流式細(xì)胞儀基礎(chǔ)知識(shí)介紹

1、流式細(xì)胞儀的基礎(chǔ)知識(shí),邁瑞公司譚偉峰 15210608682,,目錄,流式細(xì)胞儀的定義和分類,流式樣本的前處理,流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)和原理,流式數(shù)據(jù)的獲取和分析,,目錄,流式細(xì)胞儀的定義和分類,流式樣本的前處理,流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)和原理,流式數(shù)據(jù)的獲取和分析,流式細(xì)胞儀的定義,流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry , FCM）：是一種定量分析技術(shù)，是指利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞特異性標(biāo)記熒光信號(hào)而測(cè)定細(xì)胞的多種生物物理性質(zhì)的方法，同

2、時(shí)也是一項(xiàng)可以把具有某相同熒光信號(hào)特性的某些細(xì)胞亞群從多細(xì)胞群體中分離和富集出來(lái)的細(xì)胞分析技術(shù)。流式細(xì)胞儀(flow cytometer)： 是一種集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)和抗原抗體檢測(cè)技術(shù)為一體的新型高科技儀器。,流式細(xì)胞儀的檢測(cè)特點(diǎn),,單細(xì)胞懸液或生物顆粒,,分析速度高,,多參數(shù),,精度高,,,,,,當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù),,光信號(hào),,流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍,檢測(cè)

3、范圍：凡細(xì)胞內(nèi)能進(jìn)行熒光標(biāo)記的成分或變化都可用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。,,細(xì)胞結(jié)構(gòu),細(xì)胞功能,,流式細(xì)胞儀的分類,分析型 自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單，適用于臨床使用；,分選型 分辨率高，多激光高配置，可將感興趣的細(xì)胞分選出來(lái)，適用于科研使用；,常見(jiàn)分析型流式細(xì)胞儀,常見(jiàn)分選型流式細(xì)胞儀,,目錄,流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)與原理,流式樣本的前處理,流式細(xì)胞儀的定義和分類,流式數(shù)據(jù)的獲取和分析,流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)及原理,液流系統(tǒng)液流驅(qū)動(dòng)原理

4、光學(xué)系統(tǒng)信號(hào)產(chǎn)生與收集原理電子系統(tǒng)信號(hào)檢測(cè)原理,液流系統(tǒng),主要作用：提供穩(wěn)定的鞘流，將樣本懸液聚焦在光束中心處以供檢測(cè)； 主要部件：流動(dòng)室（對(duì)于分選型也叫噴嘴）、管路、閥門(mén)樣本流實(shí)現(xiàn)方式： 負(fù)壓驅(qū)動(dòng)樣本流：BD ： FACSVerse、Acurri C6 ， Mindray ：BriCyte

5、 E6 正壓實(shí)現(xiàn)樣本流：BD ：FACSCantoⅡ、Calibur、Aria， BCI ： FC500、Gallios,液流驅(qū)動(dòng)原理,鞘液,,,,流動(dòng)室,樣本,鞘液樣本流進(jìn)樣針流動(dòng)室,主要作用：提供光源、產(chǎn)生并收集光信號(hào)主要部件：激光器、透鏡、濾光片,,,,,,,光學(xué)系統(tǒng),BriCyte E6儀器的光學(xué)系統(tǒng)圖,,,,激光器 藍(lán)光 488nm

6、 紅光 638nm 紫光 405nm 紫外光 355nm 綠光 532nm （注：根據(jù)其激發(fā)波長(zhǎng)區(qū)分）,信號(hào)產(chǎn)生要素之一,信號(hào)產(chǎn)生要素之二,熒光素 常見(jiàn)熒光素及其激發(fā)激光器,信號(hào)產(chǎn)生要素之三,熒光染色,熒光素角色,熒光標(biāo)記,,,,,,,,,,熒光素,熒光素,抗體,攜帶抗原的細(xì)胞,信號(hào)產(chǎn)生原理,,,,,,濾光片,長(zhǎng)通濾片,,短通濾片,帶通濾片,波長(zhǎng)大于

7、特定功能的光可以通過(guò)，波長(zhǎng)小于該波長(zhǎng)的光被反射,波長(zhǎng)小于特定功能的光可以通過(guò)，波長(zhǎng)大于該波長(zhǎng)的光被反射,波長(zhǎng)在某特定范圍內(nèi)的光可以通過(guò)，波長(zhǎng)在該范圍以外的光被反射,480,535,580,480,535,580,480,535,580,,,,,,,,,,,,,,,信號(hào)收集原理-濾光片,主要作用：接收、處理光信號(hào)；將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，再將電信號(hào)數(shù)字化；主要部件：光電二極管（PD)、光電倍增管（PMT）、信號(hào)處理板,,,,電子系統(tǒng),信

8、號(hào)檢測(cè)原理,信號(hào)檢測(cè)器光電二極管無(wú)電流放大作用信噪低光電倍增管（PMT）電流放大倍數(shù)可達(dá)106信噪比較光電二極管高,,,,,,,脈沖高度（H）,脈沖寬度（W）,,脈沖面積（A）,信號(hào)類型,脈沖信號(hào),,熒光,側(cè)向散射光,前向散射光,FSC檢測(cè)器,FSC檢測(cè)器,,,,,激光,,,,,,,,,,,,,FL5(PE-cy7),FL3(PerCP),FL2(PE),FL1(FITC),SS,488/10,530

9、/30,FS,488/10,585/40,670LP,785/60,491/LP,550LP,645LP,660/20,785/60,740LP,反光鏡,,,,FL6(APC-cy7),FL4(APC),反光鏡,,,,,,,,,,,FL1,FL2,流式細(xì)胞儀工作原理模擬圖,配置：激光器數(shù)目和熒光通道數(shù)目；靈敏度：能檢測(cè)最小粒子的大??； 能檢測(cè)細(xì)胞上最少的熒光分子的數(shù)量（MESF）；分辨率：衡量?jī)x器測(cè)量精

10、度的指標(biāo)（CV）；分析速度：指每秒分析的粒子個(gè)數(shù)；,常用流式細(xì)胞儀術(shù)語(yǔ),,目錄,流式樣本的前處理,流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)域原理,流式細(xì)胞儀的定義和分類,流式數(shù)據(jù)的獲取和分析,流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)流程,酶消化法機(jī)械法化學(xué)處理法,細(xì)胞膜抗原標(biāo)記細(xì)胞漿抗原標(biāo)記膜漿抗原同時(shí)標(biāo)記單色標(biāo)記多色標(biāo)記,,,,目錄,流式數(shù)據(jù)的獲取和分析,流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)域原理,流式細(xì)胞儀的定義和分類,流式樣本的前處理,流式細(xì)胞儀上機(jī)流程,流速,停止條件,低、中、高速

11、低速樣本流最穩(wěn)定高速收集速度最快,時(shí)間體積粒子數(shù)特定目標(biāo)細(xì)胞團(tuán)在選定條件點(diǎn)自動(dòng)停止測(cè)試,儀器設(shè)置,用戶可通過(guò)PC端軟件進(jìn)行以下條件的設(shè)置，并可直觀觀察到變化，從而獲得滿意的結(jié)果。,,,,主要作用：數(shù)據(jù)分析、顯示主要部件：電腦工作站,數(shù)據(jù)分析要素,,,,圖—類型,,,直方圖,散點(diǎn)圖,等高線圖,密度圖,三維立體圖,圖——坐標(biāo)軸顯示,線性坐標(biāo)：將數(shù)據(jù)均勻的映射到各個(gè)像素點(diǎn)；一般用于顯示FSC和SSC數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)坐標(biāo)：

12、數(shù)據(jù)做對(duì)數(shù)變換后均勻的映射到各個(gè)像素點(diǎn) 可以將大數(shù)據(jù)在坐標(biāo)軸上壓縮，小數(shù)據(jù)在坐標(biāo)軸上拉伸 可用于陽(yáng)性標(biāo)定范圍廣、但陰性標(biāo)定信號(hào)低，線性坐標(biāo)不易于分辨的情況雙指數(shù)坐標(biāo)：數(shù)據(jù)做雙指數(shù)變換后均勻的映射到各個(gè)像素點(diǎn) 雙指數(shù)可解決對(duì)數(shù)坐標(biāo)表示時(shí)小的部分過(guò)于放大及無(wú)法顯示負(fù)數(shù)的問(wèn)題,線性,對(duì)數(shù),雙指數(shù),設(shè)門(mén)：在細(xì)胞分布圖中確定一個(gè)范圍，對(duì)感興趣的細(xì)胞進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)析