恒溫型納米-滾環(huán)擴增-SPR傳感器快速檢測病原微生物的研究.pdf

1、目的:
　　建立一種既能直接接觸基因組DNA，又具有信號擴增放大效應(yīng)的恒溫型納米-滾環(huán)擴增-表面等離子體共振生物傳感器芯片技術(shù)，為常見病原微生物的檢測提供一種靈敏、特異、高通量、簡便快速的生物傳感器方法。
　　探討表面等離子體共振生物傳感器固相表面滾環(huán)擴增效應(yīng)的響應(yīng)機理和影響因素，證實其放大SPR生物傳感器芯片表面生物反應(yīng)信號的可行性，為復(fù)雜樣品中微量待測生物標志物的檢測提供高靈敏度、高特異的解決方案。
　　方法:

2、r>　　1.探針的設(shè)計:GenBank數(shù)據(jù)庫中查找這6種病原菌(大腸埃希菌(E.coli)、糞腸球菌（Efaecalis）、痢疾志賀菌（S.dysenteriae）、肺炎鏈球菌（S.pneumoniae）、表皮葡萄球菌（S.epidermidis）、金黃色葡萄球菌（S.aureus））的16S rDNA基因組序列，篩選適合設(shè)計鎖式探針的靶序列，根據(jù)靶序列設(shè)計具有QuickCutTM HpaⅠ酶切位點的鎖式探針以及相應(yīng)的捕獲探針，同時利用

3、Primer Premier5.0和Oligo6軟件預(yù)測鎖式探針、捕獲探針、信號放大探針和通用序列的二級結(jié)構(gòu)。利用Array Designer軟件，保持各探針間具有較好的一致性和特異性。
　　2.建立液相RCA反應(yīng)體系:以合成的6種病原菌靶序列為模板，建立液相RCA反應(yīng)擴增體系，通過瓊脂糖凝膠電泳以及實時熒光定量PCR，驗證鎖式探針、靶序列和捕獲探針的連接與擴增有效性和特異性。
　　3.SPR生物傳感器的改進:在課題組前期研

4、究的基礎(chǔ)上，對SPR傳感器的檢測平臺進行優(yōu)化，改進樣品流速控制系統(tǒng)、改善檢測通道和改進傳感器的溫控裝置，對生物傳感器芯片表面的自組裝技術(shù)進行優(yōu)化。
　　4.生物傳感器芯片表面生物膜的制備以及捕獲探針的固定:根據(jù)生物素和鏈霉親和素的共價偶聯(lián)作用，將生物素化的捕獲探針固定在芯片表面，探討結(jié)合有納米金的捕獲探針在芯片表面固定的濃度對SPR信號值的影響。
　　5.固相RCA反應(yīng)體系的條件優(yōu)化:分別探討鎖式探針和靶序列在40℃、45℃

5、、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃溫度條件下的連接效率和特異性以及最佳雜交連接的時間;10U、15U和20U的E.coli DNA Ligase用量對探針連接成環(huán)效率的影響;ExonucleaseⅠ和ExonucleaseⅢ的使用對擴增體系特異性的影響，確定SPR生物傳感器芯片表面的固相RCA反應(yīng)的最佳實驗條件。
　　6.固相RCA反應(yīng)與納米金信號放大:納米金修飾的探針與固相表面的RCA產(chǎn)物的重復(fù)序列進行雜交，產(chǎn)生較強的信號

6、放大效果。對納米金信號放大系統(tǒng)的實驗條件進行優(yōu)化，并以合成的DNA分子為模板檢測反應(yīng)系統(tǒng)的特異性和靈敏度。
　　7.交叉試驗驗證平行擴增檢測:6個病原菌的特異捕獲探針分別固定在6個相應(yīng)的檢測池中，每次只加入帶有一種病原菌的模板，重復(fù)多次，交叉驗證本研究方法可進行多重平行擴增檢測。
　　8.臨床標本檢測與統(tǒng)計分析:利用納米金信號放大的SPR生物傳感器方法檢測50例臨床標本，與傳統(tǒng)的病原菌檢測方法（Dade Behring Mi

7、croScan全自動微生物分析系統(tǒng)和法國生物梅里埃ATB自動微生物鑒定方法）進行對照，并做Kappa檢驗;對建立的恒溫型nano-RCA-SPR生物傳感器檢測方法進行方法學(xué)評價，確定臨床病原菌樣本檢測的具體步驟。
　　結(jié)果:
　　1.通過Clustal X2和在線BLAST比對，找到了6種病原菌（E.coli、Efaecalis、S.dysenteriae、S.pneumoniae、S.epidermidis、S.aureu

8、s）適合設(shè)計鎖式探針的靶序列，針對靶序列設(shè)計具有QuickCutTM HpaⅠ酶切位點的鎖式探針以及相應(yīng)的捕獲探針，并經(jīng)Primer Premier5.0和Oligo6軟件預(yù)測了鎖式探針和捕獲探針的二級結(jié)構(gòu)，連接成環(huán)后的鎖式探針二級結(jié)構(gòu)也少，探針之間具有相近的Tm值，這樣保證了鎖式探針與靶序列識別的特異性和RCA反應(yīng)擴增的效率。
　　2.以合成的6種病原菌靶序列為模板，建立液相RCA反應(yīng)擴增體系，RCA擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳以

9、及實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，帶有靶序列的泳池有RCA產(chǎn)物的電泳條帶，其他泳道沒有電泳條帶，說明本研究設(shè)計的鎖式探針能有效的、特異的識別病原菌靶序列，可用于病原菌的分子水平檢測。
　　3.在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了恒溫型nano-RCA-SPR生物傳感器檢測儀，SPR生物傳感器芯片是鍍金膜棱鏡，金膜厚度約是50nm;流速控制范圍是5-1500μL/min，流速精度控制為±1μL/min;檢測通道為8個串聯(lián)流池;溫度控制范圍是

10、20℃-50℃，精度是±0.1℃;利用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)共價修飾作用，將生物素化的捕獲探針自組裝到芯片金膜上。
　　4.在室溫下，生物素抗體固定在SPR傳感器芯片表面的金膜上，結(jié)合有納米金的鏈霉親和素與生物素抗體共價結(jié)合，最后分別將6種病原菌的捕獲探針固定在芯片表面6個不同的流池中，最佳捕獲探針濃度是1μM。
　　5.鎖式探針與靶序列DNA雜交溫度為60℃時，PLP的環(huán)化連接效率最好、反應(yīng)特異性最高;最佳雜交連接的時間是

11、30min;當E.coli DNA Ligase用量為10U/15U/20U時，RCA產(chǎn)物無顯著差異，故選用10U為最佳連接酶的用量。當鎖式探針的連接產(chǎn)物不使用ExonucleaseⅠ和ExonucleaseⅢ酶切時，有非特異性的擴增產(chǎn)物出現(xiàn)，使用ExonucleaseⅠ和ExonucleaseⅢ酶切未連接的鎖式探針，可以提高本研究檢測的特異性。
　　6.基于納米金顆粒信號放大的SPR生物傳感器檢測方法可提高檢測的靈敏度，在10％

12、(v/v)濃度下，直徑為15nm的納米金顆粒的SPR信號值比較高，與對照組比較有顯著性差異(p＜0.01)。對人工合成的模板DNA分子的檢測限是5×10-13 M（（51.6±7.2）×10-5RIU），而且濃度范圍在5×10-13 M至5×10-7 M內(nèi)呈線性相關(guān)(y=503.5 x+6126.0, R2=0.9853)。
　　7.建立的基于納米金顆粒信號放大的SPR生物傳感器檢測方法，可在3h內(nèi)完成對E.coli、 Efaec

13、alis、 S.dysenteriae、S.pneumoniae、S.epidermidis和S.aureus的恒溫快速檢測，實現(xiàn)了SPR生物傳感器芯片表面各流池的平行擴增檢測，各個病原菌的交叉試驗結(jié)果顯示SPR角度信號值變化比較明顯(p＜0.01)，說明無交叉反應(yīng)。
　　8.通過納米金信號放大的SPR生物傳感器檢測方法檢測的50例臨床標本，對臨床病原菌標本基因組DNA的檢測限是0.5 pg/μL((71.8±8.1)×10-sR

14、IU）。與傳統(tǒng)臨床方法（Dade Behring MicroScan全自動微生物分析系統(tǒng)和法國生物梅里埃ATB自動微生物鑒定方法）比較，本研究方法檢測臨床標本的靈敏度和特異性分別為E.coli:92.6％和95.7％;E.faecalis:100.0％和100.0％;S.dysenteriae:100.0％和100.0％;S.pneumoniae:94.7％和93.5％; S.epidermidis:95.7％和96.3％; S.aur

15、eus:100.0％和97.3％。通過Kappa檢驗，這兩種檢測方法的結(jié)果具有顯著的一致性(p＜0.01，Kappa＞0.75)。
　　結(jié)論:
　　1.成功設(shè)計了檢測6種病原菌E.coli、Efaecalis、 S.dysenteriae、S.pneumoniae、S.epidermidis、S.aureus的鎖式探針以及相應(yīng)的捕獲探針，構(gòu)建并優(yōu)化了液相和固相RCA擴增反應(yīng)體系，可在有背景信號干擾下識別目標靶序列，還可以實現(xiàn)

16、多種目標靶序列的平行連接和擴增反應(yīng)。從而實現(xiàn)SPR生物傳感器芯片的平行擴增反應(yīng)，由于實驗的反應(yīng)條件比較一致，沒有交叉反應(yīng)，可用于生物傳感器的高通量檢測。
　　2.恒溫型nano-RCA-SPR生物傳感器檢測方法，降低了一般基因診斷方法對PCR擴增方法的依賴。由于其穩(wěn)定的檢測系統(tǒng)、簡單方便的操作和芯片的可重復(fù)利用，有利于SPR傳感器檢測方法應(yīng)用于臨床標本的檢測。
　　3.利用生物素-親和素系統(tǒng)的信號一級放大、固相RCA反應(yīng)的信

17、號二級放大以及納米金顆粒的信號三級放大，有效提高了SPR生物傳感器芯片表面的響應(yīng)信號值，可顯著提高SPR生物傳感器的靈敏度。這種方法為SPR傳感器快速檢測痕量物質(zhì)分子提供了一個可靠的檢測平臺。該方法將會在分子水平，核酸快速檢測方面得到越來越多的應(yīng)用。
　　4.恒溫型nano-RCA-SPR生物傳感器檢測方法，不僅可以保證檢測病原菌的特異性和靈敏度，還可以快速的實現(xiàn)對固相RCA反應(yīng)的實時、在線的無標記監(jiān)測，為核酸分子水平的擴增和鑒定