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文檔簡介
1、硒、硫?qū)π坌孕“资竽X組織的影響,主要內(nèi)容,選題的背景和意義實驗材料與處理實驗方法實驗結(jié)果結(jié)論與討論,近年來一些研究表明,腦組織中少突膠質(zhì)細胞的發(fā)育成熟階段,離不開硒元素的作用。通過 Northern blot analysis 技術(shù)發(fā)現(xiàn)硒對磷脂蛋白、堿性蛋白和髓鞘相關(guān)糖蛋白的基因表達有上調(diào)作用。在對硒碘處理后的神經(jīng)細胞增殖密度、大腦皮質(zhì)和板層厚度神經(jīng)元的樹突分枝等指標的檢測中,可得出錐體細胞的基樹突及主干樹突分枝、星形細胞的樹突
2、分支明顯增長,說明一定濃度的硒促進腦細胞增殖發(fā)育。 另一些研究顯示硒促進腦神經(jīng)細胞DNA的合成,并且硒可抵消汞、氟對細胞增殖發(fā)育的抑制作用。 此外分子水平研究顯示,硒能夠降低汞污染糧食誘導的大鼠腦神經(jīng)系統(tǒng)c-los mRNA表達和c-los蛋白表達,證實了硒對于汞神經(jīng)毒性的拮抗作用。,選題的背景和意義,雖然硒對人類正常生命活動、生長發(fā)育、生理生化反應(yīng)的調(diào)節(jié)具有深遠意義,但是攝入硒的含量超出或低于正常范圍時,也會給人造成一
3、定威脅。在人體生長發(fā)育階段攝入硒含量過低,硒元素缺失,會引起克山病和大骨節(jié)病等疾病。其次,硒又具有一定毒性,當攝入的硒含量超標時,會引起人體機能的損傷。如亞硒酸鈉是一種具有劇毒性的白色晶體,雖然它可以合成有機體所需要的含硒的生物活性物質(zhì),但不能提高有機體內(nèi)硒的存儲水平,而且 亞硒酸鈉攝入過量會引起硒中毒,導致神經(jīng)系統(tǒng)嚴重受損。 因此本實驗進行了硒硫拮抗作用與腦組織(神經(jīng)系統(tǒng))的相關(guān)關(guān)系的研究,這對人體腦組織生長發(fā)育具有重大影響和
4、研究意義。,實驗材料 本實驗選取的動物是雄性昆明鼠材料處理 挑選48只體態(tài)正常,體重接近,健康狀況良好的小白鼠隨機分為6組,每組8只。試驗周期45天,先進行為期兩周的預飼養(yǎng),正式試驗期為30天。在預飼期測量出小鼠的平均日糧為6.5g,平均飲水量為7.5ml。進入正式試驗后,每日通過飲水添加適量硫酸鈉和不同濃度的亞硒酸鈉。硫酸鈉添加量是日糧的0.2%,亞硒酸鈉的添加量分別是0mg/Kg、0.2mg/Kg、0.5mg/K
5、g、1mg/Kg、2mg/Kg、4mg/Kg。經(jīng)日糧與飲水換算后分組情況見表1.,實驗材料與處理,表1實驗分組表,(1)樣品采集與處理(2)樣品固定(3)石蠟包埋(4)組織學染色(5)細胞凋亡染色(6)圖像分析與數(shù)據(jù)處理,實驗方法,(1)樣品采集與處理 飼養(yǎng)結(jié)束后,將小鼠按照組別進行解剖,每組5只,共6組。每組取2只腦組織清洗并進行固定,其余按組分帶包裝放于、-40℃冰箱中保存。(2)樣品固定
6、將同組不同腦組織分別浸泡于4%的中型多聚甲醛溶液,時間為24h至72h。(3)石蠟包埋 a 預處理:將固定好的腦組織進行修整 b 脫水:用以下梯度處理組織塊,實驗方法,c 乙醇75%(2小時)→85(2小時)→95%(1小時)→95%(1小時)→100%(45分鐘)→無水乙醇和二甲苯(1:1)浸泡20分鐘。 d 透明:二甲苯(45分鐘)—二甲苯(45分鐘)。 e 浸蠟:浸蠟3小時,工作臺和蠟鍋的溫度
7、范圍控制在60℃~65℃。 f 組織包埋:用紙疊成無蓋的長方體盒子,腦組織平均分開放于盒底并記好順序,將蠟緩慢的灌于盒中,在室溫下放在平整的地方至完全凝固。,(4)組織學染色 二甲苯Ⅰ5分鐘、二甲苯Ⅱ5分鐘脫蠟→梯度酒精100%Ⅱ、100%Ⅰ、95%各2分鐘,90%、80%、70%各1分鐘下行至水→蒸餾水浸泡2分鐘→滴加蘇木素染液靜置10~15分鐘,蒸餾水沖洗→1%鹽酸酒精脫色1分鐘,沖洗藍化→伊紅染色復染2~5分鐘
8、,蒸餾水沖去復色→梯度酒精70%、80%、90%各1分鐘,95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ各2分鐘→二甲苯Ⅰ5分鐘,二甲苯5分鐘透明→中性樹脂封片。,(5)細胞凋亡染色 a 切片脫蠟至水二甲苯Ⅰ5分鐘、二甲苯Ⅱ5分鐘脫蠟→梯度酒精100%Ⅱ、100%Ⅰ、95%各2分鐘,90%、80%、70%各1分鐘下行至水→蒸餾水浸泡2分鐘 b 滴加3%H2O2,室溫靜置10分鐘對內(nèi)源性酶進行滅活,蒸餾水洗3次,每次2分鐘。 c
9、 配制0.01MTBS1:200新鮮稀釋Proteinse K ,滴加Pro K,37℃消化15min,0.01MTBS洗3次,每次2分鐘。 d 滴加標記緩沖液,每片20微升。 e 每片取TdT與DIG-d-UTP各1微升加入18微升的標記緩沖液中混勻,滴加到組織上,置于濕盒,37℃標記2小時。,f 0.01MTBS清洗三次,每次2分鐘。 g 每片加50微升封閉液,室溫靜置30分鐘。 h 配制抗體稀
10、釋液1:100稀釋生物素化地高辛抗體,每片載玻片加50微升,置于濕盒,37℃30分鐘。之后TBS洗3次每次2分鐘 i 配制抗體稀釋液1:100稀釋SABC,每片載玻片加10微升,置于濕盒,37℃30分鐘。之后TBS洗4次每次5分鐘 j DAB顯色,使用DAB顯色盒。在1ml蒸餾水中加試劑盒ABC試劑各一滴,混勻加至切片。室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時間,一般5~30分鐘,蒸餾水洗滌。 k中性樹脂封片,(6)圖像
11、分析與數(shù)據(jù)處理 每個個體石蠟切片在顯微鏡下取至少5個視野進行拍照,使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析,得出陽性區(qū)域的平均光密度值。對所得到的數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析和差異顯著性檢驗。,(1)HE染色結(jié)果,腦組織結(jié)構(gòu)(40倍),實驗結(jié)果,,,,空泡區(qū),神經(jīng)元,,髓鞘,,小膠質(zhì)細胞,第二組,第一組,第三組,40倍顯微鏡下觀察,結(jié)論與討論,第五組,第四組,表2 40倍鏡下觀察腦組織HE染色
12、結(jié)果,HE T檢驗結(jié)果,注:a,b,c,d表示差異顯著,A,B表示差異極顯著。,由表2結(jié)果可知,尼氏體在亞硒酸鈉添加量為2mg/Kg的第5 組中含量最高,顯著高于 第3、4 和6組(p<0.05),其它組之間比較差異不顯著(p>0.05);小膠質(zhì)細胞也是在亞硒酸鈉添加量為2mg/Kg的5組數(shù)量最少,顯著低于1、2、3、4、6組(p<0.05);空泡區(qū)的數(shù)量雖然在統(tǒng)計學上無意義,但4、6組的數(shù)量要高于1、2、3組。,(2)細胞凋亡染色結(jié)果
13、,腦組織結(jié)構(gòu)(40倍),,小膠質(zhì)細胞,第一組,第二組,第三組,第四組,第五組,表3 40倍鏡下觀察腦組織Tunel染色結(jié)果,,細胞凋亡 T檢驗結(jié)果,注:a,b,c,d表示差異顯著,A,B表示差異極顯著。,表3結(jié)果顯示,組6 的凋亡細胞最多。組2 和組3的細胞凋亡最小,顯著低于1、4、5組(p<0.05),極顯著低于6組(p<0.01);組1與組4、5比較差異不顯著(p>0.05)。,(3)腦組織重量結(jié)果,表4 腦組織重量記錄,實驗結(jié)果表
14、明實驗組間無差異性(p>0.05)。即腦組織的重量不隨試驗處理組的不同而改變。,結(jié)論與討論,(1)日糧中硒、硫的添加對小鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 試驗對6個組別腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)中的尼氏小體、小膠質(zhì)細胞和空泡區(qū)進行了統(tǒng)計分析??张輩^(qū)是在神經(jīng)元細胞固縮時,周圍產(chǎn)生空白區(qū)域而形成的,當細胞受到損傷時,易形成空泡區(qū)??张輩^(qū)的試驗結(jié)果雖然無統(tǒng)計學意義,但第4和第6組最多,顯然隨著硒濃度的增高硒還是對腦組織產(chǎn)生了一定的損傷作用。小膠質(zhì)細胞是腦
15、組織中的免疫細胞,具有對外界刺激敏感的特性,毒性物質(zhì)對腦組織造成損害使神經(jīng)元變性之前,小膠質(zhì)細胞會先產(chǎn)生變化,因此小膠質(zhì)細胞可以作為腦組織損害的“信號彈”,同時中樞神經(jīng)系統(tǒng)在受到攝入物影響時,小膠質(zhì)細胞是系統(tǒng)中最早發(fā)生反應(yīng)的細胞類型,它也是一些受體和和分泌物的主要儲庫,通過吞噬作用和分泌作用進而保護神經(jīng)元細胞。,我們的試驗結(jié)果中第二組小膠質(zhì)細胞含量最多,說明硒的添加造成了腦組織中微環(huán)境的變化,促進了腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞分泌多種生長因子,積極參
16、與了腦組織塑性、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和腦的免疫應(yīng)答反應(yīng)。隨著硒添加濃度的增高,小膠質(zhì)體的數(shù)量從第5組開始下降,可能是因為當攝入高濃度的亞硒酸鈉時,硒對小膠質(zhì)細胞造成損傷而下調(diào)了細胞的數(shù)量,導致其含量減少。,尼氏體是由神經(jīng)元細胞的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成的結(jié)構(gòu),腦組織發(fā)生病變時,尼氏體會進行溶解,進而導致細胞萎縮壞死。HE染色結(jié)果顯示,第5組的尼氏體含量雖然顯著高于第3、4和6組,但于第1和2組之間無統(tǒng)計學意義,而且在設(shè)定的6 個組中尼氏體的變化并沒有表
17、現(xiàn)出一定的趨勢??紤]會有兩方面的原因,一是血腦屏障對機體硒、硫的攝入有一定的阻擋作用,因此實際添加劑量呈現(xiàn)出遞減的效應(yīng);二是我們在進行對尼氏體的觀察中,采用了HE的染色方法,每個個體的切片取5 個視野進行計數(shù),而甲苯胺藍才是尼氏體的專一染色劑,因此在計數(shù)方面造成了很大的人為誤差,表現(xiàn)為尼氏體的統(tǒng)計分析中數(shù)值離散,標準誤較大。,4.2日糧中硒、硫的添加對小鼠腦組織細胞凋亡的影響 細胞凋亡是一種正常的、受基因調(diào)控的、自發(fā)的基本生命
18、現(xiàn)象,它與許多人類疾病有直接間接的關(guān)系,通過對細胞凋亡機理的探究可以闡明眾多生物生理病理生命活動現(xiàn)象的本質(zhì)。正因為細胞凋亡是許多疾病發(fā)病的原因,所以對于它的研究不僅受到生物學界的重視,同樣也日益受到臨床醫(yī)學領(lǐng)域的廣泛研究。,腦組織經(jīng)過細胞凋亡染色后發(fā)現(xiàn),第6組細胞凋亡指數(shù)最高且明顯高于其他組別說明4mg/kg的硒濃度對腦組織的許多細胞造成嚴重毒性影響。第2、3組細胞凋亡指數(shù)最低說明硒硫聯(lián)合作用突出。第一組的細胞凋亡指數(shù)在整個實驗組中呈中
19、等趨勢表明在不添加亞硒酸鈉的條件下,腦細胞同樣進行凋亡,補充說明細胞凋亡是細胞的一種正常生命活動現(xiàn)象這一論點。第4、5組細胞凋亡指數(shù)在整個組中也呈中等趨勢,這說明硒硫聯(lián)合作用隨硒濃度上升而逐漸減弱,硒的毒性特征逐漸體現(xiàn)。,對于腦組織重量來說,在進行藥物干涉飼養(yǎng)之前,小白鼠腦組織已經(jīng)發(fā)育完善,因此亞硒酸鈉的毒性作用,硒硫聯(lián)合作用對腦組織重量的影響效果甚微,實驗組間腦組織重量無差異。,結(jié)合腦組織神經(jīng)元細胞凋亡的結(jié)果對小鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)做出推
20、測,腦組織在硒濃度為0.2-0.5mg/kg的范圍內(nèi),小鼠腦組織神經(jīng)元細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,胞漿豐富,均勻淡染,核圓形,核仁清楚,尼氏體含量多;小膠質(zhì)細胞增多,提高了對神經(jīng)元細胞的保護作用,因此凋亡細胞較少。當硒濃度為2mg/kg,部分腦細胞(小膠質(zhì)細胞)受損傷但大部分腦細胞受損傷程度較低,因此2mg/kg的硒濃度屬于超營養(yǎng)濃度。當硒濃度達到4mg/kg時,腦細胞受損傷嚴重,細胞凋亡程度高,所以4mg/kg以上的硒濃度是腦組織的毒性濃度
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