2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、Chapter 5 Modification of Enzyme Molecule,酶分子修飾,酶分子修飾的產(chǎn)生,酶在生物技術(shù)與工程中占有十分重要的地位。酶所具有的反應(yīng)專一性、催化高效性及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn),使其廣泛應(yīng)用在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保及能源等領(lǐng)域。 由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)的特點(diǎn),在催化反應(yīng)中受到穩(wěn)定性、反應(yīng)條件等制約,早期能大規(guī)模應(yīng)用的酶還不夠多,酶工藝也不完善。,酶在使用中的缺陷有:穩(wěn)定性差、活力不夠高

2、、抗原性等,如對酸、堿、重金屬、有機(jī)介質(zhì)、高溫等物理化學(xué)環(huán)境敏感,且活性、專一性、作用條件不能滿足生產(chǎn)工藝要求。 酶分子修飾成為酶工程中具有重要意義和應(yīng)用前景的領(lǐng)域。 隨著蛋白質(zhì)工程的興起與發(fā)展,酶分子修飾與基因工程技術(shù)結(jié)合在一起,使酶分子修飾展現(xiàn)出更廣闊的前景。,Contents of Chapter 5,1、什么是酶分子修飾,2、酶分子修飾的基本要求和條件,3、酶分子的修飾方法,Go,Go,G

3、o,4、酶分子修飾的應(yīng)用,Go,5.1 什么是酶分子修飾?,通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變,從而改變酶的催化特性的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即:在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)(物質(zhì)),特別是具有生物相容性的物質(zhì),進(jìn)行共價連接,從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。,酶分子修飾的意義,提高酶的活力 activity增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 stability降低或消除酶的抗原性 immunological property研究和了解酶分子

4、中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響 structure,5.2 酶分子修飾的基本要求和條件,對酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。(1)酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。 (2)酶活性中心的狀況 活性中心基團(tuán)、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。,酶分子修飾的條件,修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行,并盡量不破壞酶

5、活性功能的必需基團(tuán),使修飾率高,同時酶的活力回收高。(1)pH與離子強(qiáng)度 pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同,反應(yīng)性能也不同。(2)修飾反應(yīng)的溫度與時間 嚴(yán)格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。(3)反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例,5.3 酶分子的修飾方法,金屬離子置換修飾大分子結(jié)合修飾(共價/非共價)側(cè)鏈基團(tuán)修飾肽鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾核苷酸置換修飾酶分子的物理修

6、飾,第一節(jié) 酶的金屬離子置換修飾,把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子,使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。α-淀粉酶中的鈣離子(Ca2+),谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+),過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+),酰基氨基酸酶分子中的鋅離子(Zn2+),超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+),第一節(jié) 酶的金屬離子置換修飾,若從酶分子中除去其所含的金屬離子,酶往往會喪失其催化活性。如果重新加

7、入原有的金屬離子,酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進(jìn)行置換,則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失,有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。,一、金屬離子置換修飾的方法,1、酶的分離純化2、除去原有的金屬離子:加入金屬螯合劑3、加入置換離子,一、金屬離子置換修飾的方法,金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。 用于金屬離子置換修飾的金屬離子,一般都是二價金屬離子。

8、,二、金屬離子置換修飾的作用,闡明金屬離子對酶催化作用的影響提高酶活力增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性改變酶的動力學(xué)特性,定義:利用水溶性大分子與酶結(jié)合,使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變,從而改變酶的特性與功能的方法稱為大分子結(jié)合修飾法。簡稱為大分子結(jié)合法。常用的修飾劑:右旋糖酐(dextran)、聚乙二醇(PEG)、肝素(heparin)、蔗糖聚合物(Ficoll)、聚氨基酸等。大分子結(jié)合修飾是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。,第二節(jié) 大分子

9、結(jié)合修飾,用可溶性大分子,如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等,通過共價鍵連接于酶分子的表面,形成一層覆蓋層。例如:用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶 ,不僅可以降低或消除酶的抗原性,而且提高了抗蛋白酶的能力,延長了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。,共價修飾,第二節(jié) 大分子結(jié)合修飾,每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合,可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍;每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合,酶活力達(dá)到原有酶活力的5.1倍,共價

10、修飾,第二節(jié) 大分子結(jié)合修飾,一、大分子結(jié)合修飾的方法,1、修飾劑的選擇:大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如,聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、蔗糖聚合物(Ficoll)、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。2、修飾劑的活化:作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化,然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。,

11、3、修飾:將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液,以一定的比例混合,在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時間,使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價鍵結(jié)合,對酶分子進(jìn)行修飾。 4、分離:需要通過凝膠層析等方法進(jìn)行分離,將具有不同修飾度的酶分子分開,從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。,一、大分子結(jié)合修飾的方法,一、大分子結(jié)合修飾的方法,聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性,在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性,并可

12、消除酶的抗原性,使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián),因而,它被廣泛用于酶的修飾。,二、大分子結(jié)合修飾的作用,提高酶活力增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性降低或消除酶蛋白的抗原性,,1、通過修飾提高酶活力: 水溶性大分子通過共價鍵與酶分子結(jié)合后,使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變,使酶的活性中心更利于和底物結(jié)合,形成準(zhǔn)確催化部位。例如:每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖苷結(jié)合,可使該酶的活力提高到原有酶活力的2.25倍。,2、通過修飾增加

13、酶的穩(wěn)定性: 酶的穩(wěn)定性用半衰期(指酶的活力降低到原來活力一半時所經(jīng)過的時間)表示。水溶性大分子-修飾水不溶性大分子-固定化,例如:SOD能清除體內(nèi)的超氧負(fù)離子,受到醫(yī)藥界的極大關(guān)注。但是不容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),在體內(nèi)的作用時間短等因素限制了SOD的應(yīng)用。 Beckman等利用PEG修飾SOD使其在血液中的半衰期由幾分鐘提高到數(shù)十小時,降低了抗原性,提高了對胰蛋白酶的消化抵抗功能。ASNase用聚丙氨酸修飾,熱穩(wěn)定性大大提高

14、。木瓜蛋白酶與右旋糖苷結(jié)合,顯著增強(qiáng)其抗酸堿和抗氧化能力。,,3、通過修飾降低或消除抗原: 使抗體或抗原的特定結(jié)構(gòu)改變,則它們之間不再特異結(jié)合。例如:ASNase能專一地催化天門冬酰胺形成天門冬氨酸及氨,是治療白血病的有效藥物。在體內(nèi)作用時間短,反復(fù)注射會在血液中產(chǎn)生抗體,發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。用PEG修飾修飾ASNase,其抗原性可完全消除。,精氨酸酶經(jīng)PEG結(jié)合修飾后,其抗原性顯著降低。色氨酸酶經(jīng)PEG修飾后

15、,完全消除該酶的抗原性。,第三節(jié) 酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾,定義:采用一定的方法(一般為化學(xué)法)使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變,從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法??梢杂糜谘芯扛鞣N基團(tuán)在酶分子中的作用及其對酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團(tuán)時經(jīng)常采用。,第三節(jié) 酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾,酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團(tuán)可以形成各種副鍵,對酶蛋白空間

16、結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變,從而改變酶的特性和功能。,催化活性/非催化活性基團(tuán)的修飾,對非催化基團(tuán)修飾可改變酶的動力學(xué)性質(zhì),改變酶對特殊底物的束縛能力。 經(jīng)常被修飾的殘基是:親核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His親電的Tyr、Trp,常用的化學(xué)修飾劑一、氨基修飾劑:定義:凡能使酶蛋白側(cè)鏈上的氨基發(fā)生改變的化合物。原理:這類試劑作用于酶蛋白側(cè)鏈上的氨基或產(chǎn)生脫氨基,

17、或與氨基共價結(jié)合將氨基屏蔽起來,使氨基原有的副鍵改變,從而改變酶蛋白的構(gòu)象。主要有:二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、亞硝酸、乙亞胺甲酯、O-甲基異脲、順丁烯二酸酐等。,一、氨基,,,二、羧基修飾劑:定義:可與酶蛋白側(cè)鏈上的羧基反應(yīng)的小分子化合物。原理:可使羧基酯化、?;蚪Y(jié)合生成其他物質(zhì),改變酶蛋白的空間構(gòu)象,從而改變酶的催化特性。主要有:乙醇-鹽酸試劑、水溶性的碳化二亞胺等。,二、羧基,碳二亞胺,,三、巰基修飾劑:

18、原理:半胱氨酸殘基側(cè)鏈中含有巰基。許多酶分子中存在的巰基通過形成二硫鍵維持蛋白質(zhì)分子的三維構(gòu)象,對維持酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起重要作用。常用試劑:巰基乙醇、二硫蘇糖醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉等。,三、巰基,四、胍基修飾劑:原理:精氨酸含有胍基。二羰基化合物可與胍基縮合生成穩(wěn)定的雜環(huán)。主要有:環(huán)己二酮、乙二醛、苯乙二醛等,四、胍基,五、酚基修飾劑:原理:酪氨酸殘基上含有酚基。經(jīng)酚基修飾劑修飾后,酶分子由于引入負(fù)電荷,增加了對帶正電荷

19、底物的結(jié)合力,有利于酶催化功能的發(fā)揮。修飾酚基的方法有:碘化法、硝化法、琥珀?;ǖ?。主要有:四硝基甲烷,五、酚羥基,,六、咪唑基,,七、吲哚基,,八、分子內(nèi)交聯(lián)劑:原理:用含有雙功能團(tuán)的化合物,與酶分子內(nèi)兩個側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng),在分子內(nèi)共價交聯(lián),可使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定,從而也使酶的催化穩(wěn)定性增加。主要有:戊二醛、二氨基丁烷、已二胺等。,八、分子內(nèi)交聯(lián)修飾,雙功能試劑可以在酶分子中相距較近的兩個側(cè)鏈集團(tuán)之間形成共價交聯(lián),從而提高酶

20、的穩(wěn)定性。同型雙功能試劑異型雙功能試劑,第四節(jié) 酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾),利用酶分子主鏈的切斷和連接,使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變,從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。,第四節(jié) 酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾),a、胃蛋白酶原(pepsinogen)的激活,b、胰蛋白酶原(trypsinogen)的激活,c、胰凝乳蛋白酶原(chymotrypsinogen)的激活,第

21、五節(jié) 核苷酸鏈剪切修飾,在核苷酸鏈的限定位點(diǎn)進(jìn)行剪切,是酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而改變酶的特性和功能。,第六節(jié) 氨基酸置換修飾,酶蛋白是由各種氨基酸通過肽鍵聯(lián)結(jié)而成的。在特定位置上和各種氨基酸是酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。若將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸,則會引起酶蛋白空間構(gòu)象的某些改變,從而改變酶的催化特性,這種修飾方法,稱為氨基酸置換修飾。,例如:酪氨酰-tRNA合成酶可催化酪氨酸和其所對應(yīng)tRNA,若將該酶第51位的蘇

22、氨酸由輔氨酸置換,經(jīng)修飾后的酶對ATP的親和性提高近100倍,酶活力提高25倍;T4-溶菌酶分子中第3位的異亮氨酸換成半胱氨酸后,該半胱氨酸可與第97位的半胱氨酸形成二硫鍵,氨基酸置換修飾后的T4-溶菌酶,其活力保持不變,但該酶對熱的穩(wěn)定性卻大大提高。,提高酶活力增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性改變酶的專一性,第六節(jié) 氨基酸置換修飾,,置換修飾的作用,,Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸。修飾后,該酶

23、失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力,卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大,成本高,專一性差,而且要對酶分子逐個進(jìn)行修飾,操作復(fù)雜,難以工業(yè)化生產(chǎn)。,第六節(jié) 氨基酸置換修飾,,置換修飾的方法,化學(xué)修飾法,,在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù),第六節(jié) 氨基酸置換修飾,,置換修飾的方法,定點(diǎn)突變技術(shù),,第七節(jié) 核苷酸置換修飾,將酶分子核苷酸鏈上的某一個核苷酸換成另一個核苷酸的方法。,第八節(jié)

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