第四章-微生物藥物制造工藝

1、生物制藥工藝學(xué)教學(xué)課件,生物工程教研室劉靜霆,第四章 微生物藥物制造工藝,生物工程教研室劉靜霆,§1 微生物藥物概述§2 抗生素制造工藝§3 其他微生物藥物,§1 微生物藥物概述,一、微生物藥物的定義和發(fā)展二、微生物藥物的分類三、微生物藥物研發(fā)進展,§1 微生物藥物概述,一. 微生物藥物的定義和發(fā)展 1.定義（Microbial Medicines）：微生物在其生命

2、活動過程中產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)及其衍生物，包括抗生素，酶抑制劑，免疫調(diào)節(jié)劑等一類化學(xué)物質(zhì)的總稱，是人類控制感染等疾病，保障身體健康，以及用來防治動、植物病害的重要化療藥物。,2、發(fā)展,（1）傳統(tǒng)抗生素(antibiotic）:,1942年，Waksman首先定義： 抗生素是微生物在其代謝過程中所產(chǎn)生的、具有抑制它種微生物生長及活動甚至殺滅它種微生物性能的化學(xué)物質(zhì)。,1947年,1948年,1950年,1952年,1953年,,1950

3、至80，我國譯為抗菌素,1980年后，抗腫瘤、抗寄生蟲等抗生素的不斷發(fā)現(xiàn)，超出對微生物作用范圍，又改譯為抗生素。,（2）半合成抗生素（3）微生物來源的其他活性物質(zhì) 酶抑制劑: 亮肽素 bestatin 免疫抑制劑：環(huán)孢菌素A β羥基-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑,§1 微生物藥物概述,3、抗生素的發(fā)展方向：①加強基礎(chǔ)理論研究和新技術(shù)的應(yīng)用②選育抗性菌種和新型菌株③大力發(fā)展農(nóng)業(yè)抗生素,

4、抗生素類藥物維生素類藥物氨基酸類藥物核酸類藥物酶與輔酶類藥物酶抑制劑免疫調(diào)節(jié)劑甾體類激素,,二.微生物藥物的分類,（一）抗生素類藥物1、抗生素的命名依動植物學(xué)、菌屬學(xué)名稱而定－－青霉素、鏈霉素、灰黃霉素、黃連素、蒜素、魚素等；依族命名－－四環(huán)素、氯霉素等；依地名及俗名而定－－創(chuàng)新霉素、廬山霉素、平陽霉素、井岡霉素、土霉素等。,2. 抗生素類藥物的分類,生物來源 化學(xué)結(jié)構(gòu) 作用對象 作用機制,,,,,1）

5、根據(jù)生物來源分類：,（1）放線菌產(chǎn)生：鏈霉素（2）真菌產(chǎn)生：青霉素（3）細(xì)菌產(chǎn)生：短桿菌（4）動植物產(chǎn)生：蒜素、黃連素,2）根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類：（1）β-內(nèi)酰胺類抗生素 青霉素、頭孢菌素、硫霉素、亞胺培南,（2）氨基糖苷類抗生素 鏈霉素、新霉素、卡那霉素、慶大霉素,（3）大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 紅霉素、螺旋霉素、

6、麥迪霉素,（4）四環(huán)類抗生素 四環(huán)素、金霉素、土霉素,（5）多肽類抗生素 多粘菌素、放線菌素、桿菌肽,（6）多烯類抗生素 兩性霉素、曲古霉素、制霉菌,（7）蒽環(huán)類抗生素 柔紅霉素、阿霉素、正定霉素,（8）苯烴基胺類抗生素 氯霉素、甲砜氯霉素（9）環(huán)橋類抗生素 利福霉素（10）其他 磷霉素、創(chuàng)新霉素,3）根據(jù)作用對象分類： ①抗G+菌：青霉素、紅霉素 ②抗

7、G-菌：主要有多粘菌素 ③抗真菌：制霉菌素、灰黃霉素、兩性霉素 ④抗結(jié)核分枝桿菌：鏈霉素、新霉素、卡那霉素 ⑤抗癌：放線菌素D、博來霉素、阿霉素 ⑥抗病毒：四環(huán)類抗生素、艾霉素 ⑦抗原蟲：巴龍霉素、抗滴蟲霉素、蒜素,4）根據(jù)作用機制分類 ①抑制細(xì)菌壁合成： 青霉素 ②影響細(xì)胞膜功能： 多烯類抗生素 ③抑制核酸合成： 影響DNA結(jié)構(gòu)的博來霉素、絲裂霉素C及柔毛霉素等； ④抑制Pr合成： 四環(huán)素、氯霉素、鏈霉

8、素 ⑤抑制生物能作用： 抑制電子轉(zhuǎn)移的抗霉素、抑制氧化磷酸化作用的短桿菌肽和寡霉素,根據(jù)作用機制分類,維生素B2維生素Cβ-胡蘿卜素,（二）維生素,β-胡蘿卜素,（三）氨基酸,目前大部分氨基酸可用發(fā)酵法生產(chǎn),（四）核酸類藥物,如肌苷酸，腺苷酸，肌苷，腺苷等,（五） 酶與輔酶類藥物,鏈激酶、L-天冬酰胺酶,（六）酶抑制劑,（七）免疫調(diào)節(jié)劑（八）甾體類激素,克拉維酸、洛伐他汀,三、微生物藥物研發(fā)進展,1.尋找新的微生物資源

9、 稀有放線菌 極端微生物 海洋微生物,2.新的篩選模型及手段 新藥物作用靶標(biāo) 微生物產(chǎn)物庫 高通量篩選 虛擬篩選,3.組合生物合成技術(shù)的應(yīng)用,酮基合成酶(KS)、酰基轉(zhuǎn)移酶（AT）、脫氫酶（DH）、烯酰還原酶（ER）、酮基還原酶（KR）和?；d體蛋白（ACP）等功能域,4、代謝調(diào)控與基因敲除,5.基因改組（DNA Suffling）,§1 微生物藥物概述§2 抗

10、生素制造工藝§3 其他微生物藥物,§2 抗生素制造工藝,一、β-內(nèi)酰胺類抗生素二、氨基糖苷類抗生素三、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素四、四環(huán)素類抗生素,一般制備過程,培養(yǎng)發(fā)酵：發(fā)酵液預(yù)處理固液分離,,,胞內(nèi)產(chǎn)物 細(xì)胞破碎 固液分離 胞外產(chǎn)物 初步純化

11、 精制,,,,,,初步純化方法：沉淀、吸附、萃取、超濾精制方法：層析、電泳、結(jié)晶,選擇方法依據(jù),1、產(chǎn)品性質(zhì)： 化學(xué)組成、分子量、穩(wěn)定性、溶解度、解離特性等2、主要雜質(zhì)屬性3、方法前后銜接要求4、產(chǎn)品質(zhì)量要求,一、β-內(nèi)酰胺類抗生素（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì),a 青霉烷* b 青霉烯 c 頭孢烷 d 頭孢烯*

12、 e單環(huán)β-內(nèi)酰胺 f 碳青霉烷* g 碳青霉烯* h 碳頭孢烷 I 碳頭孢烯 j 氧青霉烷* k 氧青霉烯 l 氧頭孢烷 m 氧頭孢烯 *天然產(chǎn)物,,,Site of penicillinase action.Breakage of the β- lactam ring.,STRUCTURE OF PENICILLIN,,,（二）、青霉素的制備,（A

13、）、理化性質(zhì)：1、溶解性：受pH影響 游離酸：易溶于有機溶劑，難溶于水 鹽：易溶于水，幾乎不溶于有機溶劑2、酸堿性：有機弱酸,3、穩(wěn)定性： 溫度、pH對其穩(wěn)定性的影響,4降解反應(yīng),5、聚合反應(yīng) 氨芐青霉素在水溶液中易形成聚合物，是氨芐青霉素過敏反應(yīng)的主要過敏原之一。,6、過敏反應(yīng) 可能為青霉烯酸、青霉噻唑酸和青霉噻唑蛋白,（B）、制備工藝,1、菌種最早的原始菌種是點青霉菌現(xiàn)用產(chǎn)黃青霉菌(Pe

14、n.chrysogenum)按菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種。國內(nèi)青霉素生產(chǎn)廠大都采用綠色絲狀菌。,2、發(fā)酵工藝流程,絲狀菌發(fā)酵工藝流程,發(fā)酵工藝要點,碳源：乳糖、葡萄糖、天然油脂 葡萄糖母液和工業(yè)用葡萄糖氮源：玉米漿、 花生餅粉、麩質(zhì)、尿素前體：苯乙酸、苯乙酰胺 加入量＜0.1%無機鹽：硫、磷、鉀30%、鈣20%、鎂41%、Fe3+6ug/ml,3、培養(yǎng)條件控制,①菌絲生長

15、繁殖期: ②青霉素分泌期: 菌絲生長趨勢減弱，間隙添加葡萄糖作碳源和間隙加入花生餅粉、尿素作氮源，并間隙加入前體，此期間球狀菌pH要求6.6～6.9，絲狀菌pH要求6.2～6.4， 青霉素分泌旺盛。③菌絲自溶期:,4、控制要點： 1）糖：pH上升后可開始加糖。 2）補料及添加前體：發(fā)酵液中殘余苯乙酰胺濃度為0.05～0.08%。 3）pH：主要通過加葡萄糖控制pH 4）T：種子罐培養(yǎng)絲狀菌要求25℃，發(fā)酵罐培養(yǎng)絲狀菌要求26

16、℃-24℃ 5）通氣與攪拌：深層培養(yǎng)需通入一定量空氣，并不停地攪拌以保證溶氧的濃度 6）泡沫與消沫：泡敵,5、提煉工藝流程,工業(yè)鉀鹽生產(chǎn)工藝流程,,p581,影響因素pH值：萃取到BA時，pH選2.0～2.5，而從BA反萃取到水相時，pH選6.8～7.2 溫度：低溫(10℃以下) ，在設(shè)備上要考慮用冷鹽水進行冷卻，以降低溫度，特別是酸化崗位，溫度要求更低些。時間：酸化時速度應(yīng)快些,而堿化時速度可放慢些,二、氨基糖苷類抗生素,(

17、一)、結(jié)構(gòu)與性質(zhì),胍基pK 11.5,甲氨基pK 7.7,鏈霉素的理化性質(zhì),1、酸堿性：強堿性2、溶解性：易溶于水，難溶于有機溶劑3、穩(wěn)定性：較穩(wěn)定 pH4-7溶液數(shù)周內(nèi)穩(wěn)定 pH4.0-4.5最穩(wěn)定 降解反應(yīng)：酸、堿條件下水解出鏈霉胍等4、醛基反應(yīng)： 與伯胺形成席夫堿,5、成鹽： 與磷鎢酸、苦味酸、甲基橙等成鹽沉淀，用于鑒別 與磺酸、羧酸、磷酸酯成鹽，可溶于有機溶劑中，可用

18、于溶劑萃取法。 與某些鹽形成復(fù)鹽，用于精制，如： 鏈霉素鹽酸鹽與氯化鈣（在甲醇中）形成復(fù)鹽，復(fù)鹽溶于水，可通過陰離子交換樹脂（SO42-）轉(zhuǎn)為硫酸鹽。,(二）鏈霉素的制備 1、菌種--灰色鏈霉菌防止鏈霉菌株變異的措施：冷凍干燥法或砂土管法保存菌種，限制有效使用期；0-4℃暫存，限制使用期限；嚴(yán)控傳代次數(shù)，一般以3次為限；定期純化篩選，淘汰退化菌落；不斷選育出高發(fā)酵單位的新菌種。,2、發(fā)酵工藝,冷凍管,母斜,斜

19、面孢子,,,孢子培養(yǎng),27℃,6~7d,一級種子罐,二級種子罐,發(fā)酵罐,放罐,提取,搖瓶培養(yǎng),種子培養(yǎng),種子培養(yǎng),發(fā)酵,,28.5℃,pH=6.5~7.3,接種量為10%,,,,,最后接種為20%,3、提煉,發(fā)酵液,〔酸化處理〕,1~2倍水稀釋，草酸酸化pH2.8~3.2,加熱 70 ℃ ~75 ℃,,酸化液,〔過濾或離心〕,板框過濾離心分離,,酸化濾洗液,〔中和〕,冷卻至15℃以下，10％NaOH中和pH6.7~7.2,,中和

20、濾液,〔一次離子交換〕,110-Na型樹脂吸附（20萬U/ml）,,飽和樹脂,〔一次洗脫〕,水洗至澄清，5％~6％H2SO4洗脫,,一次洗脫液,〔二次離子交換〕,NaOH中和后401樹脂 吸附（10萬U/ml）,,蒸發(fā)濃縮液,〔脫色、無菌過濾、噴霧干燥〕,先用無鹽水?dāng)D壓，再以8% H2SO4單罐洗脫3~4次,,〔精制〕,NaOH中和,1×14-H型、 330-OH型樹脂精制,,精制液,〔活性碳脫色〕,pH4

21、.3~5.0,0.2%~3%活性碳，透光度90%以上,,精脫液,〔薄膜濃縮〕,＜35℃/-0.00266mPa（24萬～36萬U/ml）,,飽和樹脂,〔二次洗脫〕,,二次洗脫液,硫酸鏈霉素成品,三、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,（一）、概述： 結(jié)構(gòu)特點：以大環(huán)內(nèi)酯為母體,共性： 1、無色弱堿性化合物 2、微溶于水，在水中溶解度隨溫度上升而下降 3、酸性條件苷鍵易水解，堿性內(nèi)酯環(huán)易破壞,分類多氧大環(huán)內(nèi)酯類抗生素－－按碳原子數(shù)可分

22、為12元環(huán)、14元環(huán)和16元環(huán)三類，如紅霉素、竹桃霉素、吉他霉素、螺旋霉素等；多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素－－具有26-28元大環(huán)內(nèi)酯，含4-7個共軛雙鍵，如制霉菌素蒽莎大環(huán)內(nèi)酯抗生素－－又叫環(huán)橋類抗生素，如利福霉素,（二）紅霉素的主要性質(zhì),1、酸堿性：二甲氨基呈堿性2、溶解性：易溶于醇、丙酮、氯仿、酯，微溶于乙醚和水，在水中溶解度55℃時最小3、穩(wěn)定性：pH6-8最穩(wěn)定,（三）制備工藝,1、菌種 紅色鏈霉菌 多組分

23、 主要有效組分---紅霉素A 其他成分-----紅霉素B、C、E,冷凍管,母斜,孢子培養(yǎng)液,,,孢子培養(yǎng),37℃,7~10d,避光,一級種子罐,繁殖罐,發(fā)酵罐,放罐,提取,微孔接種,種子培養(yǎng),種子培養(yǎng),發(fā)酵,,31℃,pH=6.6~7.2， 6~7d,33℃，40h,,,,2、發(fā)酵工藝,35℃,65h,,37℃,7~9d,避光,3、提取,發(fā)酵液,〔預(yù)處理，過濾〕,0.1%甲醛，3%ZnSO

24、4NaOH 調(diào)pH7.8~8.2,,濾洗液,〔樹脂吸附〕,CAD-40樹脂吸附，濃度3.5萬U/ml 流速1/25(V/V.min),,飽和樹脂,〔樹脂洗滌〕,40℃洗滌，氨水pH10,,洗滌后的飽和樹脂,〔樹脂解吸〕,丁酯用2%氨水混合，丁酯用量1:0.5~1,流速1/130(V/V.min),,丁酯洗脫液,〔提取分離〕,pH4.7~5.2醋酸緩沖液,,酸性緩沖液,〔結(jié)晶、分離〕,堿化pH9.8~10加熱

25、38~40℃,,濕晶體,〔干燥〕,制顆粒，干燥 (78~80 ℃ /740mmHg),,紅霉素堿成品,四、四環(huán)類抗生素,（一）、概述結(jié)構(gòu)上都含有四并苯母核,（二）四環(huán)素性質(zhì),1、溶解性： 在pH4.5-7.5之間難溶于水 游離堿能溶于吡啶、甲醇、丁醇等有機溶劑和稀酸、稀堿 鹽酸鹽能溶于水，不溶或微溶于有機溶劑2、穩(wěn)定性： 干燥低溫穩(wěn)定 水溶液堿性條件下不穩(wěn)定，酸性條件下（pH4-5）較穩(wěn)定,3、化學(xué)

26、反應(yīng)： 差向異構(gòu)化：弱酸性pH2~6 脫水反應(yīng)：較強酸性pH<2時脫水 降解反應(yīng)：弱堿性pH8，C環(huán)打開 螯合反應(yīng)：與高價金屬離子 成鹽：四環(huán)素與尿素形成復(fù)鹽，用于精制,（三）四環(huán)素的制備工藝1、菌種金色鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）2、發(fā)酵工藝,砂土管,麩皮瓊脂斜面,孢子菌懸液,,,孢子培養(yǎng),36℃,4~5d,接種,種子罐,發(fā)酵罐,放罐,發(fā)酵,29~3

27、1℃,pH5.8~6.8，7~9d,提取,,30-32℃,24~27h,接種,,種子培養(yǎng),,,3、提取,發(fā)酵液,〔酸化過濾〕,草酸調(diào)pH1.7~1.8, ZnSO40.25%黃血鹽0.2%,硼砂0.2%壓濾，濾渣用0.3%草酸水頂洗,,濾洗液,〔粗品結(jié)晶〕,用氨水調(diào)pH4.8板框過濾用水頂洗,,粗制游離堿,〔溶解〕,加1:15丁醇，加HCl調(diào)pH2~2.5,板框過濾,,丁醇萃取液,〔連續(xù)結(jié)晶〕,用氨水(含2%Na2SO3和

28、尿素)調(diào)pH4.8,5℃下攪拌2h,,結(jié)晶液,〔分離洗滌〕,甩濾分離，水淋洗后再甩干,,濕四環(huán)素堿,〔氣流干燥〕,進風(fēng)120~130℃出風(fēng)70~80℃,,粗制游離堿,〔尿素復(fù)鹽結(jié)晶〕,加水，加尿素，加HCl溶解 氨水調(diào)pH4.6,過濾,,尿素復(fù)鹽結(jié)晶,〔溶解〕,加1:10(W/V)丁醇，加1:0.27(W/V)HCl溶解過濾,,丁醇萃取液,〔結(jié)晶〕,加熱至36℃，保溫1h,攪拌5h,,結(jié)晶液,〔分離洗滌〕,過濾分