硒硫,小鼠腦

1、硒、硫?qū)π坌孕“资竽X組織的影響,主要內(nèi)容,選題的背景和意義實驗材料與處理實驗方法實驗結(jié)果結(jié)論與討論,近年來一些研究表明，腦組織中少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育成熟階段，離不開硒元素的作用。通過 Northern blot analysis 技術(shù)發(fā)現(xiàn)硒對磷脂蛋白、堿性蛋白和髓鞘相關(guān)糖蛋白的基因表達(dá)有上調(diào)作用。在對硒碘處理后的神經(jīng)細(xì)胞增殖密度、大腦皮質(zhì)和板層厚度神經(jīng)元的樹突分枝等指標(biāo)的檢測中，可得出錐體細(xì)胞的基樹突及主干樹突分枝、星形細(xì)胞的樹突

2、分支明顯增長，說明一定濃度的硒促進(jìn)腦細(xì)胞增殖發(fā)育。 另一些研究顯示硒促進(jìn)腦神經(jīng)細(xì)胞DNA的合成，并且硒可抵消汞、氟對細(xì)胞增殖發(fā)育的抑制作用。 此外分子水平研究顯示，硒能夠降低汞污染糧食誘導(dǎo)的大鼠腦神經(jīng)系統(tǒng)c-los mRNA表達(dá)和c-los蛋白表達(dá)，證實了硒對于汞神經(jīng)毒性的拮抗作用。,選題的背景和意義,雖然硒對人類正常生命活動、生長發(fā)育、生理生化反應(yīng)的調(diào)節(jié)具有深遠(yuǎn)意義，但是攝入硒的含量超出或低于正常范圍時，也會給人造成一

3、定威脅。在人體生長發(fā)育階段攝入硒含量過低，硒元素缺失，會引起克山病和大骨節(jié)病等疾病。其次，硒又具有一定毒性，當(dāng)攝入的硒含量超標(biāo)時，會引起人體機(jī)能的損傷。如亞硒酸鈉是一種具有劇毒性的白色晶體，雖然它可以合成有機(jī)體所需要的含硒的生物活性物質(zhì)，但不能提高有機(jī)體內(nèi)硒的存儲水平，而且 亞硒酸鈉攝入過量會引起硒中毒，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重受損。 因此本實驗進(jìn)行了硒硫拮抗作用與腦組織（神經(jīng)系統(tǒng)）的相關(guān)關(guān)系的研究，這對人體腦組織生長發(fā)育具有重大影響和

4、研究意義。,實驗材料 本實驗選取的動物是雄性昆明鼠材料處理 挑選48只體態(tài)正常，體重接近，健康狀況良好的小白鼠隨機(jī)分為6組，每組8只。試驗周期45天，先進(jìn)行為期兩周的預(yù)飼養(yǎng)，正式試驗期為30天。在預(yù)飼期測量出小鼠的平均日糧為6.5g，平均飲水量為7.5ml。進(jìn)入正式試驗后，每日通過飲水添加適量硫酸鈉和不同濃度的亞硒酸鈉。硫酸鈉添加量是日糧的0.2%，亞硒酸鈉的添加量分別是0mg/Kg、0.2mg/Kg、0.5mg/K

5、g、1mg/Kg、2mg/Kg、4mg/Kg。經(jīng)日糧與飲水換算后分組情況見表1.,實驗材料與處理,表1實驗分組表,（1）樣品采集與處理（2）樣品固定（3）石蠟包埋（4）組織學(xué)染色（5）細(xì)胞凋亡染色（6）圖像分析與數(shù)據(jù)處理,實驗方法,（1）樣品采集與處理 飼養(yǎng)結(jié)束后，將小鼠按照組別進(jìn)行解剖，每組5只，共6組。每組取2只腦組織清洗并進(jìn)行固定，其余按組分帶包裝放于、-40℃冰箱中保存。（2）樣品固定

6、將同組不同腦組織分別浸泡于4%的中型多聚甲醛溶液，時間為24h至72h。（3）石蠟包埋 a 預(yù)處理：將固定好的腦組織進(jìn)行修整 b 脫水：用以下梯度處理組織塊,實驗方法,c 乙醇75%（2小時）→85（2小時）→95%（1小時）→95%（1小時）→100%（45分鐘）→無水乙醇和二甲苯（1：1）浸泡20分鐘。 d 透明：二甲苯（45分鐘）—二甲苯（45分鐘）。 e 浸蠟：浸蠟3小時，工作臺和蠟鍋的溫度

7、范圍控制在60℃~65℃。 f 組織包埋：用紙疊成無蓋的長方體盒子，腦組織平均分開放于盒底并記好順序，將蠟緩慢的灌于盒中，在室溫下放在平整的地方至完全凝固。,（4）組織學(xué)染色 二甲苯Ⅰ5分鐘、二甲苯Ⅱ5分鐘脫蠟→梯度酒精100%Ⅱ、100%Ⅰ、95%各2分鐘，90%、80%、70%各1分鐘下行至水→蒸餾水浸泡2分鐘→滴加蘇木素染液靜置10~15分鐘，蒸餾水沖洗→1%鹽酸酒精脫色1分鐘，沖洗藍(lán)化→伊紅染色復(fù)染2~5分鐘

8、，蒸餾水沖去復(fù)色→梯度酒精70%、80%、90%各1分鐘，95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ各2分鐘→二甲苯Ⅰ5分鐘，二甲苯5分鐘透明→中性樹脂封片。,（5）細(xì)胞凋亡染色 a 切片脫蠟至水二甲苯Ⅰ5分鐘、二甲苯Ⅱ5分鐘脫蠟→梯度酒精100%Ⅱ、100%Ⅰ、95%各2分鐘，90%、80%、70%各1分鐘下行至水→蒸餾水浸泡2分鐘 b 滴加3%H2O2，室溫靜置10分鐘對內(nèi)源性酶進(jìn)行滅活，蒸餾水洗3次，每次2分鐘。 c

9、 配制0.01MTBS1:200新鮮稀釋Proteinse K ，滴加Pro K,37℃消化15min，0.01MTBS洗3次，每次2分鐘。 d 滴加標(biāo)記緩沖液，每片20微升。 e 每片取TdT與DIG-d-UTP各1微升加入18微升的標(biāo)記緩沖液中混勻，滴加到組織上，置于濕盒，37℃標(biāo)記2小時。,f 0.01MTBS清洗三次，每次2分鐘。 g 每片加50微升封閉液，室溫靜置30分鐘。 h 配制抗體稀

10、釋液1:100稀釋生物素化地高辛抗體，每片載玻片加50微升，置于濕盒，37℃30分鐘。之后TBS洗3次每次2分鐘 i 配制抗體稀釋液1:100稀釋SABC，每片載玻片加10微升，置于濕盒，37℃30分鐘。之后TBS洗4次每次5分鐘 j DAB顯色，使用DAB顯色盒。在1ml蒸餾水中加試劑盒ABC試劑各一滴，混勻加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，一般5~30分鐘，蒸餾水洗滌。 k中性樹脂封片,（6）圖像

11、分析與數(shù)據(jù)處理 每個個體石蠟切片在顯微鏡下取至少5個視野進(jìn)行拍照，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，得出陽性區(qū)域的平均光密度值。對所得到的數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和差異顯著性檢驗。,（1）HE染色結(jié)果,腦組織結(jié)構(gòu)（40倍）,實驗結(jié)果,,,,空泡區(qū),神經(jīng)元,,髓鞘,,小膠質(zhì)細(xì)胞,第二組,第一組,第三組,40倍顯微鏡下觀察,結(jié)論與討論,第五組,第四組,表2 40倍鏡下觀察腦組織HE染色

12、結(jié)果,HE T檢驗結(jié)果,注：a,b,c,d表示差異顯著，A，B表示差異極顯著。,由表2結(jié)果可知，尼氏體在亞硒酸鈉添加量為2mg/Kg的第5 組中含量最高，顯著高于 第3、4 和6組（p＜0.05），其它組之間比較差異不顯著（p＞0.05）；小膠質(zhì)細(xì)胞也是在亞硒酸鈉添加量為2mg/Kg的5組數(shù)量最少，顯著低于1、2、3、4、6組（p＜0.05）；空泡區(qū)的數(shù)量雖然在統(tǒng)計學(xué)上無意義，但4、6組的數(shù)量要高于1、2、3組。,（2）細(xì)胞凋亡染色結(jié)果

13、,腦組織結(jié)構(gòu)（40倍）,,小膠質(zhì)細(xì)胞,第一組,第二組,第三組,第四組,第五組,表3 40倍鏡下觀察腦組織Tunel染色結(jié)果,,細(xì)胞凋亡 T檢驗結(jié)果,注：a,b,c,d表示差異顯著，A，B表示差異極顯著。,表3結(jié)果顯示，組6 的凋亡細(xì)胞最多。組2 和組3的細(xì)胞凋亡最小，顯著低于1、4、5組（p＜0.05），極顯著低于6組（p＜0.01）；組1與組4、5比較差異不顯著（p＞0.05）。,（3）腦組織重量結(jié)果,表4 腦組織重量記錄,實驗結(jié)果表

14、明實驗組間無差異性（p＞0.05）。即腦組織的重量不隨試驗處理組的不同而改變。,結(jié)論與討論,（1）日糧中硒、硫的添加對小鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 試驗對6個組別腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)中的尼氏小體、小膠質(zhì)細(xì)胞和空泡區(qū)進(jìn)行了統(tǒng)計分析?？张輩^(qū)是在神經(jīng)元細(xì)胞固縮時，周圍產(chǎn)生空白區(qū)域而形成的，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時，易形成空泡區(qū)。空泡區(qū)的試驗結(jié)果雖然無統(tǒng)計學(xué)意義，但第4和第6組最多，顯然隨著硒濃度的增高硒還是對腦組織產(chǎn)生了一定的損傷作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦

15、組織中的免疫細(xì)胞，具有對外界刺激敏感的特性，毒性物質(zhì)對腦組織造成損害使神經(jīng)元變性之前，小膠質(zhì)細(xì)胞會先產(chǎn)生變化，因此小膠質(zhì)細(xì)胞可以作為腦組織損害的“信號彈”，同時中樞神經(jīng)系統(tǒng)在受到攝入物影響時，小膠質(zhì)細(xì)胞是系統(tǒng)中最早發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞類型，它也是一些受體和和分泌物的主要儲庫，通過吞噬作用和分泌作用進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞。,我們的試驗結(jié)果中第二組小膠質(zhì)細(xì)胞含量最多，說明硒的添加造成了腦組織中微環(huán)境的變化，促進(jìn)了腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌多種生長因子，積極參

16、與了腦組織塑性、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和腦的免疫應(yīng)答反應(yīng)。隨著硒添加濃度的增高，小膠質(zhì)體的數(shù)量從第5組開始下降，可能是因為當(dāng)攝入高濃度的亞硒酸鈉時，硒對小膠質(zhì)細(xì)胞造成損傷而下調(diào)了細(xì)胞的數(shù)量，導(dǎo)致其含量減少。,尼氏體是由神經(jīng)元細(xì)胞的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成的結(jié)構(gòu)，腦組織發(fā)生病變時，尼氏體會進(jìn)行溶解，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞萎縮壞死。HE染色結(jié)果顯示，第5組的尼氏體含量雖然顯著高于第3、4和6組，但于第1和2組之間無統(tǒng)計學(xué)意義，而且在設(shè)定的6 個組中尼氏體的變化并沒有表

17、現(xiàn)出一定的趨勢。考慮會有兩方面的原因，一是血腦屏障對機(jī)體硒、硫的攝入有一定的阻擋作用，因此實際添加劑量呈現(xiàn)出遞減的效應(yīng)；二是我們在進(jìn)行對尼氏體的觀察中，采用了HE的染色方法，每個個體的切片取5 個視野進(jìn)行計數(shù)，而甲苯胺藍(lán)才是尼氏體的專一染色劑，因此在計數(shù)方面造成了很大的人為誤差，表現(xiàn)為尼氏體的統(tǒng)計分析中數(shù)值離散，標(biāo)準(zhǔn)誤較大。,4.2日糧中硒、硫的添加對小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞凋亡是一種正常的、受基因調(diào)控的、自發(fā)的基本生命

18、現(xiàn)象，它與許多人類疾病有直接間接的關(guān)系，通過對細(xì)胞凋亡機(jī)理的探究可以闡明眾多生物生理病理生命活動現(xiàn)象的本質(zhì)。正因為細(xì)胞凋亡是許多疾病發(fā)病的原因，所以對于它的研究不僅受到生物學(xué)界的重視，同樣也日益受到臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛研究。,腦組織經(jīng)過細(xì)胞凋亡染色后發(fā)現(xiàn)，第6組細(xì)胞凋亡指數(shù)最高且明顯高于其他組別說明4mg/kg的硒濃度對腦組織的許多細(xì)胞造成嚴(yán)重毒性影響。第2、3組細(xì)胞凋亡指數(shù)最低說明硒硫聯(lián)合作用突出。第一組的細(xì)胞凋亡指數(shù)在整個實驗組中呈中

19、等趨勢表明在不添加亞硒酸鈉的條件下，腦細(xì)胞同樣進(jìn)行凋亡，補(bǔ)充說明細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種正常生命活動現(xiàn)象這一論點(diǎn)。第4、5組細(xì)胞凋亡指數(shù)在整個組中也呈中等趨勢，這說明硒硫聯(lián)合作用隨硒濃度上升而逐漸減弱，硒的毒性特征逐漸體現(xiàn)。,對于腦組織重量來說，在進(jìn)行藥物干涉飼養(yǎng)之前，小白鼠腦組織已經(jīng)發(fā)育完善，因此亞硒酸鈉的毒性作用，硒硫聯(lián)合作用對腦組織重量的影響效果甚微，實驗組間腦組織重量無差異。,結(jié)合腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的結(jié)果對小鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)做出推

20、測，腦組織在硒濃度為0.2-0.5mg/kg的范圍內(nèi)，小鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，胞漿豐富，均勻淡染，核圓形，核仁清楚，尼氏體含量多；小膠質(zhì)細(xì)胞增多，提高了對神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用，因此凋亡細(xì)胞較少。當(dāng)硒濃度為2mg/kg，部分腦細(xì)胞（小膠質(zhì)細(xì)胞）受損傷但大部分腦細(xì)胞受損傷程度較低，因此2mg/kg的硒濃度屬于超營養(yǎng)濃度。當(dāng)硒濃度達(dá)到4mg/kg時，腦細(xì)胞受損傷嚴(yán)重，細(xì)胞凋亡程度高，所以4mg/kg以上的硒濃度是腦組織的毒性濃度