第四章抗生素效價的微生物檢定法

1、第四章：抗生素效價的微生物檢定法,授課人:汪穗福(高級講師) 蘇惠虹(助理講師) 廣州市醫(yī)藥中專學校,教學目標： １.解釋抗生素概念、敘述醫(yī)療用抗生素特點、 了解抗生素的主要作用機制 ２.敘述抗生素的效價和單位及其表示方法 ３.熟知抗生素效價檢定操作流程與基本要求 ４.述說測定原理。,教學重點： 抗生素概念、醫(yī)療用抗生素特點、抗生素的效價和單位及其表示方法 抗生素

2、效價檢定操作方法與基本要求,教學難點：抗生素效價檢定操作方法二劑量法效價計算公式抗生素的主要作用機制,第一節(jié) 概述第二節(jié) 抗生素的效價和單位第三節(jié) 管碟法測定操作第四節(jié) 二劑量法總結及作業(yè),第一節(jié) 概述 一、抗生素的主要作用機制 １、抑制細胞壁的合成 ２、影響細胞膜的功能 ３、干擾蛋白質(zhì)的合成 ４、抑制核酸的合成 二、抗生素的概念:抗生素主要是由微生物所產(chǎn)

3、生的極微量便具有選擇性地殺死或抑制它種生物或腫瘤、細胞生長的一類天然有機化合物。 三、醫(yī)藥用抗生素的特點： (1)有較大的差異毒力 ：差異毒力越強，越有利于臨床應用?！?(2)抗菌活性強：MIC值越小，表示活性越強。 　 (3)抗菌譜廣：廣譜抗生素、窄譜抗生素 (4)不產(chǎn)生副作用和不良反應,四、抗生素效價微生物測定技術 （一）概述 效價測定技術方法： 1、物理、化學法：簡便、

4、快速，本身純度不高，采用該法會引起偏差，因此只有在純度較高情況下可采用 2、微生物法：原理和臨床應用的要求相一致，直接反映出抗生素的療效，且靈敏度較高，需用量較小，因此被廣泛使用。,微生物法： 依據(jù)抗生素最小抑菌濃度而設計的稀釋法；根據(jù)不同濃度的抗生素對微生物生長速度的不同影響程度而設計的比濁法；有依據(jù)抗生素滲透到含敏感菌的瓊脂培養(yǎng)基中產(chǎn)生抑菌圈而設計的管碟法(又稱擴散法，杯碟法或垂直擴散法)；根據(jù)對微生物呼吸抑

5、制程度而設計的呼吸度量法；根據(jù)對微生物代謝產(chǎn)物的影響而設計的快速法，對微生物體內(nèi)酶系統(tǒng)產(chǎn)生影響的脫氫法。 濁度法：系利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對試驗菌生長的抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標準品與供試品對試驗菌生長抑制的程度，以測定供試品效價的種方法。 管碟法：是利用抗生素在含敏感試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基中的球面擴散滲透作用，從而形成一定的抑菌圈。通過瓊脂培養(yǎng)基，可觀察并測量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素濃度范圍內(nèi)，對

6、數(shù)劑量(濃度)與抑菌圈的表面積或直徑成正比。,（二）抑菌圈的形成 1、抑菌圈： 將不銹鋼小管(俗稱為牛津杯)放置在含敏感試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基上，將抗生素溶液注入小鋼管中，抗生素分子隨溶劑向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀放射狀擴散。同時將培養(yǎng)基置入適宜試驗菌生長的培養(yǎng)箱中，瓊脂培養(yǎng)基中的試驗菌開始生長?？股胤肿釉诃傊囵B(yǎng)基中的濃度，隨離開小鋼管的距離增大而降低，離小鋼管愈遠，瓊脂培養(yǎng)基中抗生素分子愈少，相應的抗生素濃度愈低。當

7、抗生素分子擴散到一定時間，在小鋼管周圍形成一個能有效的抑制試驗菌生長的范圍，也就是通常所說的抑菌圈。,2、影響抑菌圈大小的因素： 抑菌圈的半徑(大小)與最小抑菌濃度C，瓊脂層厚度H，抗生素在瓊脂內(nèi)擴散系數(shù)D，抗生素在小鋼管中的量M，以及抗生素的擴散時間T有關：這些因素的改變，常會影響抑菌圈的大小和清晰度。,按設計原理不同分:,,管碟法,,一劑量法（標準曲線法）,二劑量法（2·2法）,三劑量法（3·3

8、法）,日常使用多采用二劑量法，對于有爭議結果，必須使用三劑量法測定的結果仲裁。,3、管碟法常用的三種方法：,第二節(jié) 抗生素的效價和單位,一、抗生素的效價和單位 抗生素的含量用效價和單位表示。該詞有時不加區(qū)別統(tǒng)稱為效價單位。 效價（ｐotency）：指檢品的實際單位數(shù)與其標示量的比值。常表示為效價的百分數(shù)。效價是從比較檢品與標準品的生物活性而得。 單位（unit,u）：是衡量抗

9、生素有效成分的具體尺度。,二、抗生素的效價單位的表示方法,,１、質(zhì)量單位 以抗生素的生物活性部分質(zhì)量作單位，１微克（ｕｇ）＝１單位，１毫克＝１０００單位。,２、類似質(zhì)量單位 以特定的純粹抗生素鹽類的質(zhì)量作為１單位。如純粹金霉素鹽酸鹽及四環(huán)素鹽酸鹽（包括無生物活性的鹽酸根在內(nèi)）１微克（ｕｇ）＝１單位，１毫克＝１０００個單位。,３、質(zhì)量折算單位 以特定的純抗生素鹽的質(zhì)量為單位而加以折算。,４、特定單位 以特定的抗生素樣品的某一質(zhì)量

10、定為一單位。,復習舊課:,1、抗生素是指主要由_____生成的————————________________________一類________化合物稱之。2、作為醫(yī)療用抗生素應具有————、————、————、————特點。3、抗生素效價的微生物檢定法常用————、————方法進行。4、表示抗生素的效價和單位有————、————、————、————等方法。5、中國藥典規(guī)定的應用方法中2．2法中第1個與第2個2是分別表示＿＿＿

11、＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，而兩個2則是分別表示＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿意思。,教學目標： 熟知抗生素效價檢定操作流程與基本要求教學重點： 抗生素效價檢定操作方法與基本要求教學難點： 抗生素效價檢定操作方法,第三節(jié) 管碟法測定操作,第三節(jié) 管碟法測定操作,1. 試驗用菌液、緩沖液、培養(yǎng)基的制備 按藥 典規(guī)定進行制備。,,2. 標準品與供試品

12、溶液的制備 按藥典規(guī)定制備標準品與供試品高低不同濃度溶液。,3. 雙碟的制備 制備底層(每個培養(yǎng)皿20ML)及含一定量試驗菌的菌層(每個培養(yǎng)皿5ML)，并安置小鋼管。,4. 滴加藥液到小鋼管內(nèi) 將標準品、供試品溶液滴入相應的小鋼管中。,5. 培養(yǎng) 在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至規(guī)定時間。（注意更換成瓦蓋）,6. 測量抑菌圈 可用手工測量或儀器測量。,7. 計算結果 先進行可靠性測驗,符合規(guī)定,再進行效價計算,抗生素效價檢定管碟法操作流程

13、:,二、影響因素的控制 1．直線斜率的控制　　　 2．直線截距的控制　　　 3．抑菌圈大小的控制　　 4．培養(yǎng)基的厚度 5. 劑量反應直線范圍控制 　　　 6. 抑菌圈圓整及清晰度的控制,三、抗生素操作要求,（1）防止抗生素污染（2）操作次數(shù)序安排上的誤差 （3）測量抑菌圈應避免誤差,教學總結：抗生素效價檢定管碟法操作流程,抗生素效價檢定管碟法操作流程:,布置作業(yè)： P92

14、 綜合測驗題 一、填空題 7、8 二、填圖題,第四節(jié) 二劑量法,二劑量法的原理與測定方法： 　　該法系將抗生素的標準及檢品各稀釋成一定比例(2:1或4:1)的二種劑量，即高劑量和低劑量。在同一培養(yǎng)基平皿上進行對比，根據(jù)它們所產(chǎn)生的抑菌圈大小計算檢品的效價。,一、效價計算公式 二劑量法效價計算公式經(jīng)推導可得出供試品的效價計算公式。 V=T1 +T2 －S1 －S2

15、 　 （4－3） W=T2 －T1 + S2 －S1 （4－4） LgR=(W/V).I （4－5） R=lg－1[(W/V).I] 　 （4－6） pT =AT.R

16、 （4－7） Lgθ=(V/W).I （4－8） θ=lg-1.(V/W).I （4－9）,二、操作方法基本要點： ① 高劑量抗生素溶液所形成的抑菌圈直徑在20～24 mm，個別抗生素的抑菌圈可在18～24 mm； ② 高、

17、低劑量所形成的抑菌圈之差最好大于2 mm，有些抗生素的差數(shù)可較小； ③ 高、低劑量之比一般用2:1，當高、低劑量所致的抑菌圈差別較小時，可用高低劑量之比為4:1的比率。,操作步驟： 1. 稱量 2. 稀釋 3. 雙碟的制備 4. 放置鋼管 5. 滴加抗生素溶液　 6. 抑菌圈測量,圖4－6：鋼管放置器（北京先驅(qū)威鋒技術開發(fā)公司生產(chǎn)開發(fā)）,教學總結：

18、抗生素概念、醫(yī)療用抗生素特點、抗生素的主要作用機制。 布置作業(yè)： P91-92 綜合測驗題,標準品的稱量,標準品,返回,試驗用菌液、緩沖液、培養(yǎng)基、 標準品與供試品溶液的制備,制備過程,返回,抽提,加入乙醚進行抽提,共抽提三次(取其下層),返回,雙碟的制備,制備底層,制備菌層,放置小鋼管,返回,滴加藥液到小鋼管內(nèi),返回,在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至規(guī)定時間 （蓋上陶瓷蓋）,返回,