實驗專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系

1、實驗專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系,,腫瘤轉(zhuǎn)移（Tumor Metastasis）是指腫瘤細胞脫離原發(fā)生長部位，通過各種途徑的轉(zhuǎn)運，在機體內(nèi)遠離原發(fā)部位的器官/組織繼續(xù)增殖生長，形成轉(zhuǎn)移瘤的過程。大體包括以下步驟：1）原發(fā)灶腫瘤細胞大量增殖，新生血管生長；2）腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落，侵襲細胞外基質(zhì)與基底膜，進而侵入血管、淋巴管或體腔。在這過程中，腫瘤細胞會分泌包括基質(zhì)金屬蛋白酶在內(nèi)的多種酶類；3）極少數(shù)腫瘤細胞在循環(huán)系統(tǒng)中

2、存活，形成癌栓，隨血流、淋巴流遷移到另一遠隔部位或器官；4）腫瘤細胞與靶器官的毛細血管壁發(fā)生黏附，穿出血管形成微小轉(zhuǎn)移灶，細胞增殖并產(chǎn)生新的血管，形成與原發(fā)腫瘤性質(zhì)一致的繼發(fā)瘤，腫瘤細胞可以發(fā)生二次侵襲和轉(zhuǎn)移。,腫瘤細胞的侵襲移動,腫瘤細胞侵襲是指腫瘤細胞粘附并穿越細胞外基質(zhì)，包括三個重要的步驟：粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，細胞經(jīng)缺口移動。腫瘤細胞對周圍組織和血管的侵襲是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞在原灶外存活和增

3、殖，這是癌癥對人類生命的最大威脅。,基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMPs）是一類依賴金屬離子鋅（Zn2＋)，并以細胞外基質(zhì)組分作為底物的蛋白酶。MMPs家族已分離鑒別出26個成員，編號分別為MMP1～26。根據(jù)作用底物以及片斷同源性，將MMPs分為6類，為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素、基質(zhì)溶解素、Furin活化的MMPs和其他分泌型MMPs。MMPs蛋白由多個結(jié)構(gòu)域組成：1）N端有一段17~29個

4、殘基，富含疏水氨基酸的信號肽，所以這類蛋白均為分泌蛋白；2）后面是大約80個氨基酸組成的前肽，保守序列PRCGVPNPD中的半胱氨酸對酶原形式的維持至關(guān)重要；3）催化結(jié)構(gòu)域由160～170個殘基組成，含有高度保守序列HEXGHXXGXXH（X表示任意的氨基殘基），其中的3個組胺酸與活性中心的鋅離子結(jié)合；4）除了MMP-7、MMP-23和MMP-26外，其他MMPs的C末端都有一個類血紅素結(jié)構(gòu)域，參與大分子底物的識別以及與組織金屬蛋白酶抑

5、制劑（Tissue Inhibitors of Metalloproteinases，TIMPs）的結(jié)合。,MMPs蛋白以酶原形式分泌，當(dāng)機體需要時被其它蛋白酶水解分裂而激活。在生理pH值環(huán)境中，能夠降解細胞外基質(zhì)成分，參與細胞外基質(zhì)重建，調(diào)節(jié)細胞黏著，直接或間接參與胚胎發(fā)育、組織再塑及創(chuàng)傷修復(fù)等正常生理功能。并在多種疾病病理過程中發(fā)揮作用，如炎癥反應(yīng)、惡性腫瘤浸潤、動脈粥樣硬化、腦血管病和多發(fā)性硬化等。 在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中，較重要

6、的有MMP-2與MMP-9等,MMP-2又稱為明膠酶A，其基因位于人類染色體16q21，主要由纖維結(jié)締組織細胞和腫瘤細胞產(chǎn)生。以相對分子質(zhì)量為72kDa的酶原形式分泌后，N端裂解掉80個氨基酸成為相對分子質(zhì)量為66Da或62Da而被激活為活化型MMP-2；MMP-9又稱為明膠酶B，其基因位于染色體20q12-q13，主要由單核細胞、巨噬細胞多形核白細胞和腫瘤細胞產(chǎn)生。以前酶原（相對分子質(zhì)量為78～82Da）的形式合成，后經(jīng)裂解掉19個

7、氨基酸的信號肽，再糖基化而轉(zhuǎn)變成相對分子質(zhì)量為95Da的酶原形式，酶原降解掉N端73個氨基酸產(chǎn)生此酶的活化形式（相對分子質(zhì)量為84kDa）。本專題實驗中，我們將用明膠酶譜法檢測一系列腫瘤患者以及對照正常人血清中MMP-2與MMP-9的活性，以探討其在腫瘤患者血清中的表達水平，從而加深同學(xué)們對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程的認識。,一、實驗?zāi)康恼莆彰缸V法測定MMP-2與MMP-9活性的原理熟悉酶譜法操作技術(shù)了解測定MMP-2與MMP-9活性的意

8、義,實驗 酶譜法分析食管癌中MMP-2與MMP-9活性,酶譜法是酶活性的測定方法之一。酶活性的大小通常由酶降解底物的速度與程度決定。酶譜法將酶的底物均勻地鋪在聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)，先將樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后創(chuàng)造酶作用的適宜環(huán)境，使酶恢復(fù)活性，在凝膠上降解底物。該凝膠通過染色，可呈現(xiàn)酶作用的痕跡。比較不同樣品該痕跡的大小，可知酶活性的差異。,二、背景與原理,（一） SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 電泳

9、 帶電的膠?；虼蠓肿釉谕饧与妶鲋?，向帶相反電荷的電極作定向移動的現(xiàn)象稱為電泳。,ν質(zhì)點移動速度，q質(zhì)點所帶凈電荷量，E為電場強度，r為質(zhì)點半徑，η為介質(zhì)粘度。,以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳。 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N′-甲叉雙丙烯酰胺在催化劑過硫酸銨的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。過硫酸銨的催化作用需要TEMED的幫助。,聚丙烯酰氨凝膠電泳,在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機

10、械性能好；化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶對pH和溫度變化較穩(wěn)定幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率,聚丙烯酰胺凝膠

11、特性,聚丙烯酰胺凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。聚丙烯酰胺凝膠電泳具有分子篩效應(yīng)。蛋白質(zhì)在該電泳中保持完整的狀態(tài)，依三種因素分開：蛋白大小、形狀和電荷。,SDS，即十二烷基磺酸鈉,SDS具有親脂的長尾和親水性頭（帶負電）SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)給蛋白質(zhì)穿上帶負電的“外衣”，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了，因而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入一定量的SDS，則蛋白質(zhì)分

12、子的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小,SDS及其作用,SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳可用于測定相對分子質(zhì)量大小,電泳時，需要注意凝膠網(wǎng)孔大小對分析的影響。凝膠濃度越大，網(wǎng)孔越小，影響大分子的移動；凝膠濃度越小網(wǎng)孔越大，對小分子的分子篩效應(yīng)越小。,按照緩沖液的pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類： 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)分離。 不

13、連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度以及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。,不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液2種孔徑的凝膠、

14、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素,不連續(xù)系統(tǒng)的特點：,“快慢離子”理論： 電泳開始時，樣品在濃縮膠pH=6.8，甘氨酸電離較小，甘氨酸根離子帶電最少，移動最慢，是“慢離子”。而HCl完全解離成氯離子，氯離子移動最快，是“快離子”。蛋白速度居中。 電泳開始后，氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較

15、高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。 進入分離膠后，pH=8.8，甘氨酸電離完全，快慢離子層消失。,濃縮膠的作用是把加入的樣品濃縮至一個狹窄的區(qū)帶,MMP-2（明膠酶A）和MMP-9（明膠酶B）的底物是明膠。將明膠加到配制聚丙烯酰氨凝膠的溶液中，隨著凝膠的形成底物明膠被均勻地鋪在了凝膠內(nèi)含MMP-2與MMP-9的樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，MMP-

16、2與MMP-9得已分開。但此時由于SDS的干擾，MMP-2與MMP-9不能發(fā)揮其酶活性，不能降解底物。用洗滌液去除SDS后，在含二價金屬離子的緩沖溶液中孵育，MMP-2與MMP-9降解凝膠內(nèi)底物明膠。用考馬斯亮藍染色后，就能看到酶作用的痕跡——藍色背景下的“白點”。通過比較該白點的大小，可知不同樣品中明膠酶活性大小差異。,（二）明膠酶譜法,樣品制備: 適量血清、條件培養(yǎng)基濃縮液樣品，肝組織總蛋白提取液樣品直接與5×SDS

17、 樣品緩沖液混勻進行下一步實驗，如酶活性太高造成顯帶不理想，可適當(dāng)進行稀釋;凝膠的制備: 玻璃板對齊后放入夾中垂直卡緊。按下表配10％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，然后膠上加一層異丙醇，以隔離空氣中的氧，促進凝膠聚合。膠凝后（異丙醇和膠之間有一條折射線），再等5min使膠充分凝固，倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按下表配4％的濃縮膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直

18、向上輕輕將其拔出。,三、操作步驟,在每個加樣孔中加入20 µl樣品;電泳： 在4℃ 100V下，約3h;凝膠的處理：電泳結(jié)束后，取下凝膠，放入平皿中，用洗滌緩沖液在室溫搖動下洗滌1h，其間換液一次；棄去洗滌緩沖液，然后加入孵育緩沖液沒過膠面，至37℃恒溫箱中，24h后取出；棄去孵育緩沖液，加入0.1%考馬斯亮藍染液染色約30min，回收染液，加入脫色液脫色至藍色背景和白色條帶均十分明顯時，用5％乙酸中止脫色；待凝膠

19、在5％乙酸中恢復(fù)到適當(dāng)大小后，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析結(jié)果，以白色條帶的凈光密度值相對定量樣品中酶活性。,預(yù)期實驗結(jié)果,制備聚丙烯酰胺時應(yīng)注意排除氣泡 。明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液 配制應(yīng)嚴格準(zhǔn)確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。制膠時，用厚度大的梳子做上樣孔孵育的37 ℃不要在CO2培養(yǎng)箱中，因為會改變孵育液的pH值，在普通孵箱即可。明膠要4℃保存，配好后1周內(nèi)使用。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰