具有NB-ARC結(jié)構(gòu)域的OsPDRH9N蛋白質(zhì)功能鑒定及其在逆境響應(yīng)中的表達(dá)分析.pdf

1、水稻細(xì)菌性條斑病是由水稻黃單胞桿菌條斑致病變種Xanthomonas oryzaepv.Oryzicola(Xoc)侵染引起的細(xì)菌性病害,簡稱細(xì)條病,是亞洲和非洲地區(qū)水稻生產(chǎn)的重要病害。抗病相關(guān)基因的發(fā)掘不僅有利于農(nóng)作物產(chǎn)量的提高,而且是植物與微生物互作基礎(chǔ)研究的一個(gè)重要課題。
　　 本課題組前期通過水稻細(xì)菌性條斑病差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析,分離出一個(gè)擬抗病蛋白OsPDRH9N,并通過反向遺傳學(xué)的方法獲得了超量表達(dá)OsPDRH9N基因

2、的轉(zhuǎn)基因植株。生物信息學(xué)分析顯示OsPDRH9N蛋白是一個(gè)包含NB.ARC保守結(jié)構(gòu)域的NBS-LRR類蛋白質(zhì),該類蛋白質(zhì)在動(dòng)物體的細(xì)胞凋亡、植物體的超敏反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用;OsPDRH9N可能響應(yīng)光調(diào)控、生物以及非生物脅迫。為了進(jìn)一步研究OsPDRH9N的生物學(xué)功能,鑒定其參與的生理過程,本論文開展了以下幾個(gè)方面的研究,主要結(jié)果如下:
　　 通過Southern Blot、側(cè)翼序列擴(kuò)增技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)和插入位點(diǎn),結(jié)果

3、表明,T2代轉(zhuǎn)基因植株中有l(wèi)株純合、單拷貝且超量表達(dá)OsPDRH9N基因的植株,外源基因插入位點(diǎn)為水稻第二號(hào)染色體LOC Os02g44380.2基因的第十個(gè)內(nèi)含子。
　　 熒光定量PCR數(shù)據(jù)表明,正常生長條件下,OsPDRH9N基因的超量表達(dá)上調(diào)水楊酸合成關(guān)鍵基因CHS,茉莉酸合成關(guān)鍵基因AOS,以及病程相關(guān)基因PR1α、PR1b2和PR1＃12的表達(dá),說明OsPDRH9N參與了SA、JA和抗病信號(hào)途徑。水稻細(xì)菌性條斑病病原菌

4、侵染的條件下,OsPDRH9N基因的超量表達(dá)沒有引起病斑表型的明顯變化,但在mRNA水平上,水楊酸合成關(guān)鍵基因CHS、ICS和NPR1,茉莉酸合成關(guān)鍵基因AOS以及病程相關(guān)基因PR1α的表達(dá)均被Xoc上調(diào),說明轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Xoc的侵染更具敏感性。
　　 OsPDRH9N基因的逆境表達(dá)譜分析表明,OsPDRH9N受各種防御信號(hào)化合物不同程度的誘導(dǎo)表達(dá),脫落酸快速上調(diào)OsPDRH9N基因的表達(dá),而水楊酸和雙氧水快速地抑制OsPDRH

5、9N基因的表達(dá)。對(duì)T1代超量表達(dá)OsPDRH9N基因的轉(zhuǎn)基因植株外施脫落酸,發(fā)現(xiàn)相比于野生型,轉(zhuǎn)基因植株的種子萌發(fā)和側(cè)根生長不受脫落酸的抑制。
　　 通過構(gòu)建OsPDRH9N蛋白質(zhì)第169至453位氨基酸的原核表達(dá)載體,體外表達(dá)并且純化GST-OsPDRH9N169-453融合蛋白,以此蛋白作為生產(chǎn)檢測(cè)水稻OsPDRH9N蛋白質(zhì)的多克隆抗體和體外初步檢測(cè)ATP酶活性的材料。結(jié)果表明,所得的多克隆抗體能夠特異性的檢測(cè)水稻內(nèi)源OsP