細(xì)胞培養(yǎng)基本知識基本技術(shù)

1、細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識、基本技術(shù),醫(yī)學(xué)院中心實驗室谷景義85225841,主要內(nèi)容：,1、細(xì)胞培養(yǎng)基本知識2、培養(yǎng)細(xì)胞生長環(huán)境3、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)4、培養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)量控制,一、 細(xì)胞培養(yǎng),把取得的組織用機械或消化的方法分散成單個細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，在體外適宜條件下，使細(xì)胞生長繁殖，并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。,培養(yǎng)細(xì)胞的特性1 -生長方式及類型,貼附型、懸浮型,培養(yǎng)細(xì)胞的特性2 - 增殖特點,體外培養(yǎng)的細(xì)胞既保持了一定的

2、體內(nèi)細(xì)胞的基本特性，但也具有本身的一些特點。貼附-伸展接觸抑制-增殖的密度抑制,貼附-伸展,接觸抑制,當(dāng)一個細(xì)胞被其他細(xì)胞圍繞導(dǎo)致無處可去而保持接觸時，細(xì)胞不再移動，在接觸區(qū)域的細(xì)胞膜活動將停止。因此，一般正常細(xì)胞并不相互重疊于其上生長。,細(xì)胞增殖密度抑制,當(dāng)細(xì)胞生長匯合形成單層時，細(xì)胞變得比較擁擠，這時其分裂停止，這種細(xì)胞可在靜止?fàn)顟B(tài)下維持存活一段時間，但不會繼續(xù)分裂生殖。轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞不同，他們的接觸抑

3、制和增殖密度抑制常常降低，因而可以增殖至較高的終末細(xì)胞密度。,培養(yǎng)細(xì)胞的特性3 -生長過程,單個細(xì)胞增殖：細(xì)胞周期,高等生物體，細(xì)胞周期時間的長短變化主要集中在G1期，S，G2和M期基本保持穩(wěn)定。 Hela 8-16h 5-9h 2-8h 20-28h,一群細(xì)胞的增殖：細(xì)胞生長曲線,接種后，每天進行檢測計數(shù)，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)，繪制成曲線。測定細(xì)胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判

4、定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。飽和密度：在特定條件下，培養(yǎng)器皿內(nèi)能達到的最高細(xì)胞數(shù)，當(dāng)細(xì)胞達到飽和密度后細(xì)胞群體停止繁殖。,潛伏期/滯留期指數(shù)增長期平臺期/停滯期退化或死亡,細(xì)胞系的生長過程細(xì)胞系：原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)首次傳代成功后即成為細(xì)胞系，可泛指一般可以傳代的細(xì)胞。細(xì)胞株：通過篩選或克隆化，從原代細(xì)胞或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的細(xì)胞。細(xì)胞系亞系：由某一細(xì)胞系分離出來，在性狀上與原細(xì)胞系

5、不同的細(xì)胞系，稱該細(xì)胞系的亞系,有限細(xì)胞系（Finite cell line）如果不能繼續(xù)傳代或傳代有限，可稱為有限細(xì)胞系。連續(xù)細(xì)胞系（Continuous cell line）能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做“連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系。可培養(yǎng)50代以上并無限培養(yǎng)下去。大多數(shù)的二倍體細(xì)胞為有限細(xì)胞系。無限細(xì)胞系大多已發(fā)生變異。,原代細(xì)胞：從機體取得組織材料，在體外培養(yǎng)生長，到第一次傳代前。傳代細(xì)胞：當(dāng)原代細(xì)胞持續(xù)生長繁殖一段時間，達到一

6、定的細(xì)胞密度后傳代的細(xì)胞。,培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法,方法： 將培養(yǎng)對象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，再放入培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。,優(yōu)點：1、可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響。2、可以方便地進行顯微鏡觀察、染色等操作，以及永久保存。3、增加了培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面積。,培養(yǎng)板培養(yǎng)法,方法：將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。應(yīng)培養(yǎng)量較小也稱為微量培養(yǎng)。,懸滴培養(yǎng)法也稱植塊懸滴培養(yǎng)法，是最早建立的體外培養(yǎng)技術(shù),基本要點：將組

7、織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營養(yǎng)液懸掛在蓋玻片下，再放置于一凹形載片之上，最后用溶蠟密封后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。,1907 年 -Harrison用細(xì)胞培養(yǎng)解決一個難題蓋玻片覆蓋凹型載玻片懸滴培養(yǎng)法,懸滴培養(yǎng)法基本步驟,1、在蓋玻片上滴加胚胎提取液、血漿和植塊，混勻。培養(yǎng)基凝固后將植塊包埋。,2、在凹載片周圍涂凡士林。將凹載片向下壓向蓋玻片,3、將凹載片反轉(zhuǎn)，蓋玻片周圍涂溶蠟。放入培養(yǎng)箱

8、培養(yǎng),1910 至 1923年 – Carrel 和早期的組織培養(yǎng)卡氏瓶培養(yǎng)法,1943年Earle、Dulbecco等創(chuàng)建單層細(xì)胞培養(yǎng)法，首建長期傳代的L-細(xì)胞系。1951年Gey首建人腫瘤細(xì)胞——Hela細(xì)胞系。從50年代末開始，組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用進入了一個繁盛的階段，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究各個領(lǐng)域。,無血清培養(yǎng),無血清培養(yǎng)基:是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個

9、別蛋白或大量蛋白組分。基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。觀察一種生長因子對某種細(xì)胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。往往針對性很強，價格偏高。,三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng), 使細(xì)胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、

10、生長, 構(gòu)成三維的細(xì)胞-載體復(fù)合物。,普通的細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞在體外改變的環(huán)境下增生逐漸喪失了原有的性狀，往往和體內(nèi)情況不相符，而動物實驗完全在體內(nèi)進行, 但由于體內(nèi)的多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復(fù)雜化, 難以研究單一過程，且難以研究中間過程。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是介于單層細(xì)胞培養(yǎng)與動物實驗之間的一種技術(shù)，既能最大程度的模擬體內(nèi)環(huán)境，又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。應(yīng)用：軟骨和骨組織（軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞，再生損

11、傷的軟骨、骨）循環(huán)系統(tǒng)和心臟（有目的地改變血管形成）,目前常用的三維培養(yǎng)模型： 基質(zhì)覆蓋培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng) 微載體培養(yǎng) 預(yù)置支架培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 自發(fā)性細(xì)胞聚集,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的特點及應(yīng)用,優(yōu)點：1）研究的條件可以人為控制2）研究的樣本均一3）研究內(nèi)容方便觀察、檢測、記錄4）研究的費用相對于經(jīng)濟缺點：體外培養(yǎng)的細(xì)胞不能完全等同于體內(nèi)的細(xì)胞。,應(yīng)用,病毒學(xué)：病毒

12、鑒定，病毒抗原作用，疫苗生產(chǎn)…… 免疫學(xué)：雜交瘤-單克隆抗體……遺傳學(xué)：染色體分析……腫瘤學(xué)：篩選重要的抗腫瘤藥物……分化及發(fā)育：刺激使細(xì)胞群體發(fā)生改變……細(xì)胞毒實驗：藥效測試……臨床醫(yī)學(xué)及生物技術(shù)：干細(xì)胞培養(yǎng)定向誘導(dǎo)分化后移植；組織工程軟骨損傷修復(fù)；試管嬰兒……,二、培養(yǎng)細(xì)胞生長環(huán)境,Substrate,Gas,Medium,Serum,Glass﹠PlasticCultureVessels……,O2CO2

13、……,pHOsmolalityTemperature……,StorageAt 4℃,Supplements,FBSNCS,HormonesGrowth factorsAntibiotic……,,,,,,,Cell Culture Environment,1 、細(xì)胞的營養(yǎng)需求,（1）氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子（2）促生長因子等 完全培養(yǎng)基的組成： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

14、 80％一95％ 血清 5％一20％ 碳酸氫鈉 2.0 g/L 青、鏈霉素 各100單位／毫升,基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇,參考： (1）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。可以查閱參考文獻，或在購買細(xì)胞株時咨詢。 (2) 其它實驗室慣用

15、的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。 (3) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-F12 等……,血清,熱滅活：56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清(目前少用）熱滅活目的：滅活血清中的補體成分。如果不做細(xì)

16、胞因子和免疫相關(guān)的實驗，建議血清不要滅活。   熱處理造成血清沉淀物增多，影響血清質(zhì)量。甚至嚴(yán)重影響細(xì)胞生長速度，且細(xì)胞貼壁率降低。血清中的沉淀物絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理顯微鏡下“小黑點”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認(rèn)為血清受污染。一

17、般情況下，此小黑點不會影響細(xì)胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號的血清,血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清： 胎牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)： 透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。,pH 調(diào)整液,NaHCO3 溶液（堿）常用濃度為7.5%。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存HEPES（分子量238.31）

18、溶液一種弱酸，羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動。 在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES使用終濃度一般為10-50mmol/L常配成1M 儲存液：用20ml 雙蒸水溶解4.76克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時可向100ml培

19、養(yǎng)液中加入2ml HEPES濃縮液，終濃度為20mmol/L,抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。 最終使用濃度為每毫升100單位。,制備1000ml RPMI 1640培養(yǎng)基,RPMI 1640 干粉培養(yǎng)基10.4g（1包） 超純水 400ml 　　　↓　 磁

20、力攪拌至完全溶解  　　　↓　 加超純水定容至1000ml 在超凈臺內(nèi)無菌條件下，用滅菌后的并置有 0.22μm 孔徑濾膜的過濾器除菌，分裝200ml/瓶，-20℃保存?zhèn)溆谩?用前取一瓶溶解，每200ml培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。,消化液,分離組織和分散細(xì)胞常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)

21、 單獨或混合使用,胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細(xì)胞。 胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用,胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks 平衡鹽溶液調(diào)成糊狀，再補足D-Hanks 平衡鹽溶液

22、（常用濃度為0.25% ）攪拌混勻，置室溫 4 小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中， -20℃保存?zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐В?，胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調(diào) pH 至7.2 左右,胰蛋白酶溶液配制,EDTA·4Na 溶液,一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。注意：使用EDTA 處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因

23、殘留的EDTA 會影響細(xì)胞生長,D-Hanks’ 平衡鹽溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS),2、 生存環(huán)境,細(xì)胞培養(yǎng)必須具備細(xì)胞生存并繁殖的生理學(xué)能接受限度內(nèi)的物理化學(xué)特性（1）溫度（2）氣相（3） PH,溫度,體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要在保持一定恒溫的環(huán)境中才能生長。在達到最適溫度（37°）前，一般細(xì)胞繁殖率因溫度的升高而增加，但是，溫度逐步升高并超過最適溫度時，繁殖會被抑制

24、。當(dāng)溫度在25°- 35°，細(xì)胞的生長速度很慢，但能夠生存；細(xì)胞在4°也能存活數(shù)天；只要溫度不低于0°，細(xì)胞都能生存；加了保護劑還能放到液氮中保存。當(dāng)高溫時，在41°- 42°中培養(yǎng)1h，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，43°以上，則多數(shù)細(xì)胞死亡。高溫比低溫對細(xì)胞的影響更為明顯。,氣相和PH,5% CO2 + 95%空氣混合氣體（O2）。CO2既是細(xì)胞生長所需，同時又是細(xì)胞代謝

25、的產(chǎn)物，并與維持培養(yǎng)基的PH有關(guān)。最適PH 7.2 – 7.4 低于PH 6.8或高于PH7.6可能對細(xì)胞有害，甚至死亡。,酚紅指示劑：黃– 6.6 – 橙 – 8.0 – 紅,3、無毒無污染,無 毒：無毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件。凡與 細(xì)胞直接或間接接觸的東西都必須 是無毒的。若具細(xì)胞毒性，細(xì)胞容 易導(dǎo)致死亡。因此，選用器皿和材

26、 料時必須注意。,體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏機體免疫系統(tǒng)，無防御能力，一旦發(fā)生細(xì)菌等污染，細(xì)胞最終會死亡。交叉污染容易使細(xì)胞系失去原有特性。,Cell Culture Basic Technique,Primary Culture,Passage Culture,,,三、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù),selection,cloning,Cell Culture,Cell Line,Cell Strain,1.Primary Cul

27、ture,,,,Continuous cell line,Finite cell line,,,subculture,原代細(xì)胞培養(yǎng),原理：將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用膠原酶）或組織貼壁法處理，得到單個細(xì)胞或細(xì)胞群，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖。儀器、材料及試劑：CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)瓶、平皿、燒杯、吸管、移液槍、手術(shù)器械、計數(shù)板、離心機、水浴箱（37℃）1640/DMEM F12培養(yǎng)基（含10

28、%血清）， 2%膠原酶II，PBS，酒精,組織消化法,1.準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒30分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2.處理組織：采集的標(biāo)本必須在4H內(nèi)完成。取出6-10cm長臍帶，置于燒杯或平皿中，用PBS液漂洗2~3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。,3.剪切：用手術(shù)剪將組織塊剪成2~3立方毫米大小，然后再用眼科剪把組織剪細(xì)成1立方毫米的小

29、塊，以便于消化。加入與組織塊總量1：1的2%膠原酶II，然后一并倒入瓶中，封口。4.消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。37℃ 空氣搖床100轉(zhuǎn)/min，1.5-2h,5.分離：待組織已分散成細(xì)胞團或單個細(xì)胞，立即終止消化，并倒入至少5倍體積的PBS稀釋消化液，隨即通過200目的不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。2500r

30、mp離心消化20分鐘，吸出上清，加入8-10ml PBS，1000rmp離心5min，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。6. 計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。7.換液：24-48H后觀察細(xì)胞是否貼壁，如已有部分細(xì)胞貼壁，可換液繼續(xù)培養(yǎng)。,,,,Monolayer Culture,Suspension Culture,2.Passage Culture,,,Epithelial cel

31、lsBreastCervixKidney,FibroblastsMesenchgmal cell(間質(zhì)細(xì)胞）Connective tissueMuscle tissueEndothelium tissue,Neurectodermal cellsNeurones（神經(jīng)元）Glia(神經(jīng)膠質(zhì)）,Tumor cells,Lymphocyte,Hybridoma,Transformedcells,,,,,,,,

32、2、傳代細(xì)胞培養(yǎng),傳代前的準(zhǔn)備1. 酒精，棉球，鑷子，雜物盒，試管，吸管筒，離心管，培養(yǎng)瓶或板，計時器，筆2. 0.25%胰蛋白酶3. 含血清培養(yǎng)基，PBS,傳代步驟（貼壁細(xì)胞）：1. 鏡下觀察細(xì)胞生長至融合狀態(tài)2. 吸出舊的培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液或PBS清洗兩次（切記要清洗干凈）。3. 消化細(xì)胞：最常用的方法是在培養(yǎng)瓶中添加1ml 0.25%含EDTA的胰酶，培養(yǎng)箱中37°消化5-15s?？筛鶕?jù)不同的細(xì)胞類型調(diào)整

33、消化時間及程度。 在電鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞之間間隙增大，細(xì)胞近乎縮成圓形即可。,4. 終止消化：立即加入含有血清的培養(yǎng)基，用吸管吹打分散細(xì)胞，吹打動作不可過猛，力度要適中，否則容易損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞的氣泡。5. 1000rmp離心5min，棄上清。6. 用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。,Virus infection,Expression products,3.Specific Culture,Cloni

34、ng Culture,Selection Culture,Cytotoxicityassay,Cell Strain,,,,,,,,,,,,無菌操作中的注意事項,在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔操作前,無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30 分鐘滅菌，以75% 或70% ethanol 擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10 分鐘操作時，小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打開之容

35、器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用 操作過程中注意，有菌意識，無菌操作！,基本操作,1、原代細(xì)胞培養(yǎng)2、傳代細(xì)胞培養(yǎng)3、培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察4、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇、運輸,培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察,常規(guī)觀察：培養(yǎng)液顏色（是否變黃）生長增殖變化（經(jīng)歷到哪個時期，長滿否）形態(tài)變化（透明度、折光性、細(xì)胞輪廓）微生物污染（細(xì)菌、霉菌）可用顯微鏡觀察活細(xì)胞及其動態(tài),培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察

36、,細(xì)胞計數(shù)：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。 （細(xì)胞生長曲線圖）,全自動細(xì)胞計數(shù)儀是一款配備了最先進的光學(xué)和圖像分析軟件，可以快速對懸液之中的細(xì)胞進行評估的臺式細(xì)胞分析平臺?，F(xiàn)如今，隨著其具備了熒光應(yīng)用能力——明場和兩路熒光光學(xué)通道，研究人員可以用之進行細(xì)胞計數(shù)、監(jiān)測熒光蛋白表達以及測定細(xì)胞活力。http://www.lifetechnologie

37、s.com/cn/zh/home/brands/product-brand/countess-automated-cell-counter.html?cid=fl-countess,0.5% 臺盼藍法0.5克 臺盼藍加熱溶于100毫升BSS液中（PH7.2-7.4）。細(xì)胞懸液和染液按1：1體積比混合后加蓋玻片，1分鐘后計數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞圓形透明，死細(xì)胞染成藍色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力。,培養(yǎng)細(xì)胞活力的測定,1.

38、0;將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板。 2. 將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。 3. 計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按公式計算：  細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×104說明：公式中除以4，因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。 公式中乘以104

39、因為計數(shù)板中每一個大格的體積為： 1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）=0.1mm3 而 1ml=1000mm3  （注意：鏡下偶見有兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液,細(xì)胞凍存、復(fù)蘇及運輸,及時進行細(xì)胞凍存十分必要：細(xì)胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著

40、傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。細(xì)胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存3個月到一年之久；細(xì)胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。,原理：,細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用二甲基亞砜或甘油作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采

41、用快速融化的方法。這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。,凍存步驟,1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%血清的凍存培養(yǎng)液；2. 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶把單層生長的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中；3. 離心1000rpm，5min；4. 去除胰酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計數(shù)，調(diào)

42、節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml；,5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；6. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時間及操作者；7. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率 -1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入4 ℃冰箱0.5h， -20℃冰箱2h ，-70℃冰箱中過夜，取出凍存管

43、，移入液氮容器內(nèi)。,復(fù)蘇步驟,1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻；3. 離心， 1000rpm，5min；4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。,培養(yǎng)細(xì)胞的運輸,冷凍儲存運輸：利用特殊

44、容器內(nèi)盛有液氮或干冰凍存，保存效果較好，但比較麻煩，且不宜長時間運輸。充液法：選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，充滿培養(yǎng)液到瓶頸部，保留微量空氣，用棉花包裝做防震防壓處理。也可放貼身口袋，一般4-5天都能存活，距離近者還可倒掉培養(yǎng)液直接放口袋運送。,四、培養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)量控制,常見問題：微生物感染，特別是支原體感染，30~60% 錯誤細(xì)胞：被其他細(xì)胞交叉污染；鑒定錯誤的細(xì)胞； 分類錯誤的細(xì)胞，> 15%過度傳代引起遺傳/表觀遺傳的變

45、異或漂移變異克隆形成,形成原因,操作技術(shù)不夠嚴(yán)格、不正確，共用試劑、忘記更換滴管、多種細(xì)胞同時操作,細(xì)胞來源不可靠，引進了錯誤細(xì)胞，從其他實驗室引進了過度傳代細(xì)胞,操作疏忽,共培養(yǎng)體系應(yīng)用,交叉污染細(xì)胞使用的后果,結(jié)果錯誤 Erroneous results: 浪費 Wasted research money推遲成果Potential delay in discovery,錯誤細(xì)胞使用,2000-2004：HeLa污染細(xì)胞的使用，1

46、9/Int 407; 45/WISH; 59/Chang liver; 470/Hep-2; 556/KB; 2004(Buehring ), pubmed 220篇使用細(xì)胞的文章中, 32% 用HeLa細(xì)胞, 僅33%驗證了其身份, 35% 的從其他實驗室引進NCI所使用的 60種用于篩選抗癌藥的細(xì)胞中 ADR-RES 實際是OVCAR-8. 在300 篇論文中用過,Ecv-304,“人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞”,日本實驗室建立，ATCC、

47、DSMZ等機構(gòu)有保藏，在2000年，經(jīng)STR檢測，證明為T24(膀胱癌)，各自網(wǎng)站有公布。在實驗室間廣泛傳播，2006y,全世界600余論文，利用該細(xì)胞進行研究，2/3在中國。Why?Do not know? No other suitable cellular modelExpensieve, can not afford, have to compromise,如何避免,知名保藏機構(gòu)引進已檢定的細(xì)胞（國家實驗細(xì)胞資源共享平

48、臺）支原體檢測，定期進行每次操作一種細(xì)胞不同細(xì)胞培養(yǎng)液分開使用使用抗生素預(yù)防及時準(zhǔn)確做好標(biāo)記,注意：廢棄物處理,首要原則：所有感染性材料必須在實驗室內(nèi)清除污染、高壓滅菌或焚燒。  用以處理潛在感染性微生物或動物組織的所有的實驗室物品，在被丟棄前應(yīng)考慮的主要問題有： 1 、是否已采取規(guī)定程序?qū)@些物品進行了有效的清除污染或消毒？ 2 、丟棄已清除污染的物品時，是否會對直接參與

49、丟棄的人員，或在設(shè)施外可能接觸到丟棄物的人員造成任何潛在的生物學(xué)或其他方面的危害？ 3.清除污染 高壓蒸汽滅菌是清除污染時的首選方法。需要清除污染并丟棄的物品應(yīng)裝在容器中。任何高壓滅菌后重復(fù)使用的污染（有潛在感染性）材料不應(yīng)事先清洗，任何必要的清洗、修復(fù)必須在高壓滅菌或消毒后進行。 也可采用其他除去／或殺滅微生物的替代方法 4.污染性材料和廢棄物的處理和丟棄程序 要對感染性物質(zhì)及其包裝物進行鑒別并分別進行