臨床細(xì)菌室厭氧菌培養(yǎng)基本程序張秀珍

1、臨床細(xì)菌室厭氧菌培養(yǎng)基本程序,張秀珍,內(nèi)容,厭氧培養(yǎng)基本設(shè)備厭氧標(biāo)本采集和運(yùn)送步驟厭氧菌的分離和鑒定步驟厭氧菌的報(bào)告厭氧菌的藥敏試驗(yàn)厭氧菌的菌種保存,厭氧培養(yǎng)基本設(shè)備,厭氧菌培養(yǎng)的基本條件及設(shè)備,設(shè)備 北京醫(yī)院細(xì)菌室采用方式 生產(chǎn)廠商床邊采樣設(shè)備 厭氧袋試驗(yàn)合，內(nèi)含氣體發(fā)生器 及指示劑共20套(45534) 法國(guó)生物梅里埃輸送

2、培養(yǎng)基 Amies輸送瓊脂(41998、41999) 難辯梭菌瓊脂(43213) 法國(guó)生物梅里埃常規(guī)準(zhǔn)備培養(yǎng)基 厭氧血瓊脂或 斯氏瓊脂+5%羊血(43273) 斯氏萬(wàn)古霉素+5%羊血(43223) 自制或法國(guó)生物梅里埃厭氧氣袋 厭氧氣體發(fā)生器 10個(gè)/盒(96121) 法國(guó)生物梅

3、里埃厭氧盒或厭氧罐 5～10個(gè)厭氧盒(96127)： 法國(guó)生物梅里埃厭氧罐： 英國(guó)OXOID公司 法國(guó)生物梅里埃,厭氧培養(yǎng)的培養(yǎng)基,初代接種厭氧菌最好使用新配制的培養(yǎng)基。 平板培養(yǎng)基無(wú)需在厭氧條件下貯存，用前可進(jìn)行預(yù)還原，但厭氧條件下貯存可延長(zhǎng)培養(yǎng)基的有效期。實(shí)驗(yàn)室常規(guī)準(zhǔn)備厭氧培養(yǎng)分離的培養(yǎng)基是厭氧血瓊脂.,必備厭氧培養(yǎng)用培養(yǎng)基,斯氏瓊脂+5%羊血

4、：適用所有厭氧菌生長(zhǎng)斯氏萬(wàn)古霉素+5%羊血：適用革蘭陰性厭氧菌的分離難辯梭菌選擇培養(yǎng)基(CCFA)：分離難辯梭菌改良厭氧血平皿,改良厭氧血平皿配制,成分：血瓊脂基礎(chǔ)按配方 半胱氨酸： 0.4克 氯化血紅素(5mg/ml): 1ml 1%維生素K1: 0.1ml配制方法:上述各成分混合，加熱溶解冷卻后調(diào)整pH7.4。高壓滅菌后冷卻至50℃時(shí)加入5-10%的脫釬維

5、羊血，混合后傾注平皿。用途：營(yíng)養(yǎng)好可供大多數(shù)厭氧菌生長(zhǎng)質(zhì)量控制：產(chǎn)黑色素普雷沃菌形成典型菌落和色素；產(chǎn)氣夾膜梭菌有雙圈溶血。,幾種重要的厭氧選擇培養(yǎng)基,卡那霉素、萬(wàn)古霉素溶血平板 (KVB)：類桿菌屬，特別是脆弱類桿菌和產(chǎn)黑色素?cái)M桿菌、卡那霉素膽鹽七葉苷平皿 (BBE)：脆弱類桿菌環(huán)絲氨酸、先鋒克西叮、果糖、蛋黃平皿(CCFA)：難辯梭菌,提供厭氧環(huán)境方法：,使用厭氧罐+換氣法、厭氧罐+產(chǎn)氣袋法厭氧袋+產(chǎn)氣袋法厭氧手套箱法

6、。配指示劑,厭氧培養(yǎng)裝置,厭氧手套箱：價(jià)格昂貴、操作時(shí)間長(zhǎng)、氣體消耗大、不易推廣厭氧盒+厭氧氣袋：應(yīng)用最普遍、簡(jiǎn)便或厭氧罐+厭氧氣袋：方便實(shí)用厭氧罐抽氣換氣法：需配置抽氣換氣裝置第二代厭氧氣體發(fā)生劑不需加水、不需觸酶,厭氧標(biāo)本的選擇、采集和運(yùn)送,可疑厭氧菌感染特征,感染局部產(chǎn)生氣體分泌物有惡臭分泌物帶血或呈黑色粘膜周圍的感染，如肛周、口腔、鼻竇、咽頰等細(xì)菌培養(yǎng)陰性，但有菌血癥表現(xiàn)長(zhǎng)期使用氨基糖苷類抗生素，但無(wú)效者

7、有基礎(chǔ)疾病免疫低下者,需做厭氧血培養(yǎng)的高危人群,腸膿毒癥、女性生殖道感染、褥瘡及呼吸道感染患者ICU患者或近期做過(guò)腹部外科手術(shù)的患者嚴(yán)重?zé)齻屯鈧颊甙橛袊?yán)重心血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤、移植和免疫抑制患者老年患者臨床高度懷疑有厭氧菌感染的患者,絕大多數(shù)住院患者需要做厭氧血培養(yǎng),1.正確地選擇標(biāo)本,下列細(xì)菌學(xué)指征有助于選擇標(biāo)本做厭氧培養(yǎng)：（1）深部傷口或軟組織膿腫的膿，特別是伴有惡臭或含有硫磺顆粒時(shí)。（2）可疑為氣性壞疽或

8、少見(jiàn)的嚴(yán)重產(chǎn)氣或壞死性感染所取得的壞死組織或病灶清除材料。（3）粘膜部位的感染灶取得的材料。（4）從腦、肺、肝或其他器官的膿腫或從腹腔內(nèi)、肛周、隔下或其他部位的膿腫取得的材料。,,（5）無(wú)菌區(qū)感染灶的吸出液(包括血液、腦脊液、腹水、胸水、滑膜液、羊水等)。（6）人或動(dòng)物咬傷感染灶取得的材料。（7）變黑的或置于紫外線發(fā)紅色熒光的滲出物。（8）革蘭染色，鏡下見(jiàn)到具有厭氧菌獨(dú)特形態(tài)的材料。（9）可疑引起肉毒桿菌食物中毒的食物。,2

9、.正確地收集標(biāo)本,不能做厭氧培養(yǎng)的標(biāo)本：（1）咽、鼻、尿道或直腸拭子。（2）咳出的痰，通過(guò)支氣管鏡取的分泌物，排出或?qū)С龅哪?、糞及胃內(nèi)容物。,可做厭氧培養(yǎng)的標(biāo)本,（1）從未開(kāi)放的膿腫抽取膿液。（2）通過(guò)胸腔穿刺抽出的胸腔液。（3）從恥骨聯(lián)合上方做膀胱穿刺吸出或從腎造口管收集的尿。（4）氣管切開(kāi)吸取的肺分泌物。 （5）女性生殖器：后穹隆穿刺。,,（6）穿刺抽出的腹腔液。（7）通過(guò)腰椎穿刺抽出的腦脊液。（8）竇道標(biāo)本可

10、插入小導(dǎo)管用注射器吸出，注射器和針頭內(nèi)的氣體應(yīng)全部排出，將其內(nèi)容物直接注入一個(gè)已排出氣的無(wú)菌試管內(nèi)。也可自竇道損傷部位取材做活組織檢查。,3.床邊采集標(biāo)本的步驟,1.除去表面陳舊的膿和分泌物,從深處吸出或刮取標(biāo)本.2.首先接種在厭氧培養(yǎng)基,立即置厭氧盒或厭氧罐內(nèi),同時(shí)撕開(kāi)并放入產(chǎn)氣袋,放指示劑,立即蓋好蓋或封好厭氧袋口.3.剩余部分標(biāo)本種需氧培養(yǎng)基4.剩余最后標(biāo)本作涂片兩張5到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，將已接種需氧和厭氧的培養(yǎng)皿置35度培養(yǎng),

11、4.血液以外無(wú)菌體液接種,膽汁、胸腹水、腦脊液等無(wú)菌體液：按比例直接種入?yún)捬跹囵B(yǎng)瓶中抽取標(biāo)本種入?yún)捬踉鼍囵B(yǎng)基，同時(shí)接種厭氧血平皿，全部放厭氧罐，立即放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋并立即蓋好蓋，放35度培養(yǎng)48h。,5.不能立即接種的厭氧標(biāo)本,1.由主管醫(yī)生采集,必須深部新分泌物2.采集后立即放入輸送培養(yǎng)基3.24h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室,厭氧標(biāo)本采集的方法,帶著厭氧產(chǎn)氣袋和厭氧袋或厭氧罐到床邊采集標(biāo)本無(wú)菌體液如胸腹水、膽汁和血均可注入自動(dòng)

12、血培養(yǎng)系統(tǒng)的厭氧培養(yǎng)瓶。不 能立即接種的標(biāo)本應(yīng)采用輸送培養(yǎng)基，可保存厭氧菌24-48h,厭氧標(biāo)本的分離和鑒定,厭氧菌分離的基本分離步驟,第一次耐氧試驗(yàn):初始標(biāo)本需氧和厭氧對(duì)照,發(fā)現(xiàn)可疑菌落(需氧環(huán)境不生長(zhǎng)菌落)第二次耐氧試驗(yàn):多個(gè)可疑菌落分別接種需氧和厭氧平皿,分別置35度作需氧和厭氧培養(yǎng).第三次耐氧試驗(yàn):取僅厭氧環(huán)境生長(zhǎng)菌落分別在35度厭氧和需氧環(huán)境培養(yǎng),如分離的菌落僅在厭氧環(huán)境生長(zhǎng),可確定該菌為厭氧菌.,厭氧菌的鑒定步

13、驟和方法,耐氧試驗(yàn):3-4次耐氧試驗(yàn)涂片革蘭染色生物特征:API 20A;Ripid 32; VITEK-32 ANI色譜分析分子生物學(xué),直接涂片檢查,當(dāng)有足夠的標(biāo)本或收到兩個(gè)拭子時(shí)，最好在接種前做涂片革蘭染色鏡檢，檢查結(jié)果可提示需要接種哪些培養(yǎng)基（非常規(guī)使用的）。涂片檢查可看出有無(wú)細(xì)菌，微生物的類型和大概的數(shù)量以及芽胞、形狀和位置（芽胞梭菌）、著色情況及菌體特征。對(duì)血性液體或濃稠分泌物用丫啶橙染色比革蘭染色較易觀察。這些初

14、步結(jié)果應(yīng)該及時(shí)向主管醫(yī)生報(bào)告，以幫助他們正確選用抗菌藥物。涂片檢查可核對(duì)培養(yǎng)結(jié)果是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的一個(gè)重要指標(biāo)。,,,,厭氧菌鑒定依據(jù) 根據(jù)菌體形態(tài)、染色反應(yīng)、菌落性狀以及對(duì)某些抗生素的敏感性等作出初步鑒定。最后鑒定是一系列生化及終末代謝產(chǎn)物。 1．形態(tài)與染色 僅供參考，因不同培養(yǎng)基，不同菌齡其形態(tài)與染色性不同，厭氧培養(yǎng)時(shí)間往往較長(zhǎng)，因有的G＋變?yōu)镚－。 2．菌落性狀 不同厭氧菌菌落形

15、狀和性質(zhì)不同，梭菌的菌落特點(diǎn)是形狀不規(guī)則，而無(wú)芽胞厭氧菌多呈單個(gè)的圓形小菌落。,（1）  色素：產(chǎn)黑色素普魯沃菌培養(yǎng)2~10天可產(chǎn)生黑褐色或黑色色素，齲齒放線菌培養(yǎng)3~4天后產(chǎn)生粉紅色色素，奈氏放線菌延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間可產(chǎn)生黃褐色色素。 （2）  溶血：產(chǎn)氣莢膜梭菌在新鮮血平板上可形成雙溶血圈，但同種的菌不同株則往往產(chǎn)生溶血性的差異，各細(xì)菌產(chǎn)生的溶血毒素不同，對(duì)不同動(dòng)物紅細(xì)胞溶解亦有差異。 （3） 

16、; 熒光：產(chǎn)黑色素普魯沃菌，菌落在紫外線照射下，發(fā)出磚紅色熒光，梭桿菌常發(fā)生黃綠色熒光，艱難桿菌發(fā)生綠色熒光。 3. 耐氧試驗(yàn) 厭氧菌必須做耐氧試驗(yàn),4. 藥物鑒定試驗(yàn) 大多數(shù)類桿菌對(duì)卡那霉素耐藥，梭桿菌屬敏感，厭氧菌對(duì)滅滴靈敏感，非厭氧菌耐藥。 5. 聚茴香腦磺酸鈉（SPS）敏感試驗(yàn) 厭氧消化鏈球菌對(duì)50g/L的SPS溶液敏感，而絕大多數(shù)其它G＋球菌耐藥 6. 生化特性 主要包括多種糖類

17、發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、卵磷脂酶試驗(yàn)、脂肪酶試驗(yàn)、蛋白溶解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、膽汁內(nèi)肉湯生長(zhǎng)試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)，其方法多種多樣。,7. 氣液相色譜 氣液相色譜技術(shù)（GLC）是一種以氣體或液體為流動(dòng)相，以涂固定液的載體為固定相。采用沖洗法的柱色譜分離技術(shù)。目前用來(lái)分析細(xì)菌終末代謝產(chǎn)物，結(jié)果可靠。 8．PCR、基因探針。,厭氧菌的鑒定,I級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)達(dá)到的標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)耐氧試驗(yàn)結(jié)果，革蘭染色，菌落特點(diǎn)提供厭

18、氧菌初步推斷報(bào)告。II級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)達(dá)到的標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)革蘭染色反應(yīng)，鏡下形態(tài)，菌落形態(tài)，耐氧試驗(yàn)，用自制或國(guó)產(chǎn)傳統(tǒng)生化反應(yīng)試劑定種。III級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)達(dá)到的標(biāo)準(zhǔn)：除II級(jí)實(shí)驗(yàn)室所選擇的鑒定方法外，能采用國(guó)際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)化鑒定系統(tǒng)。如API-20A、Micro ID、Vitek-ANI ，氣--液相色譜儀。,簡(jiǎn)單步驟 (適用無(wú)條件作鑒定單位),床邊采樣或輸送培養(yǎng)基　　　　　┌────────────────────┼─────────

19、──────────┐　　　　 涂片記錄 　　　　　　厭氧血瓊脂 　　　　 需氧培養(yǎng) 染色不勻　　　　　平皿 羊血瓊脂

20、 典型厭氧菌 　　　　　48h35℃厭氧培養(yǎng) 　　　　　 中國(guó)藍(lán)瓊脂 形態(tài)可作一 　　　　　　│ 　　　　　　│ 初步報(bào)告 　　　　可疑菌落作耐氧試驗(yàn)

21、 　　　　 24h 35℃需O2 ┌─────┴──────┐ 　　　　 ┌───┴───┐　　 　　　　　　 厭氧血碟 需氧血碟 　　　　 涂片 　　　 鑒定

22、 48h厭氧培養(yǎng) 24h需氧培養(yǎng)　 　　 ┌────┴────┐　　┌────┴────┐ 生長(zhǎng)

23、 不生長(zhǎng) 不生長(zhǎng) 生長(zhǎng) 繼續(xù)做第二次 非厭氧菌 可疑厭氧菌與厭氧 非厭氧菌 耐氧試驗(yàn)

24、 培養(yǎng)對(duì)照決定 ┌──────┴──────┐ 　　　　　　 厭氧生長(zhǎng) 需氧不生長(zhǎng) │ 涂片報(bào)告,報(bào)告方式,無(wú)條件作生物特征鑒定的實(shí)驗(yàn)室：在三次耐氧試驗(yàn)證明

25、菌株只能在厭氧生長(zhǎng)者可用下面方式報(bào)告。如革蘭陰性厭氧球菌；革蘭陽(yáng)性有芽胞桿菌，芽胞呈鼓捶壯；有條件實(shí)驗(yàn)室應(yīng)將細(xì)菌鑒定到種報(bào)告到種,9.厭氧菌的藥敏試驗(yàn),厭氧菌感染以經(jīng)驗(yàn)用藥為主：* 厭氧菌對(duì)現(xiàn)已上市的藥物的敏感性有合理的預(yù)測(cè)性* 藥敏試驗(yàn)報(bào)告時(shí)間太長(zhǎng)（4～6天）厭氧菌藥敏試驗(yàn)指征：* 嚴(yán)重感染，如心內(nèi)膜炎、腦膿腫、骨髓炎治療時(shí)期長(zhǎng)，觀察藥 物敏感性變化。* 經(jīng)驗(yàn)用藥無(wú)效* 對(duì)新藥評(píng)價(jià)*

26、 耐藥監(jiān)測(cè),目前可推薦的厭氧菌藥敏方法,瓊脂稀釋法Etest法ATB-ANA試條,質(zhì)控菌株MIC范圍,抗生素MIC范圍（μg/ml)________脆弱類桿菌多形類桿菌產(chǎn)氣莢膜桿菌ATCC25285ATCC29741ATCC13124阿莫西林/棒酸0.25～10.5～2--------氨芐西林/舒巴坦0.5～20.5～2--------頭孢西丁8～3232

27、～128--------頭孢替坦4～1632～128--------頭孢噻污8～3216～640.06～0.25頭孢曲松32～12864～256-------氯林可霉素0.5～22～80.03～0.12滅滴靈0.25～10.5～20.12～0.5氯霉素2～84～162～8亞胺培南0.03～0.120.06～0.250.03～0.12,菌種

28、保存技術(shù)要點(diǎn)：,（1）對(duì)需要長(zhǎng)期保存的菌種，采用脫脂牛奶冷凍干燥方法進(jìn)行保存，其復(fù)溶效果及細(xì)菌存活率較用肉湯、血漿等附形物要好；（2）對(duì)中短期保存的菌種，根據(jù)菌種的不同采用脫脂牛奶、血漿、全血、10%甘油、濾紙片、半固體瓊脂培養(yǎng)基及瓊脂平板傳代等方法進(jìn)行保存；（3）菌種保存溫度的選擇，根據(jù)不同菌種選用室溫石蠟覆蓋法、室溫厭氧濕盒法、2℃~8℃、-30℃~-80℃冷藏保存等不同的條件進(jìn)行保存。,參考菌株保存方法,高層瓊脂非苛養(yǎng)菌

29、瓊脂斜面現(xiàn)用菌株低溫速凍苛養(yǎng)細(xì)菌冷凍干燥長(zhǎng)期保留菌株,1. 短期保存菌種：,一般細(xì)菌可采用半固體過(guò)夜培養(yǎng)覆蓋石蠟油（1cm厚）后，于4℃保存（假單胞菌于室溫保存），如有微生物自動(dòng)鑒定儀可將鑒定卡片放低溫冰箱保存?？琉B(yǎng)性細(xì)菌和厭氧菌，可采用平皿傳代的方法保存。,2. 長(zhǎng)期保存菌種：,冷凍干燥是長(zhǎng)期保存細(xì)菌最好的方法。不常用的細(xì)菌最好凍干保存。經(jīng)?；蚨ㄆ谑褂玫模ㄓ袀鞔拗频模┚N，應(yīng)采用多支分裝低溫冷凍保存，載體可根據(jù)條件進(jìn)

30、行選擇（脫脂牛奶、血漿、全血、10%甘油、濾紙片等）。,3.厭氧菌的保存,冷凍真空干燥是最好的保存方法，但不易做到。 平皿傳代是較簡(jiǎn)單且實(shí)用的方法。將需要保存的菌株接種于布氏血瓊脂平板上，放入?yún)捬豕蓿ɑ虼┲杏诜跸渲信囵B(yǎng)48小時(shí)后，放室溫陰涼處可保存兩個(gè)月。,,4. 細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的保存：,為了防止細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的丟失，應(yīng)盡量減少菌種的傳代次數(shù)，最好與低溫冰箱中保存。在轉(zhuǎn)種帶有耐藥質(zhì)粒的細(xì)菌時(shí)，應(yīng)選用含有一定量的相應(yīng)（耐藥）