無菌藥品生產(chǎn)驗(yàn)證

1、無菌藥品生產(chǎn)驗(yàn)證中的有關(guān)問題討論,杭州澳亞生物技術(shù)有限公司 徐全華電話：86913427、13082806619 郵箱： xqh_923@163.com,一、干熱滅菌的基礎(chǔ)理論,1、干熱滅菌熱穿透性指標(biāo)FH值的概念及計(jì)算公式,1.1 FH值概念： FH是干熱滅菌的殺菌熱力強(qiáng)度，系參照基準(zhǔn)溫度T0=170 ℃ 下的干燥滅菌時(shí)間得出，以分鐘(min)來表示 。1.2 計(jì)算公式：： FH=∑△t&#

2、183;10（T1-T0）/Z 式中：T1----每個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)測溫度； T0----滅菌保證溫度（基準(zhǔn)溫度），取170℃。 Z-----溫度變化升高的滅菌率。如果以去熱原為目的，Z值取 54；如果以滅菌為目的，Z值取20； △t

3、---滅菌時(shí)間，以分鐘來計(jì)算。如果每半分鐘取一個(gè)數(shù)據(jù)，則 △t為0.5；如果5秒鐘取一個(gè)數(shù)據(jù)，則△t為1/12，∑代表每 個(gè)時(shí)間段FH值的累加值。,2.《中國藥典》2005年版二部附錄ⅩⅦ滅菌法中“干熱滅菌法”的要求以及FH值的計(jì)算,本法系指將物品置于干熱滅菌柜、隧道滅菌器等設(shè)備中，利用干熱空氣達(dá)到殺滅微生物或消除

4、熱原物質(zhì)的方法。,3、干熱滅菌FH值的標(biāo)準(zhǔn),（1）對于不直接接觸藥品的不銹鋼器具（如凍干托盤、框架或膠塞桶等）,應(yīng)從滅菌的角度考慮，最低要求為：FH≥37.9 ,最高要求FH≥ 189.7，從滅菌的風(fēng)險(xiǎn)性考慮應(yīng)選擇FH≥ 189.7。我們對這些物品的滅菌采用250℃×30min的滅菌程序，計(jì)算所得的FH= 3.0×105。 （2）對于直接接觸藥品的內(nèi)包材（如玻璃瓶），應(yīng)從殺內(nèi)毒素的角度考慮，F(xiàn)H≥136

5、3。,在一定溫度下達(dá)到FH值1363所需要的時(shí)間,4.《中國藥典》附錄ⅩⅦ 滅菌法中“干熱滅菌法”對細(xì)菌內(nèi)毒素挑戰(zhàn)試驗(yàn)的要求,干熱滅菌法 細(xì)菌內(nèi)毒素滅活驗(yàn)證試驗(yàn)是證明除熱原過程有效性的試驗(yàn)。一般將不小于1000單位的細(xì)菌內(nèi)毒素加入待去熱原的物品中，證明該去熱原工藝能使內(nèi)毒素至少下降3個(gè)對數(shù)單位。細(xì)菌內(nèi)毒素滅活驗(yàn)證試驗(yàn)所用的細(xì)菌內(nèi)毒素一般為大腸埃希菌內(nèi)毒素(Escherichia coli endoxin）。,5.美國藥

6、典附錄滅菌法及無菌保證 “干熱滅菌法”對細(xì)菌內(nèi)毒素挑戰(zhàn)試驗(yàn)的要求,6.英國藥典附錄 ⅩⅧ滅菌法 “干熱滅菌法”對細(xì)菌內(nèi)毒素挑戰(zhàn)試驗(yàn)的要求,6、Excel在FH值計(jì)算中的應(yīng)用,（1）每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的FH值計(jì)算公式： FH=POWER(10,((C3)-170)/54)×SECOND(＄B3- ＄B2)/60 power…代表以10為底的冪 ； C3 …代表第2次記錄時(shí)的溫度； 170 …代表滅菌保證溫度

7、； 54 …… 代表去熱原的工值； SECOND …代表秒； ＄B3 …代表第二次記錄的時(shí)間； ＄B2 … 代表第一次記錄的時(shí)間；60 …秒轉(zhuǎn)換成分鐘。 次數(shù)(A)時(shí)間(B) 通道1 (C) 通道2 (C)

8、 溫度 FH值 溫度 FH值 1 2007-03-28 09:36:22 120 0.0 94 0.0 2 2007-03-28 09:36:27

9、139 0.0 94 0.0 3 2007-03-28 09:36:32 139 0.0 111 0.0 4 2007-03-28 09:36:37 161

10、 0.1 133 0.0 5 2007-03-28 09:36:42 181 0.1 155 0.0 6 2007-03-28 09:36:47 199

11、 0.3 175 0.1 7 2007-03-28 09:36:52 214 0.5 195 0.2 · 8 2007-03-28 09:36:57 226 0

12、.9 211 0.5 9 2007-03-28 09:37:02 237 1.5 225 0.9 10 2007-03-28 09:37:07 246 2.1

13、 236 1.4 11 2007-03-28 09:37:12 253 2.9 246 2.1 12 2007-03-28 09:37:17 260 3.9

14、 254 3.0 13 2007-03-28 09:37:22 266 5.0 260 3.9 14 2007-03-28 09:37:27 267 5.2 2

15、67 5.2 （2）總的FH值在Excel的求和功能∑中得到。,二、滅菌隧道烘箱的驗(yàn)證,1、滅菌隧道烘箱的基本情況,1.1功能作用：玻璃管制注射劑瓶的干熱滅菌和除熱原.。 1.2結(jié)構(gòu)：由預(yù)熱段、滅菌段、冷卻段三部分組成。通過遠(yuǎn)紅外加熱管產(chǎn)生的熱風(fēng)空氣由耐高溫過濾器進(jìn)行過濾后對玻璃瓶進(jìn)行滅菌。玻瓶通過轉(zhuǎn)動(dòng)的網(wǎng)帶走過三個(gè)段。 1.3程序設(shè)定考慮的因素： (1)網(wǎng)帶速度：直接影響玻璃在隧道中的

16、運(yùn)行時(shí)間,應(yīng)該以企業(yè)確定的最大生產(chǎn)能力確定網(wǎng)帶運(yùn)行速度。 (2) 溫度：在速度確定的情況下，設(shè)定加熱管溫度（通常為360℃）和滅菌溫度（330℃ ）,2、驗(yàn)證溫度探頭的布點(diǎn)圖,方式一：方式二：方式三：,,,,,,隧道運(yùn)動(dòng)方向,,,,,隧道運(yùn)動(dòng)方向,,,,,,隧道運(yùn)動(dòng)方向,3、空載熱分布試驗(yàn),4.空載熱分布試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)體會,（1）熱分布的鉑探頭應(yīng)予固定，不能與網(wǎng)帶、擱板、或玻瓶接觸，否則會造成短路，數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，試

17、驗(yàn)失敗。 （2）熱穿透試驗(yàn)的FH值約為空載熱分布的2/3（經(jīng)驗(yàn)值），熱穿透試驗(yàn)的FH值可接受標(biāo)準(zhǔn)為：大于1363min（一般設(shè)計(jì)在1800min以上），因此，盡管空載熱分布研究溫度分布均勻性，也必須進(jìn)行FH值的計(jì)算，最好在2700min以上，以保證熱穿透的FH值。 （3）由于滅菌隧道烘箱運(yùn)行不正常，造成溫度探頭在隧道的滯留，F(xiàn)H值的不正常累加，應(yīng)認(rèn)為試驗(yàn)失敗，應(yīng)重新試驗(yàn)。 （4）偶然的少數(shù)數(shù)據(jù)缺失，可以按

18、統(tǒng)計(jì)學(xué)的要求進(jìn)行缺失數(shù)據(jù)的彌補(bǔ)。 (5)由于溫度探頭與記錄儀之間的導(dǎo)線很長，為了保證檢測溫度的準(zhǔn)確性，溫度探頭應(yīng)該采用三線制的接法，而不應(yīng)該采用二線制接法。,5、滿載熱分布和熱穿透試驗(yàn),滿載熱分布和熱穿透試驗(yàn)可同時(shí)進(jìn)行。 4.1操作方法：同空載熱分布。但溫度探頭必須插入玻瓶的內(nèi)部，但又不能接觸瓶壁。 4.2測定次數(shù)：3次 4.3可接受標(biāo)準(zhǔn)： (1)熱分布溫差：≤±15℃。

19、 依據(jù)：由于滿載和熱穿透條件下，熱空氣對流受阻的原因，溫度均勻性較空載時(shí)差，制訂與空載相同的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該說要求更嚴(yán)格。 （2）FH≥1365min。 依據(jù)： a.中國藥典2005年版二部干熱滅菌法的除熱原程序250 ℃×45min計(jì)算所得。 b.國家發(fā)展改革委員會于2007-03-06發(fā)布了JB/T20093-200）抗生素瓶表冷式隧道滅菌干燥機(jī)的制藥機(jī)械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，要求于2007-09-01

20、實(shí)施。在標(biāo)準(zhǔn)中：5、要求：5.5.4滅菌性能：b）熱穿透性FH≥1365min。,6、溫度無紙記錄儀（整體圖）生產(chǎn)廠家：北京金立石自動(dòng)化儀表廠,溫度無紙記錄儀（正面圖）,溫度無紙記錄儀（背面圖）,6、細(xì)菌內(nèi)毒素挑戰(zhàn)試驗(yàn),,6.1內(nèi)毒素指示劑布點(diǎn)方法,按如下方法進(jìn)行布點(diǎn)：,,,,預(yù)熱段,冷卻段,滅菌段,1,2,3,4,5,6.2內(nèi)毒素指示劑使用方法,除去細(xì)菌內(nèi)毒素指示劑標(biāo)簽，折斷易折安瓿瓶頸，用鋁箔封閉瓶口，將內(nèi)毒素指示劑按上述布點(diǎn)方

21、法布置，經(jīng)過一個(gè)干熱程序后測定殘余內(nèi)毒素量。,6.3殘余細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測,①內(nèi)毒素指示劑的標(biāo)定：將未經(jīng)干熱的內(nèi)毒素指示劑加1.0ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，置于漩渦混合器上混合15min，10倍稀釋至接近所選用的鱟試劑靈敏度，再2倍梯度稀釋成4λ、2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素系列溶液，根據(jù)反應(yīng)終點(diǎn)的稀釋倍數(shù)計(jì)算可回收內(nèi)毒素量。 未經(jīng)干熱的內(nèi)毒素稀釋系列(如2500EU/支)

22、②③④⑤,②將經(jīng)干熱的內(nèi)毒素指示劑加1.0ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，置于漩渦混合器上混合15min，再作一次10倍稀釋。,6.4內(nèi)毒素指示劑檢測注意事項(xiàng),①內(nèi)毒素指示劑必須與該批效價(jià)測定的鱟試劑配套使用，而不能單一購買內(nèi)毒素指示劑后與實(shí)驗(yàn)室其他批號的鱟試劑配套使用，因?yàn)閺S家提供的內(nèi)毒素指示劑在效價(jià)測定時(shí)與相應(yīng)批號的鱟試劑進(jìn)行檢定。如湛江安度斯的情況： ②購買的內(nèi)毒素指示劑必須用配套的鱟試劑

23、按《中國藥典》細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。 ③高濃度的內(nèi)毒素指示劑強(qiáng)烈地粘附在安瓿壁上，除用漩渦混合器混合十五分鐘以上外，用移液槍強(qiáng)烈打碎混勻。,6.5標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌內(nèi)毒素指示劑與鱟試劑,生產(chǎn)廠家：湛江安度斯生物有限公司湛江市人民大道中38號,7、滅菌隧道烘箱驗(yàn)證的體會,7.1 現(xiàn)有的滅菌隧道烘箱一般為洗烘灌聯(lián)動(dòng)線，如聯(lián)動(dòng)線運(yùn)行不 正常造成中途停滯，應(yīng)重新驗(yàn)證，因?yàn)橹型就斐蒄H值 的

24、累加。7.2 負(fù)載熱分布和熱穿透試驗(yàn)，溫度探頭插入玻瓶中，由于熱空 氣對流受影響，因些滿載FH值低于空載FH，在空載熱分布 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，可對FH值進(jìn)行預(yù)計(jì)算，如果FH值過低，需調(diào)整滅 菌程序。7.3 由于熱電偶與溫度記錄儀的連接導(dǎo)線比較長，一般為8～10m(設(shè) 備長度5.5m)， 距離較長，為了消除連接導(dǎo)線電阻變化的影響， 熱電偶接法應(yīng)為三線制接接法，不應(yīng)為二線制接法，否則溫度

25、測 定誤差較大。7.4熱電偶在運(yùn)行使用中不應(yīng)與腔室內(nèi)金屬等接觸，避免造成短路。7.5 內(nèi)毒素挑戰(zhàn)試驗(yàn)可以代替生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)。,三.百級凈化熱風(fēng)循環(huán)烘箱的驗(yàn)證,1.百級凈化熱風(fēng)循環(huán)烘箱的基本情況,1.1功能：用于不銹鋼桶（盛裝滅菌膠塞）、凍干盤、框 架等金屬物品的滅菌。 1.2結(jié)構(gòu)：加熱器、風(fēng)機(jī)、耐高溫過濾器、溫度控制器及記錄儀、程序計(jì)時(shí)控制器。 1.3程序設(shè)定：由于以滅菌為最終目的的干熱滅菌，考慮采

26、用中國藥典干熱滅菌法的滅菌程序，溫度設(shè)定值應(yīng)適當(dāng)高于中國藥典規(guī)定的滅菌溫度，或者延長滅菌時(shí)間。,2、空載熱分布試驗(yàn),（1）布點(diǎn)方法： （2) 操作方法：將10支熱電偶通過驗(yàn)證孔插入箱體內(nèi)，按上述布點(diǎn)方法進(jìn)行布點(diǎn)，其中的一支熱電偶應(yīng)位于設(shè)備自身控制系統(tǒng)的溫度傳感器附近，按SOP啟動(dòng)滅菌程序。 （3）可接受標(biāo)準(zhǔn)：熱分布溫差≤±15℃。 （4） 測試次數(shù)：3次。,8,9,10,,,1,2

27、,7,8,9,3,4,,1,2,7,8,9,3、負(fù)載熱分布和熱穿透試驗(yàn),（1）操作方法：應(yīng)考慮平時(shí)生產(chǎn)中的最大裝載，把溫度探頭插入滅菌物品的內(nèi)部（如凍干盤上下蓋相合的中央，不銹鋼桶即用桶蓋蓋上）。 （2）可接受標(biāo)準(zhǔn)：FH（按滅菌計(jì)算）≥190。 （3）測定次數(shù)：3次,4、生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn),4.1布點(diǎn)位置：每層放置4個(gè)，考慮放置在FH值較低的部位。 4.2 方法：采用枯草黑色變種芽孢生物指示劑（ATCC9

28、372），含菌量：5×105～6/片。菌片放入培養(yǎng)皿中，滅菌程序結(jié)束，取出培養(yǎng)皿，無菌條件下將菌片放入配套的液體培養(yǎng)基管中。 4.3 可接受標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照菌片有菌生長（培養(yǎng)液由粉紅色變黃色）；滅菌菌片無菌生長（培養(yǎng)液顏色未變化）。,5.微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)結(jié)果,四、濕熱滅菌柜的驗(yàn)證,1.脈動(dòng)真空壓力蒸汽滅菌柜的基本情況,1.1功能：用于注射劑生產(chǎn)的部分輔助物料的滅菌，包括：除菌過濾器、填充機(jī)械部件（陶瓷泵或玻璃泵

29、）、連接膠管、工作服裝、清潔用品（潔具）。 1.2結(jié)構(gòu)：真空系統(tǒng)、工業(yè)蒸氣系統(tǒng)、純蒸汽系統(tǒng)、壓縮空氣系統(tǒng)。 1.3程序設(shè)定：采用飽和蒸汽-預(yù)真空程序。包括：空氣去除-充蒸汽-滅菌-抽蒸汽-干燥-真空解除六個(gè)階段。 濕熱滅菌包括兩種方法：過度殺滅法（The OverkillMethod）和生物負(fù)載法/殘存概率法(The Bioburden Method)。 根據(jù)濕熱滅菌工藝決策樹，這

30、些物品可以采用過度殺滅工藝，為保證一定的安全系數(shù)，我們選用122 ℃ ×20min工藝。,2、10支熱電偶的布點(diǎn)方法,將滅菌腔室縱向橫切3個(gè)平面--- A面、B面和C面。A面（1、2、3、4）和C面（5、6、7、8）分別靠近十萬級潔凈面和無菌萬級潔凈面，各面的4角為滅菌車筐的頂點(diǎn)。B面為滅菌車的中央，9號探頭位于B切面的中心點(diǎn)。10號探頭位于滅菌器溫度控制和記錄的傳感器旁。,,1,2,3,4,,,9,5,6,7,8,

31、A面,B面,C面,3.空載熱分布,3.1操作方法：將10支溫度探頭通過驗(yàn)證孔伸入滅菌室內(nèi)，按上述布點(diǎn)方式進(jìn)行布點(diǎn)，按SOP啟動(dòng)滅菌程序。 2.2可接受標(biāo)準(zhǔn)：保溫滅菌段熱分布溫差≤±1.0℃。 2.3測試次數(shù)：3次。,4.滿載熱分布,4.1操作方法：同空載熱分布，考慮生產(chǎn)中的最大裝載。 4.2可接受標(biāo)準(zhǔn)：保溫滅菌段熱分布溫差≤±1.5℃ 。 4.3測試次數(shù)：3次。,5. 熱穿透試驗(yàn),5

32、.1操作方法：同滿載熱分布，將溫度探頭放入滅菌物品的中心部位。 5.2可接受標(biāo)準(zhǔn)：F0≥15 。 5.3測試次數(shù)：3次。,F0值的計(jì)算,有些溫度驗(yàn)證儀軟件沒有F0值的計(jì)算功能，數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel中，可用下列公式計(jì)算： F0＝∑△t·10（T1-121）/10,濕熱滅菌溫度記錄儀生產(chǎn)單位：浙江澤大科學(xué)儀器公司,6.生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn),7.1隨熱穿透試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。放置在滅菌物品內(nèi)部

33、。上層一個(gè)點(diǎn)，中間層1個(gè)點(diǎn)，最下層3個(gè)點(diǎn)（其中1個(gè)放在冷凝水排放點(diǎn)附近），每個(gè)點(diǎn)放2支指示劑。 7.2采用嗜熱脂芽孢桿菌（ATCC7953）；含菌量5×105～6個(gè)/支。 7.3可接受標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照菌瓶有菌生長（培養(yǎng)液由紫色變成黃色），滅菌處理菌瓶無菌生長。,生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果,7.濕熱滅菌柜驗(yàn)證中的一些思考,（1）熱分布試驗(yàn)結(jié)果往往并不是理論所說，很難找到確切的冷點(diǎn)，但一般在底部排放冷凝水的地方。

34、 （2）有些企業(yè)由于缺乏驗(yàn)證儀器，用生物指示劑試驗(yàn)代替熱分布和熱穿透的溫度物理測試，不符合法規(guī)及指南的要求。 a.WHO GMP1992d17.58強(qiáng)調(diào)：化學(xué)或生物指示劑可用于滅菌過程的監(jiān)控，但不得代替物理監(jiān)控（溫度、時(shí)間）。 b.FDA認(rèn)為：生物指示劑驗(yàn)證并不能取代物理驗(yàn)證，這是由生物指示劑驗(yàn)證的復(fù)雜性所決定的。 c.歐盟GMP附錄1：無菌藥品的生產(chǎn)第59條：Biological indicat

35、ors should be considered as an additional method for monitoring the Sterilisation。應(yīng)將生物指示劑作為滅菌監(jiān)控的補(bǔ)充手段。 （3）有關(guān)濕熱滅菌可參考國家藥監(jiān)局委托中國醫(yī)藥設(shè)備工程協(xié)會起草的《用于最終滅菌藥品（注射劑）濕熱滅菌工藝及驗(yàn)證指南（征求意見稿）》。,五、膠塞清洗機(jī)的驗(yàn)證,1、膠塞清洗機(jī)的基本情況,（1）設(shè)備功能：用于藥用鹵化丁基橡膠塞

36、的清洗和滅菌。 （2）工作步驟：真空進(jìn)料→純化水噴淋粗洗→純化水漂洗排放→注射用水精洗→硅化→ 排水→ 注射用水沖洗→ 121℃×20min蒸汽滅菌→抽真空→熱風(fēng)干燥真空干燥→常壓化→出料。,2、干燥程序前的最終淋洗水的檢測,2.1最終淋洗水可接受標(biāo)準(zhǔn)： （1）微生物限度≤10CFU/100ml； （2）細(xì)菌內(nèi)毒素﹤0.25EU/ml； 2.2取樣量：滿足檢測要求。 2.3 驗(yàn)證次數(shù)：3次,

37、3、滅菌膠塞的無菌性驗(yàn)證,3.1驗(yàn)證方法：在出料過程中用滅菌不銹鋼鑷子取無菌膠塞直接放入細(xì)菌培養(yǎng)基（硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基）、真菌培養(yǎng)基（改良馬丁培養(yǎng)基）中，分別在30～35℃和25.5±2.5℃條件下培養(yǎng)14天，觀察。 3.2取樣量：可參考中國藥典無菌檢查法醫(yī)療器械取樣量。 3.3驗(yàn)證次數(shù)：3次。,膠塞無菌性試驗(yàn)結(jié)果,4、微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn),檢查方法:取壓力蒸汽滅菌生物指示劑3支(菌種名稱:嗜熱脂肪芽孢桿菌

38、ATCC753;生產(chǎn)日期: 年 月 日;批號: ;型號:F0≥12;含菌量5×105～6cfu/支)和被滅菌的膠塞一起放入膠塞清洗機(jī)內(nèi),滅菌后取出,直接置于56～60℃培養(yǎng)48小時(shí),并另取一支未經(jīng)滅菌生物指示劑作為陽性對照。 可接受標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)顏色確定滅菌效果,培養(yǎng)后全部保持紫色，滅菌合格；若有1支由紫色變?yōu)辄S色判為無菌不合格。對照管應(yīng)由紫色變?yōu)辄S色為

39、該指示劑有效。 測試次數(shù)：3次。,微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果,六、臭氧滅菌柜的驗(yàn)證,1、臭氧滅菌柜的基本情況,1.1功能：用于鋁塑組合蓋的消毒。1.2程序設(shè)定：設(shè)定消毒時(shí)間60min。,2、《衛(wèi)生部消毒技術(shù)規(guī)范》對臭氧消毒的有關(guān)規(guī)定,,3、臭氧濃度測定,3.1儀器：真空采樣器，氣體檢測管。 3.2方法： (1)割斷檢測管兩端封頭； (2)將檢測管插在采樣器進(jìn)氣口上； (3)將采樣器手柄

40、拉至第2檔位，前后拉一次，放入滅菌柜中，共采樣100ml，進(jìn)氣時(shí)間2～3min，待檢測管中指示劑變色終止，即可以從白色柱所到刻度讀出數(shù)據(jù)。,Model 106便攜式臭氧分析儀,對臭氧消毒的一些看法,1、企業(yè)普遍缺乏先進(jìn)的臭氧濃度檢測儀器，無法精確測定臭氧濃度。2、我們曾對臭氧消毒采用枯草芽孢桿菌生物指示劑菌片（5×105～ 5×106 ）進(jìn)行挑戰(zhàn)試驗(yàn)，處理管仍為陽性，表明臭氧對芽孢的殺滅是有限的。但理論報(bào)道對金黃色

41、葡萄球菌有較好的殺菌效果。,七、培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn),1.歐盟對培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)的要求（歐盟藥品GMP附錄Ⅰ無菌藥品的生產(chǎn)第二版，2004年8月）,第42條、無菌生產(chǎn)工藝的驗(yàn)證應(yīng)當(dāng)包括培養(yǎng)基的模擬試驗(yàn)。1、應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的劑型、培養(yǎng)基的選擇性、澄清度,濃度和滅菌的適用性來選擇使用培養(yǎng)基。2、應(yīng)盡可能地模擬常規(guī)的無菌生產(chǎn)工藝,并包括所有對結(jié)果有影響的關(guān)鍵生產(chǎn)工序。3、此外，還應(yīng)考慮正常生產(chǎn)過程已出現(xiàn)過的各種偏差及最差情況。4、培養(yǎng)基模擬試

42、驗(yàn)的初始驗(yàn)證每班需要三個(gè)連續(xù)試驗(yàn)。5、此模擬試驗(yàn)應(yīng)在規(guī)定的時(shí)間間隔以及空氣處理系統(tǒng),設(shè)備,生產(chǎn)方法和班次數(shù)有重要的變更后重復(fù)進(jìn)行。6、培養(yǎng)基模擬實(shí)驗(yàn)通常每班每個(gè)工藝每年進(jìn)行兩次。7、培養(yǎng)基灌裝容器的數(shù)量要足以保證評價(jià)的有效性。對批量比較小的產(chǎn)品而言, 培養(yǎng)基灌裝的數(shù)量應(yīng)至少等于產(chǎn)品的批量。8、培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)的目標(biāo)是不出現(xiàn)長菌，但可信度為95%時(shí)，污染率應(yīng)小于0.1%。企業(yè)應(yīng)建立警戒限度及糾偏限度。,2.歐盟對培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)的要求

43、（歐盟藥品GMP附錄Ⅰ無菌藥品的生產(chǎn)2005年增補(bǔ)內(nèi)容）,評估標(biāo)準(zhǔn)的變化： 第47條：培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)的目標(biāo)是不出現(xiàn)長菌，應(yīng)按以下建議對無菌工藝進(jìn)行評估： Ⅰ.灌封數(shù)低于5000時(shí)，不得檢出污染。 Ⅱ.灌封數(shù)在5000~10000時(shí)： -----當(dāng)有1瓶污染時(shí)，需進(jìn)行調(diào)查，并應(yīng)考慮重復(fù)培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)。 -----當(dāng)有2瓶污染時(shí)，需進(jìn)行調(diào)查，并在調(diào)查后應(yīng)進(jìn)行再驗(yàn)證。 Ⅲ.灌封數(shù)超過100

44、00時(shí)： -----當(dāng)有1瓶污染時(shí)，需進(jìn)行調(diào)查。 -----當(dāng)有2瓶污染時(shí)，需進(jìn)行調(diào)查，并在調(diào)查后應(yīng)進(jìn)行再驗(yàn)證。 對失敗進(jìn)行全面調(diào)查的內(nèi)容，應(yīng)該延伸到對上一批培養(yǎng)基灌裝試驗(yàn)合格后，對所生產(chǎn)產(chǎn)品無菌可能的影響因素。 從評估標(biāo)準(zhǔn)的變化看（1）強(qiáng)調(diào)污染的調(diào)查；（2）污染率從應(yīng)小于0.1%，提高為應(yīng)小于0.06%。,3、培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)的關(guān)注點(diǎn),3.1培養(yǎng)基的選擇 （1）可采用3%胰蛋白胨

45、大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB） （杭州微生物試劑有限公司），該培養(yǎng)基適用于細(xì)菌和真菌的生長。 （2）應(yīng)該進(jìn)行培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)（陽性對照試驗(yàn)）。 參考中國藥典附錄ⅪH無菌檢查法培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)進(jìn)行。 方法：取每管裝量為10ml 的已滅菌胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基20支，10支接種小于100 cfu 的枯草芽孢桿菌，另10支接種小于100 cfu 的白色念珠菌，按模擬分裝試驗(yàn)的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果。 結(jié)

46、果判定 ：至少有50%以上接種的試管培養(yǎng)基出現(xiàn)明顯的微生物生長，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。,3、培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)的關(guān)注點(diǎn),3.2制訂培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)應(yīng)考慮的因素：盡可能模擬平時(shí)實(shí)際的生產(chǎn)工藝。 （1）由于活性炭對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的吸附，以及金屬鈦棒對含蛋白類物質(zhì)難以過濾的原因，工藝中可不必進(jìn)行活性炭吸附和鈦棒脫炭處理。 （2）配制的培養(yǎng)基溫度以45 ℃ ～50℃為宜，過低的溫度導(dǎo)致粘度過大，很難進(jìn)行除菌過

47、濾。 （3）培養(yǎng)基的灌裝體積應(yīng)至少空瓶體積的1/3。 （4）配制液和除菌過濾液均應(yīng)取樣，便于和陽性樣品進(jìn)行微生物比對調(diào)查。 （5）由于模擬分裝試驗(yàn)的數(shù)量有限，灌裝時(shí)間會很短，通過間隙停頓的方法拉長灌裝時(shí)間，與實(shí)際生產(chǎn)時(shí)間相似。但應(yīng)該避免由于停頓造成玻瓶在滅菌隧道烘箱內(nèi)停留。 （6）要模擬最差條件，最好在環(huán)境大消毒之前進(jìn)行。 （7）灌裝后的樣品在進(jìn)行培養(yǎng)的時(shí)候，需要進(jìn)行一次倒置，然后再正立

48、，這樣的目的是為了讓培養(yǎng)基充分接觸瓶子的內(nèi)表面，保證培養(yǎng)基與所有可能接觸到的內(nèi)包裝材料，包括瓶底、瓶壁、瓶口及膠塞部分充分接觸，能夠正確的反應(yīng)微生物的污染情況，避免假陰性的現(xiàn)象。,3、培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)的關(guān)注點(diǎn),3.3培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)的周期： （1）新工廠系統(tǒng)初期驗(yàn)證需要3個(gè)連續(xù)試驗(yàn)。 (2)在沒有變更的情況下，每年2次。 （3）空調(diào)凈化系統(tǒng)、設(shè)備、工藝、生產(chǎn)班次數(shù)、生產(chǎn)線配置的變動(dòng)、人員重要變動(dòng)、環(huán)境監(jiān)控結(jié)果異

49、常、無菌檢查結(jié)果陽性等，如果通過評估認(rèn)為此項(xiàng)變更會影響到無菌生產(chǎn)工藝產(chǎn)品的無菌保證水平，則需要進(jìn)行增補(bǔ)性培養(yǎng)基灌封試驗(yàn)。,3、培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)的關(guān)注點(diǎn),3.4培養(yǎng)基模擬分裝的數(shù)量 （1）樣本量：n＞3000瓶。 （2）按歐盟GMP附錄1：無菌藥品的生產(chǎn)（2005增補(bǔ)內(nèi)容），樣本量： n＞5000瓶。,3、培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)的關(guān)注點(diǎn),3.5培養(yǎng)溫度和時(shí)間、觀察頻率 （1）20 ℃ ～25℃培養(yǎng)7天，再在 30 ℃

50、～35℃培養(yǎng)7天；或者： 30 ℃ ～35℃ 培養(yǎng)7天，再在 20 ℃ ～25℃培養(yǎng)7天。 （2）第3天、第7天和第14天各觀察1次。目的是早期的觀察有利于污染狀況的分析。,3、培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)的關(guān)注點(diǎn),3.6合格標(biāo)準(zhǔn) （1）可信限為95%時(shí)，污染率≤0.1%。 （2）按歐盟GMP附錄1：無菌藥品的生產(chǎn)（2005增補(bǔ)內(nèi)容），可信限為95%時(shí)，污染率≤0.06% 。 （3）《藥品生產(chǎn)驗(yàn)證指南》200

51、3年版P259頁表4-3：可信限為95%時(shí)一次模擬分裝中模擬分裝量、污染數(shù)量與污染概率關(guān)系表。,,二項(xiàng)分布（binomial distribution）的概率函數(shù),（1）什么是二項(xiàng)分布？ 假設(shè)有一隨機(jī)試驗(yàn)，每次試驗(yàn)多有兩種不同的結(jié)果，如培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)中對于每一個(gè)灌裝的瓶子要么有菌，要么無菌，這二種可能的結(jié)果是互不相容的。獨(dú)立地將此試驗(yàn)重復(fù)n次（譬如：培養(yǎng)基模擬分裝量n ），求在n次中出現(xiàn)一種結(jié)果（譬如：出現(xiàn)染菌情

52、況）x次的概率是多少？這種概率分布事件稱為二項(xiàng)分布。(2)二項(xiàng)分布的展開式（q+p）n=qn+nq(n-1)p1+{[n(n-1)/2!]} ×q(n-2)p2+{[n(n-1)(n-2)/3!]} ×q(n-3)p3+················&#

53、183;···················· + {[n(n-1)(n-2) ······(n-x+1)/x!]} ×q(n-x)px+pn 其

54、中：（q+p）=1(3)二項(xiàng)分布的概率函數(shù) 從二項(xiàng)分布展開式，可以推出如下概率函數(shù)： p（x）＝Cxnpxq(n-x)= {[n(n-1)(n-2) ······(n-x+1)/x!]} ×pxq(n-x) , x=1,2,3,------n. 其中：p（x）-----發(fā)生A事件（染菌事件）x次的概率函數(shù)；

55、 Cxn----------在n次試驗(yàn)中出現(xiàn)A事件（染菌事件） x次的組合數(shù)； p-------------事件A發(fā)生的概率（如培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)允許的污染概率為0.1%）； q------------與事件A互不相容的事件發(fā)生的概率 [如培養(yǎng)基模擬分裝試驗(yàn)允許的不污染概率為(1- 0.1%) =99.9% ]； n------

56、-------樣本含量（灌裝數(shù)量）； x--------------在n次試驗(yàn)中，事件A （染菌事件）出現(xiàn)的次數(shù)。,當(dāng)培養(yǎng)基模擬分裝量超過16970支時(shí)，企業(yè)如何計(jì)算允許污染數(shù)量（支數(shù)）？,舉例：當(dāng)模擬分裝數(shù)量為21000支時(shí)，允許污染的瓶數(shù)為多少（采用試算法）？ (1)當(dāng)有14瓶污染時(shí)： p(x)= 21000! ×(10

57、-3) 14×(1－10-3)(21000-14 ) =0.0282 14！×(21000－14)！ (2)當(dāng)有15瓶污染時(shí)： p(x)= 21000! ×(10-3) 15×(1－10-3)(21000-15 ) =0.0395

58、15！×(21000－15)！ (3)當(dāng)有16瓶污染時(shí)： p(x)= 21000! ×(10-3) 16×(1－10-3)(21000-16 ) =0.0518 16！×(21000－16)！ p(x)控制在0.05。,,,,4、微生物污染的調(diào)查,4.1FDA檢查員指

59、導(dǎo)手冊CP7356.002A《無菌藥品工藝檢查》對微生物污染調(diào)查的要求。 268. Are microorganisms from positive vials identified according togenus?第268條：陽性樣品瓶內(nèi)的微生物鑒別出其屬了嗎？ 269. Are such microorganisms correlated to those found duringenvironmenta

60、l monitoring?第269條：這些微生物與環(huán)境監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)的有關(guān)系嗎？ 4.2微生物種屬的鑒別必須借助于全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)。,污染樣品,污染樣品的微生物分離（配制液）,污染樣品的微生物分離（陽性樣品）,法國生物梅里埃公司VITEK® 2微生物鑒定系統(tǒng),,4、微生物污染的調(diào)查,4.3調(diào)查實(shí)例： 通過眼力?。ê贾荩┯邢薰镜腣itek鑒別系統(tǒng)對陽性培養(yǎng)瓶內(nèi)的微生物進(jìn)行了種的鑒別，鑒別結(jié)論為：

61、虎紅平板上生長的菌落和管制瓶內(nèi)溶液分別進(jìn)行了菌落的分離純化，將它們分別接種于TSA（營養(yǎng)瓊脂）、SDA（虎紅瓊脂）和R2A（水系統(tǒng)監(jiān)測專用培養(yǎng)基）上，結(jié)果全部都有相同菌落生長，經(jīng)Vitek鑒別為：Rolstonia pickettii（羅爾斯頓皮氏假單胞菌），該菌為G-桿菌，需氧、不形成芽胞，直或彎曲，長1-5um，寬0.5-1um，氧化酶通常陽性。該菌是水中常見菌（水生菌），非致病菌。,八、潔凈區(qū)甲醛消毒的微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)

62、,,1、《中國藥典》2005年版附錄ⅩⅦ 滅菌法中有關(guān)甲醛滅菌的要求,氣體滅菌法 本法系指用化學(xué)消毒劑形成的氣體殺滅微生物的方法。常用的化學(xué)消毒劑有環(huán)氧乙烷、氣態(tài)過氧化氫、甲醛、臭氧（O3）等。 挑戰(zhàn)用生物指示劑一般采用枯草芽孢桿菌孢子（spores of Bacillus subtilis)。 甲醛氣體常用于環(huán)境的熏蒸消毒。,2.甲醛熏蒸系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖,,膠塞存放間,,灌裝間（4）,灌裝間（3）,灌

63、裝間（2）,灌裝間（1）,走廊,3、噴霧頭,4、甲醛熏蒸系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與工作原理,4.1結(jié)構(gòu)： 該系統(tǒng)安裝在無菌萬級區(qū)域功能間中，由壓縮空氣管道和不銹鋼霧化噴頭及裝有甲醛的噴壺組成，由壓縮空氣總閥控制壓縮空氣的流量，利用壓縮空氣通過噴頭時(shí)使甲醛霧化，進(jìn)行空間環(huán)境的消毒和滅菌，消毒后在排風(fēng)機(jī)箱處排放。 4.2甲醛霧化工作原理 在相對濕度65%以上、溫度30~40℃條件下，甲醛氣體的消毒效果最好。因此采用霧化的方

64、式，使甲醛由液體變成細(xì)小的微粒，均勻地分散在空氣中，和熱空氣充分地混合，進(jìn)入到無菌萬級的各個(gè)角落及縫隙中，在空間密閉4小時(shí)以上以達(dá)到徹底消毒和滅菌的目的。,5、操作方法,3.1利用空調(diào)系統(tǒng)加熱和加濕裝置對潔凈室進(jìn)行加溫和加濕，溫度達(dá)到30℃～40℃之間，濕度達(dá)到65%以上。 3.2計(jì)算每個(gè)滅菌點(diǎn)的房間體積，并按10ml/m3的濃度將36%的甲醛溶液倒入噴壺中，并與霧化噴頭相旋接。 3.3在無菌萬級各功能房間中放入

65、直徑9cm經(jīng)170℃2小時(shí)滅菌的玻璃培養(yǎng)皿，并放入枯草黑色變種芽孢生物指示劑（菌片），每室放置2點(diǎn)，每點(diǎn)2片。 3.3打開壓縮空氣控制閥門，調(diào)整壓縮空氣的流量,將霧化的甲醛在高溫高濕的環(huán)境中形成甲醛氣體,噴霧時(shí)間以噴完為準(zhǔn)，房間密閉時(shí)間4h，然后開啟空調(diào)系統(tǒng)，同時(shí)打開新風(fēng)口和排風(fēng)口，開啟排風(fēng)系統(tǒng)，采用新鮮空氣進(jìn)行置換，排放時(shí)間大于8小時(shí)。,5、操作方法,3.4氣體滅菌結(jié)束后，檢測人員穿好已滅菌的無菌工作服進(jìn)入潔凈區(qū)

66、，將所有的培養(yǎng)皿蓋合上，做好標(biāo)記。 3.5在潔凈室的微生物限度檢查室中，用已滅菌的鑷子夾取培養(yǎng)皿中的菌片放入枯草黑色變種芽孢培養(yǎng)液中密閉培養(yǎng)，37℃48小時(shí)培養(yǎng)觀察。另取一支未經(jīng)甲醛氣體滅菌的菌片作陽性對照。,6、滅菌效果,,7、驗(yàn)證用生物指示劑的來源,生物指示劑名稱：枯草黑色變種芽孢生物指示劑（ATCC9372）上海鴻雍生物科技有限公司 上海斜士路716號3號樓507室電話：021-63034135 傳真：6304

67、7015郵編：200023菌含量的標(biāo)定問題。,九、驗(yàn)證主計(jì)劃問題,1、藥品GMP檢查評定標(biāo)準(zhǔn)對驗(yàn)證主計(jì)劃的規(guī)定的變化,2、什么是驗(yàn)證總計(jì)劃？,A Validation Master Plan (VMP) is a comprehensive document describing the applicable validation requirements for the facility and/or process, and

68、providing a plan for meeting those requirements. 驗(yàn)證主計(jì)劃是一個(gè)對于設(shè)施和/或工藝描述適宜的驗(yàn)證要求的詳細(xì)文件,并且提供一個(gè)計(jì)劃來滿足這些要求。,3.驗(yàn)證主計(jì)劃應(yīng)描述什么內(nèi)容？,WHO在2003年發(fā)布“SUPPLEMENTARY GUIDELINES ON GOOD MANUFACTURING PRACTICES (GMP):VALIDATION”（藥品生產(chǎn)質(zhì)量管

69、理規(guī)范補(bǔ)充指南：驗(yàn)證）指南框架如下：,該指南第8項(xiàng)VALIDATION MASTER PLAN8.2條Specificre quirements對驗(yàn)證主計(jì)劃的內(nèi)容規(guī)定如下：,4、適合于國內(nèi)企業(yè)的新廠房設(shè)施、新建生產(chǎn)車間的驗(yàn)證主計(jì)劃目錄舉例,一、引言二、公司及工廠概況 1.公司基本情況（成立日期，從事哪類產(chǎn)品的研制、開發(fā)和商業(yè)化生產(chǎn)、總占地面積、建筑面積等）； 2.公司產(chǎn)品情況； 3.項(xiàng)目和生產(chǎn)區(qū)域概述；

70、 3.1廠房設(shè)施及公用工程系統(tǒng)說明； 3.2人流和物流說明； 3.3生產(chǎn)和檢驗(yàn)設(shè)備說明； 3.4工藝流程介紹。三、驗(yàn)證主計(jì)劃目的四、驗(yàn)證主計(jì)劃范圍五、公司標(biāo)準(zhǔn)(法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的引用)六、驗(yàn)證組織機(jī)構(gòu)及職責(zé)七、驗(yàn)證項(xiàng)目及方法 1、廠房設(shè)施；2.設(shè)備；3.工藝；4.清潔；5.再驗(yàn)證。列出驗(yàn)證項(xiàng)目清單。,,八、可接受標(biāo)準(zhǔn)九、標(biāo)準(zhǔn)操作程序（待起草和審批的程序）包括：生產(chǎn)、質(zhì)量保證、質(zhì)量檢驗(yàn)、設(shè)備操作