生物科學畢業(yè)論文基于線粒體dna co?；蛐蛄醒芯克膫€長蛸octopus variabilis野生群體的遺傳多樣性

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　基于線粒體DNA COⅢ基因序列研究四個長蛸Octopus variabilis野生群體的遺傳多樣性</p><p>　　所在學院 </p

2、><p>　　專業(yè)班級 生物科學 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p>

3、<p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　摘要I</b></p><p>　　AbstractII</p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1材料與方法2</b></p>

4、<p>　　1.1實驗材料2</p><p>　　1.2實驗儀器2</p><p>　　1.3實驗方法2</p><p>　　1.3.1長蛸基因組DNA的提取2</p><p>　　1.3.2凝膠電泳檢測DNA3</p><p>　　1.3.3長蛸線粒體DNA COⅢ基因-PCR反應體

5、系優(yōu)化3</p><p>　　1.3.4PCR產物的測序和分析3</p><p>　　1.4本章小結4</p><p><b>　　2結果與分析5</b></p><p>　　2.1長蛸DNA提取5</p><p>　　2.2COⅢ-PCR引物設計5</p>&

6、lt;p>　　2.3PCR體系優(yōu)化5</p><p>　　2.3.1正交試驗設計5</p><p>　　2.3.2兩個因素的梯度實驗6</p><p>　　2.3.3正交試驗的結果7</p><p>　　2.3.4退火溫度梯度實驗8</p><p>　　2.3.5正交試驗結果8</p

7、><p>　　2.4PCR反應結果9</p><p>　　2.4.1PCR最優(yōu)反應體系9</p><p>　　2.4.2測序9</p><p>　　2.5長蛸COⅢ基因序列分析結果9</p><p>　　2.6本章小結12</p><p><b>　　3討論14<

8、;/b></p><p><b>　　小結19</b></p><p><b>　　參考文獻20</b></p><p><b>　　致謝24</b></p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　[摘要

9、] 目的 長蛸是我國傳統(tǒng)海產，具有重要經濟價值，對我國沿海四個地區(qū)長蛸野生群體進行遺傳多樣性分析，是海洋生態(tài)學以及水產資源學不可缺少的應用基礎性的研究工作。本實驗是對大連、青島、舟山、廈門四個地區(qū)的長蛸Octopus variabilis線粒體DNA COⅢ基因序列的測定來研究四個野生群體的遺傳多樣性，從而討論遺傳多樣性與遺傳變異之間的關系。方法 取長蛸外套肌組織，采用《分子克隆實驗指南》蛋白酶K、酚/氯仿提取法（稍作修改）提取基因組D

10、NA。細胞色素氧化酶亞基Ⅲ基因片斷的擴增引物源自A. L. Allcock的一篇文獻，COⅢ基因片段的兩條引物分別為：F1 (5′ CAATG ATGAC GAGAT ATTAT YCG 3′), R1 (5′ TCAAC AAAGT GTCAG TATCA 3′)。在合適的反應條件下，通過PCR技術擴增目的基因，并對其進行純化，純化后的產物送交上海英駿生物技術公司測序。結論 由PCR擴增和測序獲得COⅢ基因504 bp的序列57個，其

11、多態(tài)性遺傳參數統(tǒng)計顯示，COⅢ基因檢出9個單倍型，總群體單倍型多樣性指數(Hd) 為0.802 (COⅢ)，核苷酸</p><p>　　[關鍵詞] 長蛸；COⅢ；遺傳多樣性；分子標記技術</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　[Abstract] Purpose Octopus variabilis is

12、traditional Chinese seafood, with the important economic value. the four regions of coastal octopus of wild populations are being genetic diversity, which are also basic to studies on marine ecology and fishery resources

13、. This experiment is to Octopus variabilis of four districts of dalian, Qingdao, zhoushan, xiamen mitochondrial DNA was reviewed，and the determination of COⅢ gene sequences to study the genetic diversity of the four wild

14、 population genetic</p><p>　　[Key words] Octopus variabilis; COⅢ; Genetic diversity; Molecule marker technology </p><p><b>　　引言</b></p><p>　　長蛸學名Octopus variabilis,隸屬軟體動

15、物門，頭足綱，八腕目，蛸科(Octopodidae)，俗稱長八帶魚(短蛸俗稱八帶魚)、鲅須。 胴部短小，亞圓或卵圓形。頭足部具有肉腕4對，一般腕的長度相當于胴部的2～5倍，腕上有大小不一的吸盤。無肉鰭，殼退化。真蛸體中型，一般全長50厘米。胴部橢圓形，背部有疣突起。各腕長度相近，側腕稍長，腹腕稍短，腕上具吸盤4個。體褐色，胴背具十分明顯的灰白色斑點長蛸體中型，全長50～70厘米。胴部呈長橢圓形，表面光滑。頭部狹，眼小。腕長，各腕長短懸殊

16、。其中第1對腕最粗最長，約40～50厘米，是第4對腕長度的2倍。骯上有吸盤2行。體粉紅色。</p><p>　　長蛸在我國南北各海區(qū)均有廣泛分布，其中北部海區(qū)略多。長蛸個體大、肉質肥厚鮮美、營養(yǎng)豐富，富含蛋白質和氨基酸，可食用部分占總體的90％以上。肉除鮮食外，還可以加工成干制品，食用方式多種多樣。其內骨骼(中藥名海螵蛸)和墨囊具有較高的藥用價值，有止血、抗癌等功效。因而長蛸具有較高的經濟價值。目前我國產長蛸除少

17、量內銷外，大多數出口韓國，供不應求。</p><p>　　在天然海區(qū)長蛸主要營底棲生活，為沿岸底棲種類。春季長蛸多在低潮線以上活動，夏秋兩季多在潮間帶中區(qū)，冬季則在潮下帶深潛，具有短距離的生殖和越冬洄游習性。其多利用腕足在海底爬行，也能憑借漏斗噴水的反作用短暫游行于底層海水中。其生活場所多為泥底，少數為沙泥底或礁石底。長蛸可用其腕足挖洞棲居，尤其在其繁殖季節(jié)。天然海區(qū)長蛸多將卵產在自挖的洞中孵化，少數產在礁石縫隙

18、及海螺殼中。主要以蟹類、蝦類、貝類和底棲魚類為食，其攝食兇猛，通常在夜間進行攝食活動。遇敵害或受到驚擾時會噴射墨狀液體掩護其逃走。</p><p>　　目前，有關長蛸的研究主要集中在形態(tài)學、組織學、生理生態(tài)、人工育苗及養(yǎng)殖等方面[1~5]。分子遺傳學方面的研究不多，僅見高強等[6~7]采用等位酶技術對我國渤海海域長蛸群體的遺傳變異進行了分析，?？姑赖萚8] 、孫寶超等[9]對中國沿海長蛸群體線粒體COI的遺傳變異

19、進行了研究，李煥等[10]研究了中國沿海四個長蛸群體16S rRNA基因的遺傳變異。在此研究背景下，本文采用線粒體基因COⅢ序列分析技術對黃海、渤海、東海4個地理群體長蛸資源的遺傳變異和種群結構進行研究，從而研究遺傳多樣性與遺傳變異之間的關系。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　實驗材料 </b><

20、/p><p>　　從遼寧大連(DL)、山東青島(QD)、浙江舟山(ZS)、福建廈門(XM)四個海域捕獲長蛸的活體新鮮肌肉放置于95%酒精，-70℃低溫冰箱中保存以備用；COⅢ基因引物由上海英駿生物技術公司合成；Taq酶、10×PCR Buffer 緩沖液、25mmol/L MgCl2、2.5mmol/L dNTPs、電泳Marker、6×Loading-Buffer 、蛋白酶K；無水乙醇

21、、STE緩沖液、SDS、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、5mol/L NaCl溶液、瓊脂糖、EB染色液、去離子水。</p><p><b>　　實驗儀器</b></p><p>　　立式高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-OS11型，上海博訊實業(yè)有限公司）；PCR儀（PTC-200型，BIO-RAD）；移液器（1000µl、200µl、100µl

22、、10µl、2.5µl，國產大龍牌）；水平電泳儀（DYY-8C型，北京六一儀器廠）；電子天平（EL104型，METTLER-TOLEDO）；數顯水浴鍋（HH-6型，國華電器）；凝膠成像系統(tǒng)（VH II型，BIO-RAD）；冷凍離心機（GL-16G-II型，國產飛鴿牌）。</p><p>　　實驗方法

23、 </p><p>　　長蛸基因組DNA的提取</p><p>　　剪取小塊的長蛸肌肉組織0.1g放入2000μlEP管；</p><p>　　加600µl的STE緩沖液+60µl的SDS(10%)，剪碎后加6µl的PK；</p><p>　　55℃水浴消化3-3.5h，至溶液澄清，無沉淀（其中前半

24、個小時消化時，每5min搖一次，使溶液充分混合，充分消化）；</p><p>　　加入330µl氯仿/異戊醇二相混合液（氯仿：異戊醇=24:1）+330µl (等體積) Tris飽和酚，緩慢搖晃15min，使之充分混合；</p><p>　　離心，控溫4℃，12000rpm，離心15min；</p><p>　　取上清至新的離心管重復4、5步驟兩

25、次（等體積2相+1相混合）；</p><p>　　加入等體積的二相（氯仿：異戊醇=24:1）充分，緩慢搖晃15min，控溫4℃，12000rpm，離心15min；</p><p>　　取上清加入新的離心管中，加入1/25體積的5mol/L NaCl溶液和2.5倍體積無水乙醇（-20℃），充分混勻（搖15min），-20℃下靜置1h后離心15min；</p><p>

26、　　去上清，留沉淀，加入70%酒精（-20℃）搖晃幾次，靜置7-8min， 控溫4℃，12000rpm, 離心8min；</p><p>　　重復第九步一次，去上清，留沉淀，使酒精揮發(fā)干，加入100µl去離子水，-4℃保存。</p><p><b>　　凝膠電泳檢測DNA</b></p><p>　　1%瓊脂糖凝膠制備，1.0克的瓊脂

27、糖，加入100ml的0.5×TBE，微波加熱，至溶液澄清即成1%的瓊脂糖凝膠；</p><p>　　用25格的梳子倒平板，等待膠冷卻成型，倒膠的時候注意膠內不能有氣泡，以免影響膠成像的效果；</p><p>　　混合2.5µl 6×Loading-buffer和5µlDNA水溶液； </p><p>　　控制電壓100V，電泳

28、分離40min；</p><p>　　將電泳之后的凝膠放入EB溶液中染色20min；</p><p>　　紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，拍攝照片。</p><p>　　長蛸線粒體DNA COⅢ基因-PCR反應體系優(yōu)化</p><p>　　1. COⅢ基因片斷的擴增引物源自文獻[15~18]，COⅢ基因片段的兩條引物分別為：F1: 5′ CAATG

29、 ATGAC GAGAT ATTAT YCG 3′, R1: 5′ TCAAC AAAGT GTCAG TATCA 3′。</p><p>　　2. 反應體系成分：反應體系成分主要需要優(yōu)化的是鎂離子含量，反應體系成分為：總體積25 µl，其中2.5µl 10× Buffer、0.25µl 25mmol/L dNTPs、l0 umol/L引物各2.5 µl、5 U/

30、µl Taq DNA polymerase 0.25 µl、20 mmol/L Mg2+ 2.5 µl、ddH2O 13.5 µl；</p><p>　　3.反應條件優(yōu)化的主要對象是退火溫度，PCR反應程序設計步驟：94 ℃預變性5 min, 94 ℃ 40 s, 50 ℃ 40 s, 72 ℃ 90 s, 38個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min；</p>&

31、lt;p>　　4. 以簡單正交原理實施針對鎂離子濃度和退火溫度的梯度實驗；</p><p>　　5. 反應結束后的PCR產物，用1.3.2的方法進行凝膠電泳檢測，以確定最優(yōu)體系。</p><p>　　PCR產物的測序和分析</p><p>　　1. 檢測之后效果良好的PCR產物送交上海英駿生物技術有限公司測序；</p><p>　　2.

32、 序列結果利用MEGA3.1軟件[11]中的ClustalX插件[12]進行DNA序列排列，并輔以人工較對。用MEGA3.1軟件進行序列比較和變異檢測，確定變異位點和單倍型；</p><p>　　3. 用DnaSP4.10軟件[13]計算核苷酸多樣性(Nucleotide diversity, π)、單倍型多樣性(haplotype diversity, h)和核苷酸歧異度(Pairwise divergence

33、)；</p><p>　　4. 用Arlequin3.01軟件[14]中的分子變異分析(AMOVA)方法估算遺傳變異在群體內和群體間的分布，并計算群體間遺傳分化系數(F-statistics, Fst)及其顯著性（重復次數1000），種群間基因流用Nm來估計：Nm= (1/ Fst -1)/2。</p><p><b>　　本章小結</b></p>&l

34、t;p>　　1.本實驗所用的引物是目前普遍使用的源自文獻[15]中的兩段引物，分別是 F1: 5′ CAATG ATGAC GAGAT ATTAT YCG 3′, R1: 5′ TCAAC AAAGT GTCAG TATCA 3′。</p><p>　　2.我們提取長蛸DNA所選用的方法是最常用的苯酚-氯仿法提取，在實驗初期由于使用蛋白酶K的量不準確，使得跑電泳得到的DNA條帶結果不理想，導致實驗失敗。經過

35、多次嘗試，終于得到了理想的DNA條帶。</p><p>　　3.凝膠電泳檢測DNA過程中我們使用的是1%的瓊脂糖凝膠，跑電泳時間我們設置在40到45分鐘，確保跑膠得到的DNA條帶處在整條帶的2/3處。</p><p><b>　　結果與分析</b></p><p><b>　　長蛸DNA提取</b></p>

36、<p>　　從遼寧大連(DL)、山東青島(QD)、浙江舟山(ZS)、福建廈門(XM)四個地區(qū)海域所采樣品中選取的57 個新鮮個體，取肌肉進行DNA提取實驗，圖1為苯酚-氯仿法提取的部分長蛸DNA凝膠電泳測試結果：</p><p>　　由于DNA提取使用-70℃冷凍樣品，DNA部分降解，故凝膠檢測效果不夠理想，出現拖尾現象。</p><p>　　COⅢ-PCR引物設計</p&

37、gt;<p>　　COⅢ基因片斷的擴增引物源自文獻[15~18]，COⅢ基因片段的兩條引物分別為：F1: 5′ CAATG ATGAC GAGAT ATTAT YCG 3′, R1: 5′ TCAAC AAAGT GTCAG TATCA 3′。</p><p><b>　　PCR體系優(yōu)化</b></p><p>　　針對鎂離子濃度和退火溫度的正交試驗設計

38、，擬設計范圍：Mg2+濃度：1～2.5 mmol/L均衡四個梯度；退火溫度：50℃、50.6℃、51.2℃、51.7℃、52℃共5個梯度；正交試驗設計如表1：</p><p>　　表1 安排了20個實驗，每個實驗的鎂離子濃度和退火溫度為表格中顯示的數值</p><p>　　Table 1 Arrangement of 20 experiments, each experiment of

39、magnesium ion concentration and annealing temperature for the values ??shown in the table</p><p>　　針對兩個因素的梯度實驗，安排每個實驗反應體系如表2。</p><p>　　表2 其中A～D四組分別依次代表實驗1～20，每連續(xù)5個實驗的體系成分相同，表中數據的單位均為(µl)，總

40、的反應體系為25µl</p><p>　　Table 2 in which A ~ D, respectively, followed by representatives of four groups of experiment 1 to 20, each of 5 consecutive experiments of the system components the same unit of da

41、ta in the table are (μl), 25μl total reaction system</p><p>　　正交試驗的結果，如下圖所示</p><p>　　從圖2可以看出，鎂離子濃度在2.0 mmol/L的時候PCR產物條帶清晰明了，而退火溫度好像沒有多大的影響，11～15號實驗的條帶基本一致，所以就退火溫度再次展開梯度實驗。</p><p>　　

42、就退火溫度再次進行梯度實驗，本次實驗的鎂離子濃度以2.0 mmol/L為最佳濃度，同樣安排20個實驗，退火溫度依次為：47.3℃、48℃、48.8℃、50.1℃、51.7℃、53.6℃、55.1℃、57.2℃、57.8℃、58.4℃，實驗結果如圖3所示。</p><p>　　從圖3可以看出9、10號實驗的結果比較理想，電泳條帶比較清晰，9、10號實驗對應的退火溫度就是51.7℃，故可選擇52℃為最佳退火溫度。&l

43、t;/p><p>　　根據以上正交試驗結果，可確定最佳鎂離子濃度為2.0mmol/L，最佳退火溫度為52℃，故COⅢ-PCR最優(yōu)反應體系為：</p><p>　　最優(yōu)PCR反應程序：預變性94℃ 5min， 然后—94℃ 40s—52℃ 40s—72℃ 90s—36個循環(huán)，72℃ 10min[15]。</p><p><b>　　PCR反應結果</b&g

44、t;</p><p>　　據所得的PCR最優(yōu)反應體系進行大連、青島、舟山、廈門四個地區(qū)長蛸COⅢ基因實驗，共12個DNA模板進行PCR反應，獲得如圖4的結果。</p><p>　　各條條帶都比較理想，片段產物的大小大約范圍為400～550bp</p><p>　　Figure 4, lane 1 is Marker, since the next followed

45、by Dalian, Qingdao, Zhoushan, Xiamen Octopus variabilis group of the three genes of individual CO Ⅲ,The roads are relatively good with the fragment about the size of the product range of 400 ~ 550bp</p><p>&

46、lt;b>　　測序 </b></p><p>　　把得到的12條理想的PCR產物送交上海英駿生物技術有限公司測序，PCR產物的大小在482bp～524bp。</p><p>　　長蛸COⅢ基因序列分析結果</p><p>　　通過基因序列分析得到COⅢ基因片段同源序列504bp。各群體長蛸COⅢ基因片段中T、A、C、G平均含量分別為41.2%、31

47、.4%、16.5%和10.9%，A+T含量(72.6% )明顯高于G+C含量(17.4% )。</p><p>　　57個COⅢ基因片段共檢測到55個變異位點，占分析位點總數的10.9 %，其中單突變位點2個，簡約信息位點53個，無插入或缺失位點。多態(tài)性遺傳參數統(tǒng)計顯示，57個個體共檢出9個單倍型（見表3），總群體單倍型多樣性指數(Hd)為0.802，核苷酸多樣性指數(Pi) 為0.045，平均核苷酸差異數(K)

48、為 22.628，顯示出較豐富的遺傳多樣性。</p><p>　　表3 長蛸群體COⅢ基因序列單倍型及在群體中的分布</p><p>　　Tab 3 Haplotypes of COⅢ gene and its distribution in seven populations of O. variabilis</p><p>　　遺傳結構分析方面，四個群體的COⅢ

49、基因序列比較結果表明，各群體在核苷酸組成上和遺傳參數上均存在顯著差異。廈門群體在核苷酸組成上與其他群體存在較大差異，如表3所示。遺傳參數統(tǒng)計表明，各群體多態(tài)位點比例在0.000%-1.389%之間；單倍型多樣性指數在0.000-0.885之間；核苷酸多樣性指數在0.000-0.007之間；平均核苷酸差異數在0.000-3.359之間，如表4所示。</p><p>　　各群體間的遺傳分化系數和基因流計算結果如表5所

50、示，廈門群體與其它群體之間分化系數高于其他群體之間的系數，且均達到極顯著水平(p﹤0.01)，基因流Nm也均小于1；大連、青島與舟山三個群體之間部分分化系數均不顯著(p﹥0.05)，大連與青島、舟山群體的遺傳分化系數為負值，說明了群體內的分化優(yōu)勢。AMOVA進一步分析顯示在整個遺傳變異中有6.10%存在于群體內部，93.90%存在于群體之間，支持長蛸群體間的分化。 </p><p>　　經MEGA 3.1軟件的N

51、J聚類分析（如圖5）結果表明，所有個體可以明顯聚為2支，廈門群體所有個體組成一支，另一支由其余三個群體的個體組成；遺傳距離分析表明，廈門群體與其它3群體的凈遺傳距離為0.101-0.102，其余3個群體之間的凈遺傳距離為0.000；四個群體的Tajima’s D和Fu’s Fs檢驗結果表明，所有群體的Tajima’s D和Fu’s Fs值均為正值，且均未達到顯著水平(p﹥0.05)，因此這些群體可能未經歷過歷史擴張事件。</p&g

52、t;<p><b>　　本章小結</b></p><p>　　通過提取的四個海域長蛸DNA COⅢ基因的分析結果，我們可以得出，各群體之間均存在著遺傳差異，但是廈門群體與其他三個群體之間的遺傳差異更顯著，以至于獨立形成了一個支。因此，通過我們的實驗結果可以發(fā)現，大連、青島，舟山三個海域的長蛸群體聚合形成一個大類群，而廈門海域的長蛸群體很有可能已單獨形成另一個類群。</p&

53、gt;<p>　　圖5 基于COⅢ序列的長蛸不同個體的NJ聚類分析圖</p><p>　　Fig 5 NJ tree of COⅢ gene constructed from genetic distance among O.variabilis individuals </p><p>　　注：DL 、QD、ZS、XM分別代表大連、青島、舟山和廈門群體</p>

54、<p>　　Note: DL, QD, ZS and XM represent Dalian, Qingdao, Zhoushan and Xiamen population, respectively</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　物種的遺傳變異一般能體現該物種適應環(huán)境變化能力的強弱，遺傳變異較低的物種的種群恢復力偏低，更

55、承擔著種群滅絕的高風險，而遺傳變異較高的物種則具有較高的進化潛能和生態(tài)適應性[19]。頭足類是公認的遺傳變異相對貧乏的生物物種，除KATUGIN O N. 等[20]提到的個別種類外，頭足類均顯現出較低的遺傳變異水平，如此低的遺傳變異水平通常僅發(fā)生在種群嚴重衰退的群體中，而在任何其他的無脊椎動物群體中則很少見[21~22]，但是本文針對COⅢ基因的研究結果表明我國的長蛸群體間存在相對較高的遺傳多樣性。遺傳多樣性和遺傳變異等同嗎？<

56、/p><p>　　基于COⅢ基因的57個個體檢出9個單倍型，總群體單倍型多樣性指數(Hd)高達0.802，這種高度豐富的單倍型多樣性比已研究的真蛸(Octopus vulgaris)[23]、曼氏無針烏賊(Sepiella maindroni)[24]、魷魚(Thysano-teuthis rhombus)[25]、鸚鵡螺(Nautilus pompili-us)[26] 等部分頭足類要高，甚至高于部分海洋魚類、蝦蟹

57、類和貝類的多樣性[27~29]?；贑OⅢ的核苷酸多樣性指數(Pi)為0.045 (COⅢ)，除了廈門群體的COⅢ核苷酸多樣性指數之外，各群體也均在0.002以上，與多種海洋生物種類處在同一水平[30~31]。由單倍型多樣性指數(Hd)和核苷酸多樣性指數(Pi)來看，相對較高的遺傳多樣性說明我國長蛸群體具備較高的生態(tài)適應性和進化潛能，這為今后我國長蛸資源的合理開發(fā)和利用奠定了良好的理論基礎。</p><p>　　

58、本文綜合分析COⅢ基因序列多態(tài)性遺傳參數統(tǒng)計數據結果顯示，四個長蛸群體不僅呈現較豐富的遺傳多樣性，廈門群體和其他群體間的遺傳分化差異明顯?；贑OⅢ序列分析廈門群體與其它3個群體的凈遺傳距離高達0.101-0.102，據根Nei 等[32]估算，同一物種內的地區(qū)種群間D值變動在0~0.05之間，亞種間的D值約為0.02~0.20，種間遺傳距離的變幅為0.10~2.00之間，故廈門群體可能已單獨形成一個亞種。兩者的AMOVA分析結果一致，

59、基于COⅢ基因分析顯示在整個遺傳變異中以群體間變異為主。遺傳分化系數和基因流參數顯示，廈門群體與其他群體的遺傳分化極顯著（p﹤0.01），基因流參數也遠遠小于1。</p><p>　　本文的分析結果與常抗美等[8~10]基本一致。?？姑赖萚8]在討論自舟山以北的五個群體之間廣泛的基因交流問題上引入了更新世以來的冰期黃、渤海海平面升降論述，海平面的反復升降造成黃、渤海長蛸群體反復的遷入和遷出，從而與東海部分海域（舟

60、山）的長蛸群體產生廣泛的基因交流。李煥持相同的觀點。</p><p>　　本文從另一方面展開討論，海洋洋流格局的形成可能會導致長蛸群體的分化和基因交流。因海洋環(huán)境中缺乏像陸地一樣能阻止生物種群擴散和基因交流的有效屏障[33~34]，導致海洋生物類群與陸生生物相比種群結構簡單、基因交流頻繁、遺傳分化相對匱乏，尤其是具有長距離運動能力的海洋生物[35]。但對營低棲穴居生活的長蛸而言，活動時間和范圍的限制，以及產卵并孵

61、化于洞穴，理論上這些因素阻斷了群體間的正常的基因交流，群體遺傳分化將會很明顯。但本文的分析結果卻與此相悖，中國沿海的四個長蛸群體基本分為兩大類群，廈門長蛸群體獨立形成一大類群，舟山及其以北的三個長蛸群體匯聚成一個較大的類群。這樣看來，舟山及其以北的三個長蛸群體形成的第二大類群符合Ward和Stabile的理論，而廈門和其他群體的分化卻又與長蛸的生活習性對種群結構的影響相一致。</p><p>　　作為生活在海洋里

62、的生物長蛸，具有短距離的生殖和越冬洄游習性[36]，它們的生存和種族延續(xù)必然受到海洋潮流的影響。作為世界海洋第二大暖流的黑潮是影響我國海域海流的大型洋流，發(fā)源北赤道，緊貼臺灣東部進入東海，在琉球群島附近形成一分支經濟州島進入中國的黃海和渤海，這支黃海暖流到達渤?？谥率共澈刃纬赡鏁r針的環(huán)流，出渤海經山東半島向南形成黃海沿岸流經舟山群島一直到達南海海域，因它在南下的流動中并不完全連續(xù)，故按所在地區(qū)不同而有不同名稱，自北向南有魯北沿岸流、蘇

63、北沿岸流、浙閩沿岸流和廣東沿岸流[37]。</p><p>　　自浙江東南向福建沿岸的浙閩沿岸流經過溫州，與相反流向的臺灣海峽流以及黑潮自臺灣的西北流分支在閩東相遇，如圖7[38]。朱大勇等[39]通過地波雷達觀測了臺灣海峽西南表層海流季節(jié)性變化，2006年的觀測結果如圖8所示（6月份數據不全），廈門海域的表層流季節(jié)性變化紛繁復雜，觀察臨近廈門海域的沿岸表層流基本上是周期性環(huán)形流向，表層流和其他海域缺乏交流，形成

64、一個相對封閉的環(huán)流格局。</p><p>　　本研究綜合分析渤海、黃海和東海的沿岸流趨向，正好與長蛸的種群遺傳結構相吻合。盡管長蛸的生活習性影響著種群結構，但是本文還是傾向于支持Ward和Stabile的觀點，在黃海暖流的影響下，自渤海向南的黃海沿岸流和東中國海寒流一直到達舟山群島，常年的水團交流必將加強長蛸群體之間的基因交流，這樣就可以解釋大連、青島、和舟山3個長蛸群體為何能形成一大類群。舟山群島阻擋了由北向南

65、的沿岸流，浙閩沿岸流在閩東就遭遇了北上的臺灣海峽流和西進的黑潮分支流[38]，臺灣海峽西南部廈門海域的表層流呈現周期性環(huán)形流向[39]，這樣廈門海域與溫州海域不能形成穩(wěn)定的水團交流，加上廈門處在半封閉的海灣內，更限制了廈門群體和其他群體間的交流，這些證據從海水交換角度支持廈門長蛸群體獨立形成一大類群。</p><p>　　像長蛸一樣營洞穴生活的海洋生物，缺乏長距離遷徙和洄游能力，人為干預和海洋環(huán)境的變化便成為影響

66、種群遺傳結構的主導因素。迄今為止沒有發(fā)現能有效影響長蛸遺傳結構的任何人為因素，海洋洋流分布格局便成為影響長蛸群體基因交流的天然屏障，是決定長蛸種群結構的一大影響因素。</p><p>　　本文的研究結果對長蛸資源的合理開發(fā)和利用具有重要啟示。廈門群體和北方三群體的巨大遺傳分化昭示著以后的長蛸資源開發(fā)管理需要因地制宜，區(qū)別對待。廈門群體的亞種分化可能性很大，但是進一步確認亞種的分化需要進一步的考證與探究。本文涉及的

67、洋流格局的形成導致群體分化的分析方法可能對今后其他海洋生物的群體遺傳研究有所幫助。</p><p>　　圖8 2006年各月的表層平均流場(右下方標注為平均流的優(yōu)勢流向和平均流速)[39]</p><p>　　Fig 8 The average current speed in the surface layer of every month in 2006</p><

68、p>　　Fig 8 The average current speed in the surface layer of every month in 2006</p><p><b>　　小結</b></p><p>　　本次畢業(yè)論文設計起至時間為2010年7月10日至2011年5月30日，其中實驗階段截至于2011年3月16日，歷時8個月，論文撰寫歷時2個半月

69、。本次實驗中，我們開創(chuàng)性地利用線粒體DNA COⅢ基因來研究我國沿海海域四個長蛸野生群體的遺傳多樣性。通過本次研究，我們得到的結論是：由于長蛸的生殖和越冬洄游習性以及海洋洋流分布格局等的影響，舟山及以北地區(qū)的三個長蛸群體之間存在著比較廣泛的基因交流，使得大連、青島、舟山這三個地區(qū)的長蛸群體遺傳差異不是非常顯著，它們屬于一大類群；而由于舟山群島阻擋了由北向南的沿岸流等海洋洋流格局的影響，廈門群體與其他三個群體之間得不到廣泛的基因交流，再加

70、上廈門處在半封閉的海灣內，更限制了廈門群體和其他群體間的交流，而且，生物存在遺傳變異的特性，這樣勢必會導致廈門群體與其他三個群體之間的遺傳差異不斷加大，最終使得廈門群體區(qū)別與其他三個群體而單獨形成了一個類群，并使得廈門群體的亞種分化可能性加大。本文的研究結果對長蛸資源的合理開發(fā)和利用具有重要啟示。廈門群體和北方三群體的巨大遺傳分化昭示著以后的長蛸資源開發(fā)管理需要因地制宜，區(qū)別對待。本文涉及的洋流格局的形成導致群體分</p>

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