七鰓鰻B細(xì)胞連接蛋白(BLNK)基因克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析.pdf

1、B細(xì)胞連接蛋白(BLNK)是在脊椎動(dòng)物B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中廣泛表達(dá)的一類蛋白質(zhì),在進(jìn)化上高度保守,參與調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、增殖、分化、凋亡等進(jìn)程,對(duì)于生物體維持正常生命活動(dòng)起關(guān)鍵作用。七鰓鰻作為無頜類脊椎動(dòng)物的代表,擁有著最古老的適應(yīng)性免疫防御機(jī)制。對(duì)無頜類脊椎動(dòng)物的研究將為適應(yīng)性的免疫起源奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。目前關(guān)于BLNK的研究多集中在哺乳動(dòng)物,在七鰓鰻中是否存在BLNK尚不明確。本論文利用分子生物學(xué)手段和生物信息學(xué)方法,從

2、現(xiàn)存最古老的無頜類脊椎動(dòng)物七鰓鰻(Lampetra japonica)血液cDNA文庫中搜索到一條BLNK同系物,對(duì)其基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析,有助于從分子水平上闡述脊椎動(dòng)物BLNK蛋白的起源和進(jìn)化關(guān)系。
　　 本研究通過對(duì)日本七鰓鰻血液cDNA文庫3382條有效EST序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)一條能夠翻譯BLNK保守區(qū)SH2結(jié)構(gòu)的核苷酸序列,長594 bp。通過RACE的實(shí)驗(yàn)方法從日本七鰓鰻白細(xì)胞中成功擴(kuò)增BLNK cDNA全

3、長并將保守區(qū)克隆到pET32a(+)載體。從一級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)、高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、保守基序的分布、等方面分析了這段序列。七鰓鰻BLNK不含有信號(hào)肽和跨膜區(qū)。為了進(jìn)一步說明七鰓鰻BLNK與其它脊椎動(dòng)物BLNK的親緣關(guān)系,構(gòu)建基于鄰接法的系統(tǒng)發(fā)育樹,從進(jìn)化樹中發(fā)現(xiàn)脊椎動(dòng)物BLNK基因大致分為兩三簇,哺乳動(dòng)物與鳥類、爬行類動(dòng)物一簇,硬骨魚類在一簇,兩棲類與七鰓鰻在一簇。此外,對(duì)七鰓鰻BLNK進(jìn)化地位進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)七鰓鰻BLNK進(jìn)化地位比較原始,符合生物

4、由低等到高等的客觀自然進(jìn)化規(guī)律。
　　 利用基因工程手段,設(shè)計(jì)特異性引物,以GAPDH作為內(nèi)參基因,Real-time PCR法檢測(cè)BLNK基因在七鰓鰻心臟、肝臟、腎臟、鰓、腸和白細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)在BLNK在七鰓鰻上述組織中廣泛表達(dá),進(jìn)一步經(jīng)脂多糖(LPS)與植物凝集素(PHA)刺激后,BLNK在白細(xì)胞與心臟中的表達(dá)量明顯上調(diào),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說明BLNK參與類B淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答,抵御外來物質(zhì)的入侵發(fā)揮著重大作用

5、。
　　 進(jìn)一步構(gòu)建pET32a-BLNK原核表達(dá)載體,并在E.coli BL21中進(jìn)行表達(dá),組氨酸親和層析,獲取七鰓鰻BLNK重組蛋白(recombinant L.japonica BLNK,rLj—BLNK)純品。以純化的重組蛋白為抗原免疫新西蘭兔和BALB／c小鼠,制備兔抗七鰓鰻血清BLNK蛋白多克隆抗體和鼠抗七鰓鰻血清BLNK蛋白多克隆抗體。
　　 綜合上述的研究結(jié)果得出:在最原始的脊椎動(dòng)物七鰓鰻中存在B細(xì)胞連接