第十七章流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用

1、第十七章 流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用,第一節(jié) 概述 一、工作原理 二、散射光的測(cè)定 三、熒光測(cè)量 四、細(xì)胞分選原理,第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析 一、參數(shù) 二、數(shù)據(jù)顯示方式 三、設(shè)門分析技術(shù),第三節(jié) 流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求一、免疫檢測(cè)樣品制備二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色三、免疫膠乳顆粒的應(yīng)用四、流式細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制,第四節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)檢查中的應(yīng)用 一、淋巴細(xì)胞及其亞

2、群的分析 二、淋巴細(xì)胞功能分析 三、淋巴造血系統(tǒng)分化抗原及白血病免疫分型 四、腫瘤耐藥相關(guān)蛋白分析 五、AIDS病檢測(cè)中的應(yīng)用 六、自身免疫性疾病相關(guān)HLA抗原分析 七、移植免疫中的應(yīng)用,思考題小結(jié),流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。,流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被

3、破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。,細(xì)胞不被破壞，測(cè)量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量,流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn),,流式細(xì)胞儀是測(cè)量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析儀，是在單個(gè)細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對(duì)細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進(jìn)行快速測(cè)量并可分類收集的高技術(shù)。,第一節(jié) 概述,,,,流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性,采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更

4、好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測(cè)的靈敏度和特異性；用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析精確性。,一、工作原理,（1） 液流系統(tǒng) （2） 光學(xué)系統(tǒng) （3） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)：,,由樣本和鞘液組成待測(cè)細(xì)胞 單個(gè)細(xì)胞的懸液 熒光染料標(biāo)記的單抗對(duì)其染色 受清潔氣體壓力

5、從樣品管進(jìn)入流動(dòng)室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。,,,,,（1）液流系統(tǒng),液流系統(tǒng)示意圖,FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個(gè)細(xì)胞流）,樣本管,,鞘液管,,,激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長(zhǎng)/短波長(zhǎng)，通過短/長(zhǎng)波長(zhǎng)光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通光電倍增管：FS,

6、 SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（熒光）,（2）光學(xué)系統(tǒng),光學(xué)系統(tǒng)示意圖,,主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成,（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),基本工作原理,基本過程,,流式細(xì)胞儀與顯微鏡的區(qū)別,細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍360°立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。,二、散射光的測(cè)定,,,,前向散射光（forward scatter, FS

7、）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。,,,前向散射光示意圖,,側(cè)向散射光（side scatter, SS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90°角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。,,側(cè)向散射光示意圖,,測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過計(jì)算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。

8、 此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。,淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞,中性粒細(xì)胞,光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群,,熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。線性放大器和對(duì)數(shù)放

9、大器,三、熒光測(cè)量,熒光染料的特性,激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION),,,,,,,,熒光補(bǔ)償,通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。,四、細(xì)胞分選原理,,,,,,,壓電晶體,產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng),不充電,充電,（一）分選基本原理,,分選速度：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。分選收獲率：實(shí)際收獲的分選細(xì)胞

10、與設(shè)定通過測(cè)量點(diǎn)的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率。與分選速度成反比。,（二）分選的技術(shù)要求,,參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式 （單參數(shù)直方圖 、雙參數(shù)散點(diǎn)圖 、二維等高圖 、假三維等高圖 、三參數(shù)散點(diǎn)圖 ）設(shè)門分析技術(shù),第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析,,FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少,一、

11、 參數(shù),,單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點(diǎn)圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析,直分析方圖,設(shè)門分析:REGION和GATE設(shè)置,二、數(shù)據(jù)顯示方式,,由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。,（一）單參數(shù)直方圖,單參數(shù)直方圖,,雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置

12、。雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。,（二）雙參數(shù)直方圖,1.雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖,雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖,2. 二維等高圖,,由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線) 所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。,二維等高圖,3.

13、 假三維等高圖,（三）三參數(shù)直方圖,,多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。,（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析,,,Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。,根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。,三、設(shè)門分析技術(shù),A 淋巴細(xì)胞

14、B 單核細(xì)胞C 中性粒細(xì)胞,A、B、C均為任意門,線性門,,Region設(shè)置: 區(qū)閾（region, R）與門(gate, G ) 是兩個(gè)相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門對(duì)應(yīng)，但是也可以包含于門。,D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+,如十字門分析時(shí)，起就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。,,樣本制備標(biāo)記染色液相芯片技術(shù) 質(zhì)量控制,第四節(jié)

15、流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求,,外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備分離單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備 蛋白酶消化 機(jī)械吹打 使貼壁細(xì)胞脫落 洗滌 尼龍網(wǎng)過濾,,,,,一、免疫檢測(cè)樣品制備,,,新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備機(jī)械法酶處理法化學(xué)試劑處理法表面活性劑處理法單細(xì)胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）,,適用條件:有較高的量子產(chǎn)額

16、和消光系數(shù)對(duì)488nm的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)間有較大的波長(zhǎng)差易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性,二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色,,激光,細(xì)胞懸液,異硫氰酸熒光素,得州紅,能量傳遞復(fù)合染料,藻膽蛋白類,（一）幾種常見的熒光染料,常用的幾類熒光染料,,用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而檢測(cè)到該特定熒光信

17、號(hào)。,能量傳遞復(fù)合染料,,,488nm,575nm,670nm紅色熒光,花青苷5,藻紅蛋白,能量傳遞復(fù)合染料機(jī)制,,,熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式結(jié)構(gòu)親和式嵌入結(jié)合共價(jià)鍵結(jié)合熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法直標(biāo):干擾少,但需購(gòu)買多種單抗間標(biāo):步驟多,干擾多,不需標(biāo)記多種抗體組合標(biāo)記,（二）免疫熒光標(biāo)記,,免疫膠乳顆粒的應(yīng)用即液相芯片技術(shù)是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光

18、色，把針對(duì)不同檢測(cè)物的乳膠微球混合后再加入待標(biāo)本，在懸液中與微粒進(jìn)行特異性地結(jié)合，經(jīng)激光照射后不同待測(cè)特產(chǎn)生不同顏色，并可進(jìn)行定量分析。因檢測(cè)速度極快，所以又有“液相芯片”之稱 。,三、免疫膠乳顆粒技術(shù)的應(yīng)用,,微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標(biāo)位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼）,通過對(duì)標(biāo)記不同熒光素分子的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)FCM對(duì)可溶性物質(zhì)的定量分析,,適當(dāng)?shù)闹苽浞绞教幚砑t細(xì)胞實(shí)體組

19、織來源標(biāo)本用機(jī)械法溫度25~37℃，pH7.0~7.2,四、流式細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制,（一）單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控,溫度pH染料濃度固定劑,（二）免疫熒光染色的質(zhì)控,,光路與流路校正: 確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準(zhǔn): 保證樣品檢測(cè)時(shí)儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。絕對(duì)計(jì)數(shù)校準(zhǔn): 保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。,Flow-check,Flow-set,Flow-count,（三）儀器操作的

20、質(zhì)控,,同型對(duì)照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照，選用相同源性的未標(biāo)記單抗作為對(duì)照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。全程質(zhì)量控制：與待測(cè)標(biāo)本一起標(biāo)記和檢測(cè)，結(jié)果達(dá)靶值，提示本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。,（四）免疫檢測(cè)的質(zhì)控,流式細(xì)胞術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于免疫學(xué)基礎(chǔ)研究和逐步進(jìn)入臨床應(yīng)用各方面，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面的抗原成分進(jìn)行標(biāo)記分析，可區(qū)別多種細(xì)胞的特性，為細(xì)胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。,第四節(jié) 在免疫學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用,,T淋巴細(xì)胞及其亞群

21、分析Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細(xì)胞及其亞群分析B1(CD19+CD5+):產(chǎn)生IgM型自身抗體, 參與免疫調(diào)節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關(guān)B2(CD19+CD5-):受外來抗原刺激, 產(chǎn)生高親和性特異性抗體NK細(xì)胞分析NK(CD3-CD16+CD56+),一、淋巴細(xì)胞及其亞群的分析,,,細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性試驗(yàn)(死細(xì)胞與活細(xì)胞比例)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定,二、淋巴細(xì)胞功能分析

22、,三、淋巴造血系統(tǒng)及白血病免疫分型,對(duì)淋巴瘤和白血病進(jìn)行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預(yù)后及檢出微小殘留病變,,,CD4+Th細(xì)胞、CD4+/CD8+比例,MDR(+)表示對(duì)化療藥物耐藥,四、腫瘤耐藥基因分析,五、AIDS病檢測(cè)中的應(yīng)用,,HLA-B27可出現(xiàn)在58%～97%的強(qiáng)直性脊椎炎(As) 患者,六、自身免疫病相關(guān)HLA抗原分析,,FCM作為一個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)，已應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，其在移植免疫分析中的應(yīng)用也越來越廣泛。目前移

23、植免疫中的FCM應(yīng)用主要包括流式細(xì)胞術(shù)的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群體反應(yīng)性抗體（Panel reactive antibody, PRA）檢測(cè)。,七、移植免疫中的應(yīng)用,思考題,流式細(xì)胞儀的分析檢測(cè)原理是什么？流式細(xì)胞儀分析中前向散射光、側(cè)向散射光和熒光的檢測(cè)意義。何謂熒光補(bǔ)償？何謂“液相芯片”技術(shù)？細(xì)胞分選的基本原理。FCM分析中有哪些數(shù)據(jù)顯示方式，如何解讀結(jié)果及其設(shè)門

24、分析的意義？如何進(jìn)行FCM分析檢測(cè)樣品的制備？流式細(xì)胞分析前如何驗(yàn)證儀器工作狀態(tài)，采用何種校正物？流式細(xì)胞免疫分析的質(zhì)量控制包括哪些方面？流式細(xì)胞術(shù)有哪些臨床應(yīng)用價(jià)值？流式細(xì)胞儀分析中常見的熒光素有那些？他們的特性如何？,小 結(jié),流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，從分子水平上獲取多種信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。FCM分析中前向散射光反映顆粒的大??；側(cè)向散射光反映顆粒內(nèi)