常規(guī)組織病理技術(shù)

1、常規(guī)組織病理技術(shù),沈 明,,常規(guī)石蠟切片制作程序組織固定 取材 固定 脫水 透明 浸臘 包埋 切片 染色 封片 觀察,,,,,,,,,,,一 固 定1.組織固定的意義①防止組織細(xì)胞自溶和腐?、诒３纸M織細(xì)胞正常生活時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)③沉淀和凝固各種物質(zhì),硬化組織便于制片和染色后的觀察,2.固定的注意事項(xiàng)①一般應(yīng)在離

2、體30分鐘內(nèi)固定,越及時(shí)越好,并將組織上的血液,分泌物沖洗干凈②固定劑的量一般不少于組織塊總體積的4倍以上③固定的時(shí)間應(yīng)視組織的不同和大小決定,一般小組織4-6小時(shí),大組織18-24小時(shí)或更長(zhǎng)④有特殊要求的須用特殊的固定劑⑤不同組織在固定時(shí)應(yīng)注意特殊的處理方法,3.常用的固定劑①甲醛(10%福爾馬林) 甲醛 100ml 水 900ml②中性

3、甲醛 甲醛 100 ml Na2HPO4 6.5g NaH2PO4 H2O 4g 蒸餾水至 900 ml ③乙醇-甲醛(AF液) 甲醛 100 ml

4、 95%乙醇 850 ml 冰醋酸 50 ml,④其他 4%多聚甲醛 :多聚甲醛4g, 加蒸餾水50ml,加熱至60度,攪拌加入1mol/L NaoH數(shù)滴,直至溶液變清,冷卻后用0.1mol/L PBS( PH7.4 )加至100ml. Carnoy氏液(糖原,DNA,RNA,尼氏小體固定用,小組織20-40分鐘,不超過3-4小時(shí))

5、 冰醋酸 10 ml 氯仿 30 ml 無水乙醇 60 ml,二 取 材 1.外科的活體組織取材 ①臨床手術(shù)取材(大標(biāo)本) 注意腫瘤的部位 形狀 大小 顏色及周邊組織的關(guān)系 ,有無完整包膜,測(cè)量體積,包括長(zhǎng)度 寬度 高度.手術(shù)大標(biāo)本必須進(jìn)行預(yù)取材 預(yù)固定. ②活體小組織(小標(biāo)本) 組織標(biāo)本體積小,在取材

6、時(shí)應(yīng)特別小心,用伊紅讓標(biāo)本著色,并用插鏡紙包裹,以防丟失,應(yīng)標(biāo)明粒數(shù).多瓶組織應(yīng)將附號(hào)標(biāo)清楚.,2. 動(dòng)物標(biāo)本取材: ①動(dòng)物致死法 麻醉法,空氣栓塞法,斷頭法,擊頭法,股動(dòng)脈放血法等,要求動(dòng)作迅速,及時(shí)解剖,取材與固定 ②動(dòng)物取材注意事項(xiàng):準(zhǔn)備好鋒利的刀剪,固定液,取材應(yīng)新鮮,最好是心臟還在跳動(dòng)時(shí)取材,并立即投入固定液.組織塊厚度不超過3mm(應(yīng)將組織上的血液,滲物,粘液糞便等用生理鹽水沖洗干凈,選好組織塊的切面,切除

7、不需要的部分,再固定),應(yīng)盡可能維持組織原形,對(duì)神經(jīng)肌肉皮膚組織,可將其兩端固定在木板或硬紙板上,然后再固定.,三 脫 水 脫水的目的:組織最終將包埋在石蠟中,才能進(jìn)行切片,為達(dá)到這一目的,首先須將組織內(nèi)的水分置換出來,以利于透明劑滲入,這一過程為脫水.(一般情況下,應(yīng)將大小標(biāo)本分別脫水.標(biāo)本脫水從低濃度開始,一般人標(biāo)本從70%或75%乙醇,動(dòng)物標(biāo)本從50%乙醇開始) 脫水方法及注意事項(xiàng): 常用試劑為乙醇,

8、某些情況下用丙酮. 快速石蠟切片常用丙酮為脫水劑,尸體解剖標(biāo)本一般在無水乙醇后加丙酮 因?yàn)槊撍畡┑男屡f影響脫水時(shí)間,必須靈活掌握,根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室情況,定時(shí)更換脫水劑.,四 透 明 透明的目的:因?yàn)榇蠖鄶?shù)脫水劑不能和石蠟相混合,組織內(nèi)的水份脫干凈后,必須通過透明劑的作用,才能便于浸蠟包埋. 常用透明劑種類及注意事項(xiàng): 二甲苯 甲苯 松節(jié)油 苯 透明要注意的關(guān)鍵是時(shí)間,透明時(shí)間

9、不夠,石蠟不能完全進(jìn)入組織,影響到包埋 切片 .但是如果透明過度,組織發(fā)硬發(fā)脆影響切片質(zhì)量.特別是肝脾等組織.,五 浸 蠟 目的和注意事項(xiàng) 組織經(jīng)過透明后要浸入石蠟(火棉膠 碳蠟 明膠)內(nèi),目的是去除組織中的透明劑(二甲苯)而代之以石蠟,并滲入組織內(nèi)部,把軟組織變?yōu)橛羞m當(dāng)?shù)挠捕?以利切片. 一般浸蠟須經(jīng)過2到3次,石蠟的溶點(diǎn)為56-58度左右,目前常用的脫水機(jī)上是兩個(gè)蠟缸.浸蠟時(shí)要注意掌握好石蠟的溫度和浸蠟的

10、時(shí)間,六 包 埋 注意事項(xiàng): 控制好包埋用石蠟的溫度和組織塊的溫度,注意組織塊包埋的方向,切面朝下,組織應(yīng)盡量平整.蠟塊冷卻后將組織外圍的石蠟進(jìn)行修整,以便利于連續(xù)切片. 七 切 片 1.準(zhǔn)備工作: 清洗干凈的玻片 恒溫烤片箱 毛筆 眼科彎鑷 染片架 鋒利的切片刀 制備好的蛋白甘油 石蠟塊預(yù)先冷卻,2.注意事項(xiàng):

11、 ① 熟練掌握切片機(jī)的性能 ②展片箱的水溫控制在45度左右 ③固定好蠟塊和切片刀 ④切片附貼好后,放入65-70度烤箱中烤片 20-30分鐘,八 染 色 目的:將組織切片浸入染色劑內(nèi),使組織或細(xì)胞等成分染上不同的顏色 產(chǎn)生不同的折射 ,以便在光學(xué)顯微鏡下觀察. 方法:蘇木素- 伊紅染色稱常規(guī)染色,又稱HE染色.

12、 其他染色方法稱特殊染色(特染). 步驟: 1.將切好的組織切片經(jīng)烤片后入二甲苯ⅠⅡ脫蠟各約5分鐘左右,然后入無水乙醇洗去二甲苯,約1-2分鐘,依次入95%乙醇,80%乙醇 70%乙醇至自來水,蒸餾水.,,2. 將切片浸入配置好的蘇木素液內(nèi)5-10分鐘左右,自來水洗1分鐘,75%鹽酸乙醇分化約30秒,返藍(lán)1-2分鐘 自來水洗5-10分鐘 3.95%乙醇1分鐘后入酸化的伊紅10秒至1分鐘

13、,入95%乙醇ⅠⅡ各1分鐘 無水乙醇ⅠⅡ各1分鐘 ,電吹風(fēng)吹干.,染色結(jié)果:胞核呈藍(lán)色,胞漿淡紅色,結(jié)締組織鮮紅色,紅細(xì)胞橙紅色. 染色液配置:蘇木素是世界上唯一較好的常規(guī)細(xì)胞核染色劑,配置方法很多,各有特點(diǎn),常用的有:Harris蘇木素 Ehrlich蘇木素 Mayer蘇木素等. 在日常工作中,我教研室用Gill改良蘇木素:蘇木素2g溶于無水乙醇250 ml中,再將硫酸鋁17.6g溶于蒸餾水750 ml中,兩液

14、溶解后將其混勻,加入碘酸鈉0.2g,最后加入冰醋酸20 ml 特點(diǎn):配置簡(jiǎn)單,色澤鮮艷,染液耐用..,,伊紅Y染料是胞漿較理想的染色劑. 介紹一種沉淀酸化伊紅Y乙醇液:伊紅Y20g與蒸餾水500 ml充分溶解后加濃鹽酸10 ml攪拌放置過夜析出沉淀,過濾后棄去濾液,蒸餾水洗滌沉淀,反復(fù)三次,將沉淀物連同濾紙一起放到恒溫箱中干燥,用95%乙醇1000 ml配成飽和液備用. 用時(shí)取飽和液一份加95%乙

15、醇1-2份即成工作液,染色注意事項(xiàng):1.切片脫蠟必須干凈徹底2.按操作步驟進(jìn)行操作應(yīng)嚴(yán)格掌握鹽酸分化的時(shí)間 分化后的切片應(yīng)立即入自來水洗3.注意染色液的情況,掌握染色時(shí)間4.按配方配置染色液.染色液配置的好壞是染色是否 成功的關(guān)鍵之一 九 封 片國(guó)產(chǎn)中性樹膠 封片,注意樹膠量適中,掌握封片手法, 防止氣泡.,,,,,,,,,,,,