免疫血液學(xué)基礎(chǔ)

1、1,免疫血液學(xué)基礎(chǔ)知識,2,主要內(nèi)容,臨床輸血發(fā)展簡史免疫血液學(xué)基礎(chǔ)概念紅細(xì)胞血型抗原系統(tǒng)紅細(xì)胞血型血清學(xué)檢測技術(shù)醫(yī)院血庫的工作職責(zé),3,人類歷史上早期輸血嘗試,1667年法國御醫(yī)Jean用羊血治療精神病患者,4,1818年英國產(chǎn)科醫(yī)生James 首次用人血輸治患者,早期的床邊直接輸血,5,血型之父,1901發(fā)現(xiàn)ABO血型又發(fā)現(xiàn)MN，P，Rh等血型，贏得了“血型之父”的譽稱。 1930年因發(fā)現(xiàn)人類ABO血型系統(tǒng)而獲得諾貝爾獎

2、金,Karl Landsteiner (1868.06.14～1943.06.26),真正使輸血變得容易的人盧因森（1915年1月）,紐約的盧因森博士發(fā)明了實用的檸檬酸鈉抗凝劑方便獻(xiàn)血方便輸血方便保存方便運輸使建立血庫成為可能,,6,7,臨床輸血發(fā)展簡史,1901、1940年奧地利科學(xué)家Landsteiner等人先后發(fā)現(xiàn)了ABO和RH血型系統(tǒng)，使輸血治療有了牢固的科學(xué)基礎(chǔ)，從而極大地提高了臨床輸血的安全性1937年世界上

3、第一個血庫在芝加哥Cock County醫(yī)院建立，標(biāo)志著輸血開始成為臨床醫(yī)學(xué)的重要組成部分和常規(guī)治療手段現(xiàn)在輸血已經(jīng)發(fā)展成一門涉及多學(xué)科的獨立的邊緣學(xué)科 - 輸血醫(yī)學(xué),8,二戰(zhàn)促進(jìn)了輸血醫(yī)學(xué)的發(fā)展,失血是戰(zhàn)場死亡的主要原因朝鮮戰(zhàn)場上90％的士兵死于沒有及時輸血輸血的早期實踐者之一 — 白求恩,在二戰(zhàn)中戰(zhàn)場輸血非常普遍,,,9,10,1944年 我國第一個凍干血庫中心在昆明建立。1947年 我國第一個醫(yī)院血庫在南京建立。

4、1953年 我國第一個大型中心血庫在沈陽建立。,我國輸血事業(yè)的發(fā)端,11,免疫血液學(xué),免疫血液學(xué)（Immunohematology，IH），是一門研究人體血型抗原及抗體，并通過輸血前測試血型抗原-抗體反應(yīng)，找到合適的血液源，從而達(dá)到安全輸血目的的實驗室醫(yī)學(xué)分支學(xué)科。,12,血型抗原,存在于紅細(xì)胞表面化學(xué)結(jié)構(gòu)： 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)上的糖類抗原 糖蛋白或脂類（糖脂）,13,ABO – A、BRh (Rhesus) – D、C、E、c

5、、eK (Kell) – K、k (cellano)Fy (Duffy) – Fya、FybJk (Kidd) – Jka、JkbLe (Lewis) – Lea、LebMNS系統(tǒng)P1,,血型抗原系統(tǒng)舉例,14,當(dāng)某種抗原分子進(jìn)入不含該決定簇的機(jī)體時，刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體的能力免疫原 = 抗原D抗原：強(qiáng)免疫原Fya抗原：弱免疫原免疫原性的強(qiáng)弱與以下因素有關(guān)抗原分子的氨基酸序列(一級結(jié)構(gòu))及空間構(gòu)象(二級結(jié)構(gòu)及三、四

6、級結(jié)構(gòu))紅細(xì)胞上該抗原分子的表達(dá)數(shù)量,血型抗原的免疫原性,15,,,,只識別相對應(yīng)的紅細(xì)胞抗原并與之結(jié)合與紅細(xì)胞上相對應(yīng)的抗原結(jié)合后，可引起紅細(xì)胞的破壞、溶解(溶血反應(yīng))兩種表現(xiàn)形式“天然抗體”：機(jī)體自然產(chǎn)生的抗體 如：抗-A、抗-B（可用于反定型）“免疫性抗體” - “不規(guī)則抗體”：經(jīng)免疫原刺激后而產(chǎn)生的應(yīng)答性抗體 如：抗-D、抗-K，等等,血型抗體,16,自身抗體(Auto-antibody)

7、 可凝集或致敏機(jī)體自身的紅細(xì)胞，常見于自身免疫性溶血性貧血、藥物性溶血性貧血或各種自身免疫病同種抗體(Allo-antibody) 可凝集或致敏機(jī)體外來的紅細(xì)胞，常見于各種輸血引起的溶血性疾病,血型抗體,,免疫性抗體根據(jù)應(yīng)答機(jī)制又可分為兩大類:,17,IgM = “完全抗體” = 室溫下發(fā)生發(fā)應(yīng) = 如：抗-A、抗-B、抗-M、抗-Lea、抗-P1

8、 = 大部分的血型分析試劑及“冷”抗體是IgM類抗體IgG = “不完全抗體” = 37oC下反應(yīng) = 如：抗-D、抗-K、抗-Jka、抗-Fya，等 = 幾乎所有臨床有意義的不規(guī)則抗體都是IgG抗體,血型抗體,18,IgM,IgG,血型抗體模式圖,19,完全抗體可以直接凝集紅細(xì)胞,,,,IgM分子的跨度可達(dá)34nm,20,不完全抗體不能直接凝集

9、紅細(xì)胞,,,,IgG分子的跨度僅為14nm,21,抗-A抗體破壞A型紅細(xì)胞縮短紅細(xì)胞壽命破壞紅細(xì)胞溶血死亡,抗-A抗體,血型抗原-抗體反應(yīng),22,目前所發(fā)現(xiàn)的人類最重要的血型抗原系統(tǒng)ABO血型系統(tǒng)的“天然抗體”幾乎存在于不含相對應(yīng)抗原所有人的外周血中“天然抗體”臨床上可用于反定型ABO血型系統(tǒng)亞型A：A1、A2、A3、Ax、Am，等B：B2、 B3、Bx、Bm，等,ABO血型系統(tǒng),23,ABO血型系統(tǒng),24,ABO以

10、外重要的血型系統(tǒng)及其抗體,2005年，29個紅細(xì)胞血型系統(tǒng)274個抗原,25,除ABO外與輸血有關(guān)的最重要的血型系統(tǒng)之一最重要的五種抗原C、c、D、E、e根據(jù)D抗原是否存在，一般將Rh系統(tǒng)定義為Rh陽性：D抗原陽性Rh陰性：D抗原陰性,Rh血型系統(tǒng),26,Rh陰性知多少,15％,4％,0.4％,Rh血型對輸血影響有多大？,ABO血型發(fā)現(xiàn)后40年才發(fā)現(xiàn)Rh血型無數(shù)Rh陰性人輸了Rh陽性血后無反應(yīng),27,Levine,land

11、steiner,wiener,28,輸血死亡主要原因分析(美國，1980),29,免疫血液學(xué)能解決什么問題,保證人們用血（輸血）,包括血液、血液成分或血液制品的安全、有效。輸血是一項廣泛應(yīng)用且十分重要的治療手段恢復(fù)及維持機(jī)體的氧(O2)供應(yīng)治療臨床上嚴(yán)重的失血性疾病 治療血液系統(tǒng)紊亂性疾病新生兒溶血病的治療,30,如何保證輸血安全有效,檢測獻(xiàn)血員和用血者血液中的抗原和抗體，選擇抗原，抗體盡可能相容的血液進(jìn)行輸血：紅細(xì)胞定

12、型血漿（血清）抗體篩查/抗體鑒定，紅細(xì)胞的直接抗人球蛋白試驗和吸收放散試驗獻(xiàn)血員與受血者之間的交叉配血制備用于輸血的成分血 獻(xiàn)血員的篩查：肝功能，傳染性疾病評價溶血性貧血母嬰相容性檢測,31,我國的采供血程序及輸血前檢測,,志愿獻(xiàn)血員,血液中心（中心血站）,,,,初檢,,復(fù)檢,醫(yī)院,,,輸血,,,篩選合格獻(xiàn)血員,,,,,問卷 快速測試,傳染病檢測：HBs Ag, HCV, HIV ,ALT, Syphilis紅細(xì)胞

13、定型（正定）,采血,進(jìn)口或國產(chǎn)試劑,隨機(jī)檢測,輸血前檢測（1）住院患者血型定型（正定）（2）用血患者血型在此定型（正反定型），（3）交叉配血，抗體篩查，抗體鑒定多數(shù)醫(yī)院輸血前不再進(jìn)行傳染病檢測,32,紅細(xì)胞血型血清學(xué)檢測技術(shù),鹽水凝集法低離子強(qiáng)度鹽水法酶技術(shù)凝聚胺技術(shù)抗人球蛋白檢測法柱凝集技術(shù)檢測法,33,一、鹽水凝集法,紅細(xì)胞和抗血清在鹽水溶液中直接反應(yīng)特點是操作簡便，設(shè)備簡單，缺點是影響因素多，靈敏度低,孵育30

14、分鐘,34,二、低離子強(qiáng)度鹽水法,通過降低介質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度，減少紅細(xì)胞外圍離子云的強(qiáng)度，促進(jìn)IgG分子在兩個紅細(xì)胞間橋聯(lián)，而促進(jìn)凝集特點是縮短抗原抗體反應(yīng)時間，提高反應(yīng)靈敏度,孵育1分鐘,35,三、酶技術(shù),利用木瓜酶或菠蘿酶破壞紅細(xì)胞表面唾液酸，使紅細(xì)胞失去電荷，縮小細(xì)胞間距離同時改變紅細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)，使某些隱蔽的抗原暴露，從而增強(qiáng)凝集反應(yīng)主要用于一些不完全抗體的檢測,,36,四、凝聚胺技術(shù),利用多聚季胺鹽在介質(zhì)溶液中產(chǎn)生大量正

15、電荷中和紅細(xì)胞表面的負(fù)電荷，減少紅細(xì)胞間排斥，促進(jìn)凝集,37,五、柱凝集技術(shù)檢測法,是微柱凝集技術(shù)與上述所有技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物1986年由法國人Dr.Yves Lappierre發(fā)明1994年獲得美國FDA認(rèn)證，目前在許多發(fā)達(dá)國家已經(jīng)作為常規(guī)技術(shù)應(yīng)用于臨床,柱凝集技術(shù)原理,38,六、抗人球蛋白試驗Coombs試驗,在鹽水凝集法或低離子強(qiáng)度鹽水法的基礎(chǔ)上，加入抗人球蛋白抗體，通過抗人球蛋白抗體的特異性橋連作用，促進(jìn)紅細(xì)胞的凝集,39,

16、,加入抗人球蛋白試劑后形成肉眼可見的凝集反應(yīng),抗人球蛋白實驗,40,抗人球蛋白實驗,41,直接抗人球蛋白實驗(DAT)紅細(xì)胞在體內(nèi)(in vivo)即被不規(guī)則抗體所致敏，因此直接加入抗人球試劑即可進(jìn)行測定；如某些過敏性藥物及引起溶血性輸血反應(yīng)的抗體、自身抗體等間接抗人球蛋白實驗(IDAT)紅細(xì)胞在體外(in vitro)首先被不規(guī)則抗體或抗血清試劑所致敏，然后再加入抗人球試劑進(jìn)行測定；如抗體篩查、抗體鑒定、交叉配血等,抗人球蛋白

17、實驗,42,醫(yī)院輸血科的主要職責(zé),提供臨床所需的血液成份提供血型相符或配合的血液為臨床提供血型相關(guān)的檢測診斷,43,輸血前測試流程,44,www.sbc.org.cn,常用輸血前測試方法,1. 平板法 - 細(xì)胞濃度適宜，避免交叉污染，及時觀察結(jié)果2. 試管法 - 加樣順序，反應(yīng)條件，洗滌細(xì)胞注意事項3. 微量板法 - 加樣和振蕩避免交叉污染4. 柱凝集法 - 避免假陽性

18、，使用前觀察凝膠板,45,ABO血型鑒定 Rh血型鑒定 紅細(xì)胞血型抗體篩查/鑒定 交叉配血試驗 HDN血型血清學(xué)檢查,常用輸血前檢測項目,46,方法: 紅細(xì)胞凝集試驗 正定型 用已知抗-A或抗-B定型試劑來測定紅細(xì) 胞上有無相應(yīng)的A抗原或/和B抗原 反定型 用已知A1型細(xì)胞和B型細(xì)胞來測定血清中

19、 有無相應(yīng)的抗-A或/和抗-B 正反定型結(jié)果不一致或有疑問，需進(jìn)一步行ABO血型確認(rèn)試驗。,,ABO血型鑒定,47,ABO血型鑒定正常反應(yīng)結(jié)果,48,Rh血型鑒定,原理: Rh血型系統(tǒng)最常見的抗原主要有C,c,D,E,e 5種。 可分別用抗C、抗c、抗D、抗E、抗e這5種Rh 定型試劑通過血凝試驗來檢查紅細(xì)胞上是否存 在相應(yīng)抗原。

20、在臨床輸血中，一般只做D抗原 的鑒定。凡被檢紅細(xì)胞和抗D試劑凝集者為 RhD陽性，不凝集者為RhD陰性。,49,檢測目的 對受血者的血清或血漿做常規(guī)的抗體篩查試驗，發(fā)現(xiàn)有臨床意義的不規(guī)則抗體。實驗方法 讓受檢的血清/血漿與特殊的試劑紅細(xì)胞組（已知抗原表型的篩選紅細(xì)胞）一起反應(yīng)，以發(fā)現(xiàn)樣品中可能存在的不規(guī)則抗體。,抗體篩查/抗體鑒定,50,測定結(jié)果 反應(yīng)陽性：抗

21、體存在 反應(yīng)陰性：抗體不存在抗體鑒定 抗體一旦被檢出，應(yīng)作抗體鑒定,抗體篩查/抗體鑒定,51,檢測目的 分析受者和供者血液是否完全相符反應(yīng)原理主側(cè)：受者血清/血漿 + 供者紅細(xì)胞次側(cè)：受者紅細(xì)胞 + 供者血清/血漿,交叉配血,52,新生兒溶血病血型血清學(xué)檢查,新生兒溶血病(HDN)是由母嬰血型不合引起, 胎兒和新生兒紅細(xì)胞被來自母體的 IgG抗體致敏, 并在其自身網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)受到免疫

22、性破壞。,53,方法: 嬰兒及其父母ABO/RH血型鑒定 嬰兒及母親血清中血型抗體鑒定 (鹽水介質(zhì)法、酶法、抗球蛋白法等) 嬰兒紅細(xì)胞上 血型抗體鑒定 (抗球蛋白法、放散試驗),新生兒溶血病血型血清學(xué)檢查,54,謝謝各位！,55,強(qiáng)生OCD免疫血液學(xué)產(chǎn)品發(fā)展歷程,1

23、937：Philip B. Hofmann在新澤西創(chuàng)建Ortho公司；1944：Philip Levine博士加入Ortho研究基金會；1947：推出第一個Rh血清凝集試劑及抗人血清；1956：建立、推廣全球第一個標(biāo)準(zhǔn)化交叉配血方法及程序；1960：在美國成立了第一家正規(guī)的血型技術(shù)學(xué)院；1968：第一個防止新生兒Rh系統(tǒng)溶血的藥物－RhoGAM上市；1985：BioClone抗人球蛋白試劑及抗A、抗B試劑上市；1992：更

24、簡便及標(biāo)準(zhǔn)化操作的柱凝集技術(shù)（CAT）血型及交叉配血試劑開發(fā)成功；1997：全球第一臺全自動血型分析系統(tǒng)AutoVue®問世。2000：AutoVue第二代產(chǎn)品AutoVue Innova面世,56,強(qiáng)生OCD全球最大的免疫血液學(xué)產(chǎn)品供應(yīng)商,57,強(qiáng)生OCD提供全面的免疫血液學(xué)解決方案,,,手工,自動,Ortho BioVue?系統(tǒng)工作站,離心機(jī)孵育器工作架移液器,,,,,Ortho AutoVue Innova

25、,Ortho AutoVue Ultra,Ortho AutoVue,58,BioVue® 柱凝集系統(tǒng),BioVue® ：與血型診斷試劑卡配套的手工工作站AutoVue Innova：使用血型診斷試劑卡的全自動分析系統(tǒng),59,臨床檢測項目,血型抗原測定(Blood Typing) 抗體篩查(Antibody Screening) 抗體鑒定(Antibody Identification) 交叉配血(Cr

26、oss Match)抗人球蛋白實驗(Anti-Human Globulin Test),60,Ortho Biovue®血型診斷試劑卡,,,,條形碼,效期,批號,,實驗結(jié)果,,病人ID,試劑卡名稱,六個反應(yīng)柱 合成塑料卡結(jié)構(gòu) 標(biāo)準(zhǔn)微孔板孔間距 條形碼識別 錫箔紙封口,,試劑成份,,61,微 柱,,空氣柱,,玻璃珠,,反應(yīng)艙,,試劑,62,微 柱,橢圓型設(shè)計，較大的結(jié)果觀測區(qū)240µl大容量反應(yīng)艙錐型

27、底部設(shè)計以增加靈敏度預(yù)裝載BioClone®試劑及密度梯度稀釋液2~25℃保存,TOP,FRONT,SIDE,特點：,63,玻璃珠,球狀外形 直徑70~80um 批間穩(wěn)定無差異 惰性物質(zhì)，理化性質(zhì)穩(wěn)定 耐受高速離心 功能類似過濾器,64,密度梯度稀釋液,,離心力作用,未結(jié)合的血清蛋白（低密度）停留在密度梯度稀釋液上面 血清與紅細(xì)胞的混合物（中間密度）在密度梯度稀釋液中 紅細(xì)胞（高密度）移動進(jìn)入玻璃珠