我國部分地區(qū)HP-PRRSV分子流行病學初步分析及SDWF株NSP2蛋白的原核表達.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病。高致病性豬藍耳病(Highly Pathogenic Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus，HP-PRRSV)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異毒株

2、引起的一種急性高致死性傳染病，病毒致病力強，傳播速度快，豬群發(fā)病率和死亡率高。本試驗對我國部分省市地區(qū)HP-PRRS分子流行病學進行了初步分析并實現(xiàn)了NSP2蛋白原核表達及初步建立了檢測PRRSV的間接ELISA方法。 本研究用細胞分離法從8省不同地區(qū)發(fā)病豬場豬組織病料中分離到28株PRRSV流行毒株。擴增并測序獲得NSP2基因和ORF5基因片段序列，利用DNA Star軟件對其進行核苷酸序列分析。分析表明28個分離株ORF5，

3、NSP2基因序列自身之間同源性分別為94.7％～99.8％和86.4％～99.8％；與參考毒株VR-2332、MLV、BJ-4、CH-1a、HB-1、HB-2核苷酸序列同源性ORF5為86.2％～98.5％，87.7％～90.5％，87.4％～89.9％，90.2％～96.4％，95.2％～97.4％，90.9％～93.5％； NSP2為75.6％～98.8％，69.9％～99.4％，78.9％～99.1％，85.7％～92.3％，89

4、.4％～97.7％，87.4％～96.2％，這說明國內(nèi)流行毒株在NSP2和ORF5區(qū)域的變異較大且表明全部分離株均屬于美洲型毒株。 本文參考Genbank中收錄的豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome virus，PRRSV) JXA1株Nsp2基因的序列，設計了一對引物用于擴增截短的Nsp2(deleting Nsp2)基因，雙酶切后將目的基因插入到原核表達

5、載體pET-32a(+)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進行表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western-blot檢測和可溶性試驗證明，Nsp2得到了高效表達，融合蛋白的分子量約為36.5ku，表達產(chǎn)物以可溶性方式存在于表達上清液中，表達產(chǎn)物能被PRRSV抗體所識別，且具有較好的生物學活性。 用鎳柱親和層析法從上清中純化了目的蛋白，以純化后的目的蛋白作為抗原包被聚乙烯微量反應板，初步建立檢測PRRSV的間接ELISA方法。通過