hplc-elsd法測(cè)定銀杏葉提取物及其制劑中 銀杏內(nèi)酯a、b、c和白果內(nèi)酯含量

1、<p>　　HPLC-ELSD法測(cè)定銀杏葉提取物及其制劑中 銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯含量</p><p>　　作者：馮建忠，高媛媛，湯道權(quán)，劉燕，王建，錢宇錦 </p><p>　　【摘要】 　　目的 建立HPLC-ELSD法測(cè)定銀杏葉提取物（extract of Ginkgo biloba，EGb）及其制劑中銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯含量。方法 以Kromasil C1

2、8為固定相，甲醇-四氫呋喃-水（1∶24∶75）為流動(dòng)相，流速0.8 ml/min；柱溫：35℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器蒸發(fā)溫度為100℃，氣體流速為2.5 L/min。結(jié)果 銀杏內(nèi)酯A、B、C、白果內(nèi)酯的定量限分別為0.106、0.104、0.105、0.105 mg/ml，銀杏內(nèi)酯A、B、C、白果內(nèi)酯分別在0.127～0.506、0.129～0.548、0.131～0.576、0.131～0.561 mg/ml 濃度范圍內(nèi)其峰面積與濃度的

3、線性關(guān)系良好（r＞0.999），方法回收率為92.4% ～100.8%，日內(nèi)精密度及日間精密度的變異系數(shù)分別小于2%、3%。結(jié)論 HPLC-ELSD法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，為銀杏葉提取物中內(nèi)酯類成分的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 銀杏葉提取物 含量測(cè)定 </p><p>　　Abstract： Objective To establis

4、h a high performance liquid chromatography (HPLC) with evaporative light-scattering detector (ELSD) to determine the content of ginkgolide A, B, C and bilobalide in the extract of Ginkgo biloba (EGb) leaves and its pharm

5、aceutical agents. Methods Kromasil C18 was designated as the stationary phase and methanol to tetrahydrofuran to water (1∶24∶75) as the mobile phase; with the column temperature (250mm 4.6mm, 5μm) of 35℃ at a flow rate

6、of 0.8 ml/min, the evaporati</p><p>　　Key words: HPLC; ELSD; extract of Ginkgo biloba leaves; determination </p><p>　　銀杏葉為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉，其提取物是經(jīng)現(xiàn)代提取工藝從銀杏葉中提取的活性物質(zhì)，其主要活性化學(xué)成分為兩大類：黃酮類

7、及萜類［1］。銀杏內(nèi)酯是二萜類和倍半萜類內(nèi)酯,二萜類內(nèi)酯主要有銀杏內(nèi)酯A 、B 、C 、J、M等,倍半萜類內(nèi)酯有白果內(nèi)酯［2］ 。自20 世紀(jì)70 年代初發(fā)現(xiàn)了PAF 后,藥理學(xué)家對(duì)銀杏內(nèi)酯進(jìn)行了研究,證明銀杏萜內(nèi)酯是強(qiáng)血小板活化因子拮抗劑［3］ ,對(duì)免疫系統(tǒng)［4］ 、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、缺血損傷有保護(hù)作用，并有抗休克、抗過敏及抗炎作用［5］。國內(nèi)外的藥理學(xué)家對(duì)銀杏內(nèi)酯的藥理作用及臨床應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究,銀杏葉制劑在臨床的應(yīng)用也愈加廣泛。

8、</p><p>　　有關(guān)銀杏內(nèi)酯的體外檢測(cè)方法很多,由于銀杏內(nèi)酯的低紫外吸收，同時(shí)存在的黃酮類物質(zhì)有較強(qiáng)的干擾，不便使用紫外檢測(cè)器［6-7］，質(zhì)譜檢測(cè)器由于其靈敏度高，不受化合物紫外吸收的限制，目前已成為銀杏內(nèi)酯體內(nèi)外測(cè)定的主要檢測(cè)器［8-12］，但由于其價(jià)格昂貴，限制了其使用。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器由于其靈敏度及選擇性均較好，因此常常作為銀杏內(nèi)酯類成分測(cè)定的首選［13］，我國藥典［14］即采用高效液相色譜結(jié)合蒸發(fā)光

9、散射檢測(cè)器對(duì)銀杏葉提取物中內(nèi)酯類成分進(jìn)行質(zhì)量控制。 </p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定銀杏葉提取物及其制劑中4種內(nèi)酯類化合物銀杏內(nèi)酯A、B、C以及白果內(nèi)酯的含量。 </p><p><b>　　1 儀器與試藥 </b></p><p>　　1.1 儀器 Shimadzu LC-10A高效液相色譜儀（日

10、本島津制作所），包括SCL-10Avp System Controller， LC-10ADvp泵，F(xiàn)CV-10ALvp四元低壓梯度洗脫系統(tǒng)，DGU-20A5在線脫氣機(jī)，7725i進(jìn)樣器；HW2000 色譜數(shù)據(jù)工作站(南京千譜軟件科技有限公司)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD-UM3000，上海通微科技有限公司）。自動(dòng)雙重純水蒸餾器(型號(hào)SZ-93，上海亞榮生化儀器廠)，Ultrasonic Generator (型號(hào)H66MC，無錫超聲電

11、子設(shè)備有限公司)，梅特勒托利多AE240電子天平(十萬分之一，瑞士Mettler Toledo)。 </p><p>　　1.2 試藥 甲醇（色譜純，美國Fisher Scientific 公司），四氫呋喃（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為雙蒸水，其余試劑為分析純。對(duì)照品銀杏葉提取物（110866-200202）、銀杏內(nèi)酯A(100080-200306)、銀杏內(nèi)酯B(100081-200406)、銀杏

12、內(nèi)酯C(110861-200606)、白果內(nèi)酯(110860-200407)，均購自中國藥品生物制品檢定所。樣品EGb A（20060725）、EGb B（20070213）、EGb C（20061278）、EGb D、舒血寧注射液分別購自徐州EH藥業(yè)公司、浙江KEB藥業(yè)公司、江蘇YZJ藥業(yè)公司、邳州FW生物科技有限公司、黑龍江珍寶島制藥有限公司。 </p><p><b>　　2 方法與結(jié)果 <

13、;/b></p><p>　　2.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18（大連依利特有限公司，250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：35℃，進(jìn)樣量：20μL，流速0.8 ml/min；蒸發(fā)光散射檢測(cè)條件：蒸發(fā)溫度100℃，氣體流量2.5 L/min；流動(dòng)相為甲醇-四氫呋喃-水（1∶24∶75）。在此條件下銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯的保留時(shí)間分別為27、40、21、29min。

14、色譜圖見圖1。 </p><p>　　圖1 對(duì)照品HPLC-ELSD色譜圖 </p><p>　　1.銀杏內(nèi)酯C ；2.銀杏內(nèi)酯；3.白果內(nèi)酯；4.銀杏內(nèi)酯B </p><p>　　2.3 樣品溶液的制備 取銀杏葉提取物30 mg，精密稱定，加水2 ml，置水浴中溫?zé)崾谷苌ⅲ?%鹽酸溶液1滴，用乙酸乙酯振搖提取4次（3 ml，2 ml，2 ml，2 ml），

15、合并提取液，用5%醋酸鈉溶液4 ml洗滌，分取醋酸鈉液，再用乙酸乙酯2 ml洗滌。合并乙酸乙酯提取液及洗液，用水洗滌2次，每次4 ml，分取水液，用乙酸乙酯2 ml洗滌，合并乙酸乙酯液，回收溶劑至干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至2 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。 </p><p>　　2.4 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制 精密稱取銀杏內(nèi)酯A、B、C、白果內(nèi)酯對(duì)照品適量，用甲醇溶解并定容至5 ml棕色容量

16、瓶中，搖勻即得含銀杏內(nèi)酯A 1.012 mg/ml、銀杏內(nèi)酯B 1.096 mg/ml、銀杏內(nèi)酯C 1.152 mg/ml、白果內(nèi)酯1.122 mg/ml的混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4℃保存，備用。 </p><p>　　2.5 方法學(xué)考察 </p><p>　　2.5.1 線性關(guān)系 精密量取“2.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)貯備液1、0.6、0.5、0.4、0.25、0.2、0.16 ml，

17、用甲醇-四氫呋喃-水溶液（1∶24∶75）分別稀釋并定容至2 ml，得7個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液。按已建立的色譜條件，取各濃度對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣20 μl分析，每個(gè)濃度點(diǎn)分別在實(shí)驗(yàn)開始、實(shí)驗(yàn)中間、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各進(jìn)樣1次，以濃度（x，mg/ml）對(duì)峰面積平均值（y）回歸，得回歸方程。結(jié)果表明，濃度與峰面積之間呈良好的線性關(guān)系。見表1。表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果 </p><p>　　2.5.2 檢測(cè)限和定量限 取“2

18、.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用甲醇-四氫呋喃-水溶液（1∶24∶75）依次稀釋制成一系列由高到低的梯度濃度溶液并進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積約為噪音10倍（S/N≥10）時(shí)的進(jìn)樣濃度為定量限（QOD），測(cè)定峰面積約為噪音3倍（S/N≥3）時(shí)的進(jìn)樣濃度為檢測(cè)限（LOD），結(jié)果銀杏內(nèi)酯A、B、C、白果內(nèi)酯的定量限分別為0.106、0.104、0.105、0.105 mg/ml，檢測(cè)限分別為0.063、0.069、0.072、0.07 mg/ml

19、。 </p><p>　　2.5.3 回收率考察 精密稱取已知含量的EGb A（批號(hào)：20060725）30 mg，分別加入“2.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)貯備液80、100、120 μl（每個(gè)水平取樣3份），按“2.3”項(xiàng)下樣品處理方法進(jìn)行處理，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，得4個(gè)成分3個(gè)濃度回收率的平均值及RSD（見表2）。表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 </p><p>　　2.5.4

20、 精密度考察 取EGbA，按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，取該供試品溶液20 μl在“2.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算，4個(gè)成分日內(nèi)精密度（RSD）分別為1.5%、1.2%、1.1%、1.9%。取該供試品溶液20 μl在“2.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)分析6天，每天進(jìn)樣1次，以峰面積計(jì)算，4個(gè)成分日間精密度（RSD）分別為2.2%、2.3%、2.5%、2.1%。 </p><p>　　2.5.5 重現(xiàn)性

21、和穩(wěn)定性考察 取EGb A樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下制備供試溶液并在“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，4個(gè)內(nèi)酯類成分色譜峰面積的RSD結(jié)果見表3。表3 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 </p><p>　　取EGb A的供試品溶液1份，室溫下自然放置，分別在0、1、3、5、7、10 h取20 μl在“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算四個(gè)內(nèi)酯類成分色譜峰面積的RSD，結(jié)果見表3。 </p><p&g

22、t;　　2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定 取銀杏葉提取物，按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μl分析，根據(jù)回歸方程計(jì)算四個(gè)內(nèi)酯類成分的含量，結(jié)果見表4。銀杏葉提取物樣品色譜圖見圖3。表4 銀杏葉提取物中4種內(nèi)酯類化合物含量測(cè)定結(jié)果 </p><p><b>　　3 討 論 </b></p><p>　　中國藥典規(guī)定銀杏葉提取物中內(nèi)酯類含量

23、的控制是將銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯的含量加和計(jì)算成總內(nèi)酯的含量，并規(guī)定總內(nèi)酯含量必須在6.0%以上，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出各廠家生產(chǎn)的銀杏葉提取物均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，但徐州EH樣品未檢出銀杏內(nèi)酯C，舒血寧注射液未檢出白果內(nèi)酯。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道銀杏內(nèi)酯C具有抑制血小板聚集因子，白果內(nèi)酯具有神經(jīng)保護(hù)作用，可見用總內(nèi)酯含量并不能全面控制銀杏葉提取物及其制劑的質(zhì)量，因此，如何全面控制銀杏葉提取物及其制劑的質(zhì)量仍需進(jìn)一步研究。 </p>&l

24、t;p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　　［1］ Van Beek TA. Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts ［J ］. J Chromatogr A，2002，967(1)：21-55. </p><p>　　［2］ 車 舟，譚華炳，賀 琴，等. 銀杏葉提取物藥理

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