多重PCR技術(shù)快速檢測海洋病原微生物.pdf

1、海洋是孕育地球生命的搖籃，與人類關(guān)系十分密切。然而隨著沿海城市經(jīng)濟(jì)的繁榮，越來越多的城鄉(xiāng)生活污水和工業(yè)廢水排向海洋，導(dǎo)致大量病原微生物進(jìn)入海洋環(huán)境造成污染。病原微生物廣泛分布在海水、底泥和海洋生物的體內(nèi)，能通過飲食或接觸引起人類疾病，比如嘔吐、腹瀉、腸胃炎，甚至霍亂等傳染性很強(qiáng)的疾??；或者分布在海產(chǎn)品中，引起魚蝦貝類生病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來損失。對海洋環(huán)境中的病原微生物進(jìn)行監(jiān)測，對于評估海洋海洋環(huán)境質(zhì)量和海產(chǎn)品安全、進(jìn)行疾病的預(yù)防以及降低

2、相關(guān)經(jīng)濟(jì)損失，具有十分重要的意義。PCR技術(shù)是近年來迅速發(fā)展的檢測技術(shù)之一，由于具有操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、對樣品的純度要求低等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用范圍涵蓋了臨床醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)等。多重PCR技術(shù)作為衍生PCR技術(shù)的一個分支，由于更加簡便、省時、成本效益高，在越來越多的研究領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用。
　　 本研究為《衍生PCR技術(shù)對渤海天津沿岸病原微生物的快速檢測》，是天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃的項(xiàng)目，主要目標(biāo)是研發(fā)用于快速檢

3、測海洋環(huán)境中病原微生物的技術(shù)，建立起切實(shí)可行的檢測方法，反映海洋環(huán)境受病原微生物污染的狀況，為傳染病的防治及環(huán)境評價(jià)提供依據(jù)。本文建立起的雙重PCR方法，反應(yīng)體系為25μl，包含Mg2+1.5mM，兩對引物上下游濃度均為0.25μM，4種dNTP0.1mM，TaqDNA聚合酶0.05U/μ和1×PCR buffer，檢測限為副溶血弧菌2.11個/ml，創(chuàng)傷弧菌1.84個/ml。本論文建立起的三重PCR方法，反應(yīng)體系也是25μl，包含Mg

4、2+3.5mM，兩對引物上下游濃度均為0.125μM，4種dNTP0.1mM，Taq DNA聚合酶0.05U/μ和1×PCR buffer，檢測限為霍亂弧菌26.02個/ml，副溶血弧菌2.11個/ml，創(chuàng)傷弧菌1.84個/ml。雙重和三重PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10分鐘；三溫循環(huán)35次(94℃變性40秒，58℃退火60秒，74℃延伸60秒)；74℃終延伸10分鐘。用本文建立起的方法對從渤海沿岸采集的海水樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)三種病