋白的提取率與反應時間的關系，結果見圖2，可以看出隨著提取時間的延長，膠原蛋白的提取率也隨之增加，當時間到36h時，提取率達到最大，而后提取率有所下降，因此提取時間確定為36h。隨著時間的延長，提取的膠原蛋白含量不斷增加，36h到達最大值，但隨著時間的繼續(xù)延長，底物不斷減少，胃蛋白酶開始作用膠原蛋白，使得膠原蛋白含量開始減少。</p>

57、;<p>　　圖2 時間對膠原蛋白提取的影響</p><p>　　Fig.2 Effect of extraction time on the jellyfish collagen</p><p>　　3.3 液料比對膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　在考察液料比的影響時，我們采用液料比分別為5、10、15、20、25和30，測定膠原蛋白

58、的提取率，結果見圖3。從中可以看出隨著液料比的增加，提取率也隨之增加，這主要是由于液料比的增加促使組織不斷膨脹，打開含有醛胺類得交聯(lián)鍵，更有利于酶解的進行。當達到15時，提取率又下降，因此確定最佳液料比為15（v:m）。液料比較小時，海蜇不能完全浸于其中，提取率低，液料比變大，膠原蛋白提取率變小，原因可能是液料比大造成膠原蛋白分離純化困難，損失較多。</p><p>　　圖3 液料比對膠原蛋白提取的影響</

59、p><p>　　Fig.3 Effect of water/solid ratoi on the jellyfish collagen</p><p>　　3.4 胃蛋白酶濃度對膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　酶濃度是影響膠原蛋白產(chǎn)率的重要因素，如果酶濃度過低，則底物反應不充分；而酶濃度過高則會引起分子之間的相互作用，阻止酶解反應的順利進行。本實驗研究了在

60、提取時間36h、液料比為15時，酶濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%和4%對膠原蛋白產(chǎn)率的影響，結果如圖4所示。PSC得率隨著酶濃度的增加而提高，當酶濃度大于3.5%時，提取率有所降低，因此確定酶濃度為3.5%。</p><p>　　圖4 酶濃度對膠原蛋白提取的影響</p><p>　　Fig.4 Effect of enyzme concentratio

61、n on the jellyfish collagen</p><p>　　3.5 響應面優(yōu)化實驗設計及結果</p><p>　　在單因素試驗基礎上，確定最佳提取時間為36h，液料比為15，酶濃度為3.5%，設計三因素三水平的實驗見表2。響應面實驗設計及結果見表3，15個試驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在A、B、C所構成的三維頂點；零點為區(qū)域的中心點，零點實驗重復3次（13

62、、14、15），用以估計試驗誤差。</p><p>　　表2 響應面分析因素及水平</p><p>　　Tab. 2 Factors and levels of response surface experiment</p><p>　　表3 響應面試驗設計及結果</p><p>　　Tab.3 Design and results o

63、f response surface experiment</p><p>　　根據(jù)表3的結果，通過響應面回歸程序進行數(shù)據(jù)分析，得出回歸模型，回歸方程為：</p><p>　　Y=0.402333＋0.007125A＋0.0125B＋0.019625C＋0.00825AB＋0.003AC ＋0.01825BC－0.01942A2－0.01967B2－0.00442C2</p>

64、<p>　　模擬的可靠性可通過方差分析及相關系數(shù)來考察，見表4。</p><p>　　根據(jù)回歸分析結果（表4）做出響應面圖（a）和等高圖（b）見圖4、圖5及圖6。</p><p>　　(a) (b)</p><p>　　圖4 提取時間和液料比對膠原得率的響應面圖</p>

65、<p>　　Fig.4 Response surface plots of extract time and water/solid ratio</p><p>　　(a) (b)</p><p>　　圖5 提取時間和加酶量對膠原得率的響應面圖</p><p>　　Fig.5 Respo

66、nse surface plots of extract time and enzyme concentration</p><p>　　(a) (b)</p><p>　　圖6 液料比和加酶量對膠原得率的響應面圖</p><p>　　Fig.6 Response surface plots o

67、f water/solid ratio and enzyme concentration</p><p>　　從圖4可以看出，當提取時間一定時，提取率隨著液料比的增加而變大，達到一定程度時提取率又降低，這說明液料比或大或小都會影響膠原蛋白的提取率，當液料比大時，對膠原蛋白的提取和純化都帶來一定的困難，液料比小時，膠原蛋白又不能完全浸于其中。當液料比一定時，提取率也隨時間的延長增大隨后又降低。從圖5中可以看出，提取

68、時間一定，提取率隨加酶量的增加而變大，其后變化較緩慢。從圖6中看出，加酶量一定，提取率隨液料比的增加而先變大后變小。液料比一定時，提取率隨加酶量的增加而增加。</p><p>　　當“Prob＞F”值小于0.05級表示指標顯著。從表4的分析結果可看出，整體模型的“Prob＞F”值小于0.05，表明該回歸方差模型是顯著的，并且失擬項不顯著，說明該模型的擬合度較好；從回歸方程各項方差的進一步檢驗可看出，液料比和酶濃度

69、的一次項的影響是顯著的，提取時間和液料比的二次項的影響也是顯著的，交互項作用影響不顯著，說明各因素對海蜇膠原蛋白提取率的影響不是簡單的線性關系，表明回歸方程能夠很好地模擬真實的曲面。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件：4℃條件下提取時間為41.4h，液料比為19.4:1，酶濃度為4%，在此條件下海蜇膠原蛋白的預測提取率為0.43%。為了驗證實驗的可靠性，將酶促溶性膠原蛋白最優(yōu)

70、提取條件修正為提取時間41h，底物濃度為19:1，酶濃度為4%，在此條件下測定的膠原蛋白的提取率為0.411%，與預測值的誤差為4.42%。以此可以看出，響應面優(yōu)化的最佳提取工藝較為可靠。</p><p>　　表4 酶法提取方差分析表</p><p>　　Tab.4 The table of variance analysis in pepsin-extraction</p>

71、<p>　　3.6 氨基酸組成</p><p>　　膠原蛋白的氨基酸組成見表5。從中可以看出通過酶法提取的海蜇膠原蛋白的氨基酸含有7種為人體必需的氨基酸（色氨酸水解過程中被破壞，未被檢測到)。甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸的含量較高，其中甘氨酸占總量的22%；而酪氨酸、賴氨酸等含量較少。</p><p>　　表5 膠原蛋白的氨基酸含量(mg/g)</p><p&

72、gt;　　Tab.5 Contents of amino acids in Collagen (mg/g)</p><p>　　注，*：必需氨基酸；TEAA：總必須氨基酸量；TAA：總氨基酸量；－：未檢出</p><p>　　Note, *: essential amino acid; TEAA: total essential amino acids; TAA: total amino

73、 acids; －: Undetected</p><p>　　3.7 紫外光譜分析</p><p>　　一般具有共軛雙鍵的物質(zhì)都具有紫外吸收，在20種基本氨基酸中，Trp、Tyr、Phe和His4種是具有共軛雙鍵的，而這其中Trp的紫外吸收最厲害，在280nm的紫外吸收較強，所以大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm都有一個很強的紫外吸收，并可通過對280nm的紫外吸收度的測量對蛋白質(zhì)溶液進行定量分

74、析，但膠原蛋白由于幾乎不含Trp，所以在280nm沒有強吸收峰的出現(xiàn)，這可以作為一個鑒定膠原蛋白的方法。從圖7可知，膠原蛋白在208nm處有一個吸收峰，而在280nm處沒有顯著吸收，這表明所提取的酶溶性膠原蛋白純度很高。</p><p>　　圖7 PSC紫外吸收光譜</p><p>　　Fig.7 UV absorption spectra of PSC</p><

75、p>　　3.8 紅外光譜分析</p><p>　　使用傅立葉變換紅外光譜儀測得海蜇PSC的紅外圖譜如圖8所示。</p><p>　　圖8 PSC紅外光譜圖</p><p>　　Fig.8 Fourier transform infrared spectrum of PSC</p><p>　　對蛋白質(zhì)進行分析，可以獲知傅立葉變換紅

76、外光譜圖中蛋白質(zhì)的吸收峰位置、振動方式以及譜帶歸屬（見表6）。</p><p>　　表6 PSC紅外光譜歸屬</p><p>　　Tab.6 FTIR band assignments of PSC</p><p>　　譜圖中相應的特征波數(shù)符合膠原的吸收峰位，證明所制得的為膠原蛋白。據(jù)表6可知，N-H伸縮振動的吸收峰出現(xiàn)在3400~3440cm-1處，樣品PS

77、C的酰胺A出現(xiàn)在3423.14cm-1。2933.31cm-1的弱吸收為酰胺B的C-H伸縮引起的特征吸收峰。酰胺Ⅰ帶的特征吸收頻率為1600~1700cm-1，是由蛋白多肽骨架的C=O伸縮引起，其吸收最強，常被用于蛋白質(zhì)的二級結構分析，海蜇PSC的酰胺Ⅰ帶出現(xiàn)在1656.60cm-1。1480~1600cm-1為酰胺Ⅱ帶的特征吸收頻率，主要為膠原蛋白的C-N伸縮與N-H彎曲的反映，海蜇膠原蛋白的酰胺Ⅱ帶的特征吸收為1550.05cm-1

78、處得強吸收。在膠原的紅外譜圖上1235cm-1~1450cm-1范圍內(nèi)存在吸收，可以作為檢測膠原的三股螺旋結構是否保持完整的一個標準，紅外光譜圖譜證明海蜇膠原蛋白的三股螺旋結構完整。</p><p><b>　　4 小結</b></p><p>　　通過單因素和響應面實驗，得到酶法提取膠原蛋白的最佳工藝為：提取時間41h，底物濃度為19:1，酶濃度為4%，在此條件下

79、測定的膠原蛋白的提取率為0.411%，與預測值的誤差為4.42%。實驗發(fā)現(xiàn)海蜇中含有豐富的膠原蛋白，是一個潛在的膠原蛋白源。通過氨基酸分析可知海蜇膠原蛋白中甘氨酸含量最高，占氨基酸總量的22%。紫外分析可知PSC的最大吸收峰在208nm，而在208nm處沒有吸收峰出現(xiàn)，說明用胃蛋白酶制得的膠原蛋白純度較高。紅外分析證明了海蜇膠原蛋白的三股螺旋結構完整。</p><p><b>　　參考文獻</b&

80、gt;</p><p>　　[1] 王榮春,徐德昌,秦蘭霞.膠原蛋白與VI型膠原蛋白結構概述[J].生物信息學,2004,4:30-33.</p><p>　　[2] Mingyan Yan, Bafang Li, Xue Zhao, et a1. Charateriation of acid-soluble collagen from the skin of walleye polloc

81、k (Theragra </p><p>　　chalcogramma)[J]. Food Chemistry, 2008,107:1581-1586.</p><p>　　[3] 郭恒斌,曾慶祝.水產(chǎn)膠原蛋白的功能特性及其制備與應用[J].農(nóng)產(chǎn)食品科技,2007,1(3):46-50.</p><p>　　[4] 張達江,王亮.I型膠原蛋白的結構、功能及其應用研究

82、的現(xiàn)狀與前景[J].生物技術通訊,2006,17(2):265-269.</p><p>　　[5] 肖世維,但年華,曾睿.從動物皮中提取膠原蛋白的方法[J].西部皮革,2009,31(15):17-21.</p><p>　　[6] 郭文宇,邊清泉,劉家琴等.木瓜蛋白酶提取草魚皮膠原蛋白的工藝研究[J].皮革與化工,2009,26(1):34-36.</p><p&g

83、t;　　[7] 唐文婷.木瓜蛋白酶提取魷魚皮膠原蛋白的工藝研究[J].四川食品與發(fā)酵,2008,44(5):32-34.</p><p>　　[8] 程波,吳潔,張玉蓉等.酶法提取人工養(yǎng)殖鱘魚皮重膠原蛋白的工藝研究[J].食品研究與開發(fā),2009,30(3):1-4.</p><p>　　[9] 菅景穎,張志勝.酶解膠原蛋白研究進展[J].浙江化工,2007,38(1):18-20.<

84、;/p><p>　　[10] 胡建平.鰱魚鱗膠原蛋白及其多肽的制備和性質(zhì)研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學,2009.</p><p>　　[11] 陳小娥,方旭波,鐘秋琴.安康魚皮重膠原蛋白的提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2007,28(1):131-133.</p><p>　　[12] 王信蘇,汪之和.草魚魚鱗膠原蛋白的提取[J].現(xiàn)代食品科技,2008,22(4

85、):148-150.</p><p>　　[13] 金桂芬,裘俊紅.海蜇膠原蛋白優(yōu)化提取條件的研究[J].浙江化工,2008,39(7):05-09.</p><p>　　[14] 張虹,卓素珍,戴志遠.鮟鱇魚皮重膠原蛋白的提取及性質(zhì)研究[J].中學食品學報,2009,9(6):34-40.</p><p>　　[15] 王麗娜,黃素珍.膠原蛋白的研究進展[J].肉

86、類研究,2010,1:16-22.</p><p>　　[16] 理聞欣,楊明來,王潤辰等.魚鱗水法制膠的研究[J].食品科學,2006,27(11):346-348.</p><p>　　[17] 曾嶸,楊忠華,王玉等.水產(chǎn)廢棄物膠原蛋白的提取[J].生物加工過程,2008,6(5):27-30.</p><p>　　[18] 潘楊,許學勤.酸堿法提取魚鱗膠的工藝

87、研究[J].食品科技,2008,3:183-186.</p><p>　　[19] 張聯(lián)英,曾名勇.微波技術在水產(chǎn)膠原蛋白提取中的應用[J].北京水產(chǎn),2005,6:40-42.</p><p>　　[20] 莊永亮,李八方,趙雪等.高壓輔助提取海蜇膠原蛋白的工藝[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(5):79-81.</p><p>　　[21] 廖艷陽.膠原蛋

88、白的研究進展[J].長沙大學學報,2009,23(5):36-38.</p><p>　　[22] 周倩,羅志剛,何小維.膠原蛋白的應用研究[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24(3):285-289.</p><p>　　[23] 陳國梁,賀翠蓮.膠原蛋白的研究進展[J].延安大學學報,2000,19(2):78-81.</p><p>　　[24] 郭瑤,曾名勇,

89、崔文萱.水產(chǎn)膠原蛋白及膠原多肽的研究進展[J].水產(chǎn)科學,2006,25(2):101-104.</p><p>　　[25] Junjie Zhan, Rui Duan, Yuanyong Tian, et a1. Characterisation of acid-soluble collagen from skin of silver </p><p>　　carp (Hypophth

90、almichthys molitrix)[J]. Food Chemistry, 2009,116:318-322.</p><p>　　[26] 劉希光.海蜇的化學組成及其生物活性研究[D].青島:中國科學院海洋研究所,2004.</p><p>　　[27] 金桂芬.海蜇膠原蛋白提取及超濾在膠原蛋白純化中的應用[D].杭州:浙江工業(yè)大學,2008.</p><p&g

91、t;　　[28] 馬永全,于新,黃小紅.海蜇的藥用與食用價值研究進展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2009,9:153-165.</p><p>　　[29] 莊永亮,趙雪,張朝輝.海蜇傘部膠原蛋白的提取及其理化性質(zhì)[J].食品科學,2009,13:89-92.</p><p>　　[30] 陳勝軍,曾名勇,董士遠.水產(chǎn)膠原蛋白及其活性肽的研究進展[J].水產(chǎn)科學,2004,23(6):44-46