基于納米金新型檢測(cè)系統(tǒng)的臨床病原微生物快速檢測(cè)芯片的研制.pdf

1、病原體的快速檢測(cè)和鑒定對(duì)于感染性疾病的診斷和治療具有重要的意義。近年來由臨床標(biāo)本中分離的細(xì)菌以地區(qū)不同而有所不同，但普遍以腸桿菌，葡萄球菌，克雷伯菌，變形桿菌，沙雷菌，假單胞菌和氣單胞菌等多見，由于大量廣譜抗生素的不合理應(yīng)用，引起正常菌群失調(diào)和耐藥菌株的出現(xiàn)，平常對(duì)正常宿主不致病的常居菌引起內(nèi)源性感染和治療中插入性操作所導(dǎo)致的外源性感染也日益增多。在病原微生物的快速診斷方面，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的細(xì)菌鑒定方法主要以微生物的基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)，

2、既能夠克服以微生物表型特征為基礎(chǔ)檢測(cè)方法的缺點(diǎn)和影響因素，從根本上對(duì)微生物進(jìn)行鑒別和特征分型，同時(shí)能夠大大縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)靈敏度和特異性。納米金是指直徑為納米范圍的金顆?；蚝鸬幕衔?，它的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可標(biāo)記蛋白和核酸。同時(shí)，它具有與銀反應(yīng)后形成比原來體積大10<'6>倍的黑色顆粒，可以用肉眼觀察或用普通記錄裝置如照相、掃描記錄的特點(diǎn)，近年來受到了科研人員的重視，特別是用不具備吸附能力離散的納米金作為信號(hào)報(bào)告分子的應(yīng)用則是近年生

3、物信號(hào)檢測(cè)中的一個(gè)重要進(jìn)展。本研究利用通用引物PCR將多個(gè)目標(biāo)菌的待檢基因片段百萬倍的放大，與固定上特異性探針的基因芯片結(jié)合，再用巰基作為納米金顆粒與核酸的連接分子，將納米金標(biāo)記在核酸上作為信號(hào)報(bào)告分子，旨在利用納米金新型信號(hào)系統(tǒng)來達(dá)到小成本，高準(zhǔn)確性的進(jìn)行微生物學(xué)鑒定的目的。 實(shí)驗(yàn)的主要方法及結(jié)果如下： 1．選用了臨床常見及一些強(qiáng)致病性的病原體為目標(biāo)，完成了各靶病原體特征性核酸標(biāo)志的確定，并針對(duì)16S rDNA 3’端

4、及23S rDNA 5’端的最保守序列，設(shè)計(jì)了能夠一次性擴(kuò)增16個(gè)菌的通用引物。 2．完成了16個(gè)病原體的PCR擴(kuò)增方法，包括：金黃色葡萄球菌，溶血性葡萄球菌，腐生葡萄球菌，表皮葡萄球菌，肺炎鏈球菌，化膿性鏈球菌，無乳鏈球菌，銅綠假單胞菌，百日咳鮑特菌，淋病雙球菌，肺炎克雷伯菌，枯草芽孢桿菌，洋蔥假單胞菌，醋酸鈣不動(dòng)桿菌，奇異變形桿菌，洛菲氏不動(dòng)桿菌，腸球菌，大腸埃希菌等，并對(duì)擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，使各擴(kuò)增反應(yīng)能在相同的擴(kuò)增條件下完

5、成。 3．在相同條件下設(shè)計(jì)了各靶病原體特異性寡核苷酸探針，利用生物信息學(xué)方法對(duì)探針進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬篩選，對(duì)探針的特異性、可靠性的指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，并確定了雜交條件。結(jié)果顯示各探針在G+C含量、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、自身二聚體以及重復(fù)堿基數(shù)等指標(biāo)均符合寡核苷酸探針設(shè)計(jì)要求，所選用探針特異性強(qiáng)，具有相同的雜交條件。 4．將篩選出的檢測(cè)探針、陽性對(duì)照探針以及陰性探針點(diǎn)在尼龍膜上制成膜芯片，用生物素標(biāo)記引物后對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，雜交方法為反向斑

6、點(diǎn)膜雜交，顯色方法為DAB法和化學(xué)發(fā)光法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為相應(yīng)檢測(cè)探針點(diǎn)及陽性對(duì)照均有雜交結(jié)果，陰性對(duì)照、空白對(duì)照和其他探針點(diǎn)均無顯影結(jié)果，背景清晰，結(jié)果可靠。證明本檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠，可用于各靶序列的檢測(cè)。 5．對(duì)反向斑點(diǎn)膜雜交的兩種顯色方法進(jìn)行了比較研究，包括DAB顯色法和化學(xué)發(fā)光顯色法，證明前者操作簡(jiǎn)便，用時(shí)短，后者費(fèi)時(shí)且步驟繁瑣，但在靈敏度上遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于前者。 6．在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)最佳點(diǎn)樣探針濃度的確立進(jìn)行了研究，結(jié)果

7、探針濃度從5nM到3000nM變化時(shí)，其顯色強(qiáng)度先迅速增加，在濃度達(dá)到500nM后趨于平緩。與靶序列雜交后其雜交點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度值在高于1000nM的探針高濃度區(qū)，反而呈下降趨勢(shì)。表明點(diǎn)樣探針濃度為500nM時(shí)可獲得較好的固定率和雜交效率，因此將制備芯片的探針濃度確定為500nM。 7．對(duì)銀染反應(yīng)的時(shí)間和條件進(jìn)行了比較研究，證實(shí)25℃，5min×5的反應(yīng)方式能獲得較穩(wěn)定的顯色效果。 8．臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，陽性探針點(diǎn)及陽性

8、對(duì)照點(diǎn)均有顯色結(jié)果，陰性對(duì)照、空白對(duì)照和其他探針點(diǎn)均無顯影結(jié)果，背景清晰，結(jié)果可靠。檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)經(jīng)典檢測(cè)鑒定方法結(jié)果一致，證明本檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠，可用于臨床樣品的檢測(cè)。 9．對(duì)以下兩種納米金標(biāo)記方法的效率進(jìn)行了比較性研究：①用巰基修飾引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行芯片雜交后，與納米金的標(biāo)記結(jié)合效率；②用生物素修飾引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行芯片雜交后，與納米金標(biāo)記的抗生物素抗體的結(jié)合效率。比較試驗(yàn)結(jié)果為：后者雖然在顯色過程中借助的連接分