sebia全自動(dòng)凝膠電泳儀的臨床應(yīng)用

1、Sebia 全自動(dòng)凝膠電泳儀臨床應(yīng)用,襄陽(yáng)市中心醫(yī)院,使用范圍和檢測(cè)原理,電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下, 由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小, 形狀等性質(zhì)的差異, 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度, 從而對(duì)樣品進(jìn)行分離, 鑒定或提純的技術(shù).在生化檢測(cè)中, 主要用于分離各類蛋白分子.,發(fā)展歷程,1809年俄國(guó)科學(xué)家列伊斯首先發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象1937年瑞典科學(xué)家Tiselius建立了界面電泳技術(shù), 并首次證明了血清是由白蛋白

2、及α, β, γ球蛋白組成的因此獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng).1950年后, 區(qū)帶電泳從發(fā)展到成熟. 1980年以來(lái), 毛細(xì)管電泳逐漸受到重視,常用的電泳技術(shù),濾紙電泳醋酸纖維素薄膜電泳凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 : 瓊脂糖凝膠適用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì), 成本低, 結(jié)果易保存.聚丙烯酰胺凝膠電泳 : 最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方法, 特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量, 一般用于科研.毛細(xì)管電泳 :經(jīng)典電泳技術(shù)和

3、現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物,,血清蛋白電泳 免疫固定電泳非濃縮尿蛋白電泳,血清蛋白電泳,法國(guó)SEBIA 凝膠電泳,瓊脂糖凝膠介質(zhì)，分子篩效應(yīng)，分辨率高不吸附蛋白質(zhì)，阻力小，分離清晰，透明度高PH8.8堿性環(huán)境根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的多少和蛋白分子的大小及形狀分離不同的蛋白成分按泳動(dòng)速度分成5個(gè)區(qū)帶 （每個(gè)區(qū)帶含1種或更多種的蛋白成分）,30人份瓊脂糖凝膠片血清蛋白電泳,正常血清蛋白電泳圖譜,血清蛋白電泳的正常參考值,各區(qū)帶

4、構(gòu)成,Alb：白蛋白 α1：α1酸性糖蛋白；α1抗胰蛋白酶 α1 脂蛋白;甲胎蛋白 α2：HP；α2巨球蛋白；α脂蛋白；CERβ：轉(zhuǎn)鐵蛋白；補(bǔ)體系統(tǒng)； β脂蛋白 纖維蛋白原； β 2微球蛋白 γ：IgG；IgM；IgA；IgD；IgE CRP,血清蛋白電泳可以幫助我們精確地描繪出患者血清蛋白質(zhì)的全貌，是生化儀測(cè)定蛋白質(zhì)的完善和補(bǔ)充

5、可以提示是哪一種球蛋白異常，便于臨床有的放矢的進(jìn)一步檢查，節(jié)省患者費(fèi)用,對(duì)單一克隆漿細(xì)胞異常增殖產(chǎn)生M蛋白的檢測(cè),血清蛋白電泳是其首選的實(shí)驗(yàn)診斷方法，由于MM髓外病灶在肝、脾、淋巴結(jié)多見(jiàn)，故認(rèn)為肝功能異?；颊邞?yīng)進(jìn)行血清蛋白電泳檢測(cè)作為篩選可幫助對(duì)一些遺傳性疾病作出診斷，如：雙白蛋白血癥、 α1抗胰蛋白酶缺陷，蛋白電泳呈現(xiàn)特征性圖譜,血清蛋白電泳中發(fā)現(xiàn)的與急性時(shí)相反應(yīng)蛋白相關(guān)的疾病,Alb ↑ 脫水 ↓ 慢性消耗性疾病

6、、慢性炎癥、出血、燒傷、蛋白丟失、腸病、因白蛋白 減低而引起的肝臟功能下降、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、腎病綜合征、 妊娠 α1 ↑ 妊娠 ↓ 低抗胰蛋白酶血癥 α2 ↑ 腎上腺不足、腎上腺皮質(zhì)類固醇治療、糖尿病 、腎病綜合征 ↓ 營(yíng)養(yǎng)不良、巨紅細(xì)胞性貧血、蛋白丟失的腸病、嚴(yán)重肝病、 Wilson‘s 病 β ↑ 膽汁硬化、癌癥 ( 有時(shí) ) 、 Cushing ‘ s 病、糖尿病 ( 某些病例 )

7、 甲狀腺機(jī)能減退、缺鐵性貧血 、惡性高血壓、腎病 、多動(dòng)脈炎、阻塞 性黃疸、妊娠 ↓ 營(yíng)養(yǎng)不良 γ ↑ 淀粉樣變性、慢性感染、慢性淋巴細(xì)胞白血病、硬化 、 Hodgkin‘s 疾 病、惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)締組織病、 巨細(xì)胞血癥 ↓ 血中丙種球蛋白缺乏、低丙種球蛋白癥,球蛋白區(qū)域的變化在肝病的臨床意義,α1球蛋白在肝炎初期，作為急性期反應(yīng)物質(zhì)常增加，而肝損害嚴(yán)重時(shí)則降

8、低，在致命的肝功能衰竭時(shí)可以降低到很低的水平,球蛋白區(qū)域的變化在肝病的臨床意義,α2球蛋白的降低可能由于結(jié)合珠蛋白合成降低所致，但在膽汁淤積性肝炎時(shí)由于α2脂蛋白增加可見(jiàn)到α2球蛋白部位增加，當(dāng)亞急性肝炎和肝壞死時(shí)，α2球蛋白則明顯減少，故α2球蛋白的變化可作為肝障礙時(shí)的特征性指標(biāo)，如明顯下降，提示預(yù)后不良,球蛋白區(qū)域的變化在肝病的臨床意義,β球蛋白在肝炎早期幾乎沒(méi)有變化，但由于此組分也有脂蛋白，膽汁淤積性肝炎時(shí)與α

9、2球蛋白一樣，多數(shù)明顯升高，當(dāng)肝細(xì)胞損害嚴(yán)重時(shí)，由于肝臟合成減少則明顯降低,球蛋白區(qū)域的變化在肝病的臨床意義,幾乎所有肝臟疾病γ球蛋白均升高，且呈多 株性的，其增加的范圍與疾病的嚴(yán)重程度 相一致，若轉(zhuǎn)為慢性可見(jiàn)γ球蛋白明顯增高 這是由于免疫球蛋白合成亢進(jìn)所致。,血清蛋白電泳圖譜在肝臟疾病的變化,T-PROT Alb α1 α2 β γ肝炎 ↓N ↓↓ ↑↓

10、 ↓↓↑肝硬化 ↓N↑ ↓↓ N ↓ N ↓β-γ橋肝癌 ↓N ↓↓ 甲胎蛋白 N ↓ N ↑N,血清蛋白電泳圖譜在腎病的改變,Alb明顯降低，α1-球蛋白輕度增加，α2-球蛋白明顯增加， β-球蛋白降低、正常、增高，γ-球蛋白降低、正常 小兒類脂樣腎病時(shí)，γ-球蛋白可降低，有時(shí)可降低至零 成人腎病綜合癥時(shí)，γ-球蛋白通常增加，特別是狼瘡性腎病。,腎病綜合征,急性感染

11、綜合征,,先天性白蛋白缺乏癥,雙白蛋白血癥,α1抗胰蛋白酶缺乏癥,貧血之高轉(zhuǎn)鐵蛋白,免疫球蛋白增高,血清蛋白電泳是 M蛋白（Monoclonal Protein） 多克隆 （polyclonal Protein) 寡克隆 （Oligoclonal Protein) 的首選檢測(cè)項(xiàng)目,,M蛋白疾?。∕onoclonal gammap-athies, MG）是由于單一克隆漿細(xì)胞無(wú)

12、限增殖產(chǎn)生的均一單克隆蛋白（Monoclonal- proteins)所導(dǎo)致的一組疾病。 M蛋白疾病的“M”含義是Myeloma, Macroglobulinemia和Malignant lymphoma，Monoclonal Gammapathies均以“M”開(kāi)頭。M蛋白在電泳上表現(xiàn)為高而狹窄的尖峰（高/寬>2:1）.,多發(fā)性骨髓瘤的臨床特征： 骨質(zhì)疏松和溶骨現(xiàn)象 貧血，粒細(xì)胞、血小板減少 腎淀粉樣

13、變性損害 免疫功能低下，易感增加,多發(fā)性骨髓瘤的免疫學(xué)特征:,血中出現(xiàn)M蛋白,正常Ig水平明顯減低尿中出現(xiàn)M蛋白和輕鏈蛋白(BJP)骨髓中漿細(xì)胞明顯增加無(wú)免疫活性Ig導(dǎo)致免疫功能低下,巨球蛋白血癥（Waldenstrom氏）,患者血中存在大量單克隆IgM，,血粘度明顯增多，骨骼損害不常見(jiàn)，,疾病發(fā)展類似淋巴瘤。,,輕鏈病,輕鏈病多表現(xiàn)為腎臟損害，極易誤診為慢性腎炎。我們認(rèn)為輕鏈有3種形式出現(xiàn)在血清或尿中；一是正常的輕鏈過(guò)剩（K

14、appa和Lambda同時(shí)出現(xiàn)），多出現(xiàn)于慢性肝病，SLE等多克隆增殖中。二是伴隨輕鏈。三是單一輕鏈，血和尿中只出現(xiàn)單一增殖的大量輕鏈。,重鏈病,由于制造Ig的漿細(xì)胞發(fā)生突變，并惡性增殖，只產(chǎn)生重鏈或產(chǎn)生的重鏈有缺陷，因而輕鏈和重鏈不能組成完整的Ig，血中出現(xiàn)大量無(wú)免疫功能的Ig片段---重鏈，由此產(chǎn)生一系列重鏈病變。重鏈病是免疫蛋白的結(jié)構(gòu)異常所致。常見(jiàn)三型。該病發(fā)病率極低。,M蛋白電泳圖譜,M蛋白是單克隆性漿細(xì)胞或淋巴細(xì)胞大

15、量增殖而產(chǎn)生的一種在氨基酸組成基排列順序上十分均一的異常球蛋白，其本質(zhì)是免疫球蛋白或其片斷M蛋白在α2～γ區(qū)形成濃密區(qū)帶用光度計(jì)可掃出基底較窄，高而尖銳的蛋白峰其標(biāo)準(zhǔn)為： 在γ區(qū)，蛋白峰的高和寬之比應(yīng)＞2：1；在 β區(qū)和α2區(qū)應(yīng)＞ 1：1,位于β區(qū)的單克隆IgA,單克隆帶,寡克隆圖案,輕鏈病,老年性單克隆帶,位于α2區(qū)單克隆帶,多發(fā)性骨髓瘤的誤診原因分析,,多發(fā)性骨髓瘤診斷標(biāo)準(zhǔn),1.骨髓中漿細(xì)胞>15％，并有異常漿細(xì)胞（

16、骨髓瘤細(xì)胞）或骨髓活檢為漿細(xì)胞瘤。為主要的診斷依據(jù)?！　?2.血清中出現(xiàn)大量單克隆免疫球蛋白（M蛋白），IgG>35g/L；IgA>20g/L；IgD>2.0g/L；IgE>2.0g/L；IgM>15g/L或尿中出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白輕鏈，輕鏈排出>1g/24小時(shí)。 　　 3.無(wú)其他原因的溶骨病變或廣泛性骨質(zhì)疏松。,免疫固定電泳 對(duì)M蛋白的分型與鑒定 已作為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作,

17、將待測(cè)血清或其他標(biāo)本在瓊脂平板上作區(qū)帶電泳，分離后于其上覆蓋含抗κ或λ輕鏈或各類重鏈的抗血清濾紙，當(dāng)抗體與某區(qū)帶中的單克隆免疫球蛋白結(jié)合后，便形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，再通過(guò)漂洗與染色，呈現(xiàn)濃而狹窄的著色區(qū)帶，即可判斷單克隆丙種球蛋白的輕鏈和重鏈型別。,4人份瓊脂糖凝膠固定免疫電泳,正常血漿免疫固定電泳,IgM重鏈及κ輕鏈,κ輕鏈型IgG并其他Ig缺乏,κ輕鏈型IgA并其他Ig缺乏,寡克隆帶,移植病人之寡克隆帶,艾滋病人之寡克隆帶,游離λ輕

18、鏈,Electrophoretic exploration of proteinuria,非濃縮尿蛋白電泳臨床應(yīng)用,,,腎單位生理及與血漿蛋白質(zhì)關(guān)系,腎臟近二百萬(wàn)個(gè)腎單位每天過(guò)濾1600 升血液并產(chǎn)生180升原尿，經(jīng)腎小管重吸收后最終排出約1.5升終尿。,,,,,白蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白免疫球蛋白微蛋白,,白蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白免疫球蛋白,,微蛋白,腎小球?yàn)V過(guò)膜,,腎小管重吸收,,,微蛋白,,,腎小管分泌(Thamm-Horsfall蛋白),

19、,,,,,終尿中白蛋白占1/3 ，球蛋白占 2/3。,尿蛋白定義,生理性尿蛋白為50 — 150 毫克／天 (大約 100毫克／升以下) 主要成分為白蛋白 (30毫克／天 以下)病理性尿蛋白為超過(guò)1８0 毫克／天 蛋白質(zhì)成分復(fù)雜多樣,尿蛋白增加的原因,生理性：間歇性 (體位, 高蛋白飲食, 劇烈運(yùn)動(dòng)后, 精神壓力大)腎前性：高血壓，高熱，心臟或肝臟衰竭,… 血中蛋白濃度過(guò)高 (溢出性蛋白尿)腎性：腎小球或腎小管損害

20、(或兩著均有)腎后性：泌尿生殖道損害,十二烷基磺酸鈉-瓊脂糖凝膠電泳（SDS-AGE）技術(shù)的分析原理,SDS（Sodium Dodecysulphate）是一種陰離子型表面活性劑，當(dāng)其濃度達(dá)蛋白質(zhì)的5-10倍時(shí)，與還原劑共同作用，能使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫建和二硫鍵斷裂，解離成單獨(dú)的亞基與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的亞基-SDS膠束，所帶電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而消除了不同分子之間的原有電荷差異。根據(jù)流體動(dòng)力學(xué)的研究證明，

21、這種復(fù)合物是橢圓形，短軸約為1.8A，但長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度與亞基分子量的大小呈正比，加之瓊脂膠的分子篩作用，使電泳的遷移率與摩擦系數(shù)的反比關(guān)系只表現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子量大小上，因此尿蛋白各組分便可按分子量的大小順序排列在瓊脂糖凝膠上。,> 70 kDa,< 70 kDa,,,,腎單位生理結(jié)構(gòu),,,,,腎小球?yàn)V過(guò)膜,腎小管重吸收,SDS-agarose gel electrophoresis十二烷基磺酸鈉,,,,,SDS,,SDS,,,,

22、,,,,尿蛋白電泳以分子量排列原理,,,,,SDS,,SDS,,+,,-,,,,分子量標(biāo)記 (kDa),14.4,30,43,67,94,,,,,,,,,,,低分子量 (< 70 kDa),高分子量(> 70 kDa),白蛋白,,Hydragel 尿蛋白電泳結(jié)果解釋,分子量標(biāo)記(kDa),14.4,30,43,67,94,白蛋白,,腎小管標(biāo)記,腎小球標(biāo)記,,,,,,,,,,,Hydragel 尿蛋白電泳,溶菌酶,視黃醇

23、結(jié)合蛋白,輕鏈,白蛋白,轉(zhuǎn)鐵蛋白,免疫球蛋白,ß2-微球蛋白,,,,,,,,???微球蛋白,,Ser,Ser,PM,Ser,Ser,腎小球?yàn)V過(guò)功能,低分子量蛋白質(zhì)，小于 70 kDa, 可被濾過(guò)。其他影響每種蛋白質(zhì)濾過(guò)的因數(shù)：形狀，所帶電荷，血漿濃度。濾過(guò)取決于腎動(dòng)力參數(shù)。腎小球?yàn)V過(guò)膜的損害可導(dǎo)致大分子量的蛋白質(zhì)(超過(guò) 70 kDa)漏出。,腎小球性蛋白尿 產(chǎn)生原因,主要是腎小球受到炎癥，毒素等的損害

24、，引起腎小球毛細(xì)血管壁通透性增加，濾出較多的血漿蛋白，超過(guò)了腎小管重吸收能力所形成的蛋白尿。 頻發(fā)于成人及嬰幼兒，一般尿蛋白總量常大于1000mg/天。 常見(jiàn)于腎小球疾病如急性腎小球腎炎，某些繼發(fā)性腎臟病變?nèi)缣悄虿∧I病，免疫復(fù)合物病如紅斑狼瘡性腎病等。,,腎小球損害,> 70 kDa,< 70 kDa,,,,,,,,,白蛋白,,,,,< 70 kDa,> 70 kDa,Ser,電泳圖譜表現(xiàn),表現(xiàn)為漏出性蛋白尿

25、，出現(xiàn)白蛋白及分子量更大的轉(zhuǎn)鐵蛋白，免疫球蛋白，有時(shí)甚至出現(xiàn)α2-巨球蛋白。 分子量越大損傷越嚴(yán)重，這里可以初步估計(jì)出蛋白尿的選擇性，作為判斷腎小球損傷嚴(yán)重程度及腎小球病變預(yù)后評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo) 。,腎小管重吸收,腎小管可重吸收被腎小球?yàn)V出的低分子量蛋白質(zhì) (<70 kDa) 。(active endocytosis) 99%被腎小球?yàn)V出的蛋白質(zhì)可被腎小管重吸收，例如，白蛋白每天可被濾出18 g，但在

26、生理性終末尿中僅 30 mg/天。腎小管損害可減弱對(duì)低分子量蛋白質(zhì) (<70 kDa) 的重吸收。當(dāng)血漿濃度增加超過(guò)腎小管重吸收閾值時(shí)，亦可出現(xiàn)低分子量蛋白質(zhì)。,腎小管性蛋白尿 產(chǎn)生原因,主要是由于炎癥或中毒等因素引起的近曲小管對(duì)低分子量蛋白質(zhì)重吸收功能減退而出現(xiàn)以低分子量蛋白質(zhì)為主的蛋白尿。 一般尿蛋白總量小于500mg/天，持續(xù)時(shí)間短。 常見(jiàn)于腎盂腎炎，間質(zhì)性腎炎，腎小管性酸中毒，重金屬（汞，鎘，鉍

27、）中毒，應(yīng)用慶大霉素，多粘菌素B及腎移植術(shù)后等。,,腎小管損害,> 70 kDa,< 70 kDa,,,,,,,,白蛋白,,,,,< 70 kDa,> 70 kDa,Ser,,,混合損害，以腎小管為主,電泳圖譜表現(xiàn),出現(xiàn)較多的輕鏈二聚體，微球蛋白，游離輕鏈，視黃醇結(jié)合蛋白，溶菌酶，β2微球蛋白等低分子量蛋白質(zhì)，且各蛋白組分所占比例較均一。 其所含濃度越大提示腎小管損傷越嚴(yán)重。嬰幼兒腎小管性蛋白尿以視黃醇結(jié)合蛋

28、白為主，而且尿視黃醇結(jié)合蛋白排泄量升高是較敏感的腎近曲小管損傷的診斷指標(biāo)。,,混合損害,> 70 kDa,< 70 kDa,,,,,,,,,,白蛋白,,,,,< 70 kDa,> 70 kDa,腎前性蛋白尿,主要是由于高血壓，高熱，心臟或肝臟衰竭等造成血中蛋白濃度病理性升高，超過(guò)腎小管重吸收能力時(shí)所排出的包含各種特殊蛋白成分。原因游離輕鏈，見(jiàn)于多發(fā)性骨髓瘤ß 2 微球蛋白，見(jiàn)于淋巴組織增生綜合征

29、溶菌酶，見(jiàn)于部分急性粒細(xì)胞白血病血紅蛋白，見(jiàn)于溶血性疾病α 1酸性糖蛋白,見(jiàn)于支氣管肺癌肌紅蛋白，見(jiàn)于橫紋肌分解這些原因亦可導(dǎo)致腎臟病變 (有游離輕鏈時(shí)，可見(jiàn)特征性 Bence-Jones [本-周氏]蛋白),,腎前性蛋白尿（溢出性蛋白尿）,> 70 kDa,< 70 kDa,,,,,,,,,,,,,,,,,白蛋白,,,,,< 70 kDa,> 70 kDa,2號(hào)標(biāo)本 經(jīng)BME處理后,,圖譜表現(xiàn),在電

30、泳圖譜中表現(xiàn)為溢出性蛋白尿，可在小分子區(qū)發(fā)現(xiàn)少量的深染條帶注意要與腎小管損傷性蛋白尿區(qū)分。 如多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫病及其他原因?qū)е碌牧馨拖到y(tǒng)病理性增殖，其電泳圖譜與腎小管損傷性蛋白尿的主要區(qū)別在于本周氏蛋白譜帶單一，各帶含量大小很不均勻，自由輕鏈或輕鏈二聚體所占比例大于總量的30%；而腎小管損傷性蛋白尿，分子量小于白蛋白的各小分子量蛋白帶出現(xiàn)較多，且各蛋白組分所占比例較均一。 溢出性血

31、（肌）紅蛋白尿與腎小管損傷性蛋白尿的鑒別與本周氏蛋白尿相似，只是具體譜帶位置不一樣而已。,腎后性蛋白尿,非腎損傷性情況下終尿中混入腎以下泌尿、生殖系血液成分、細(xì)菌菌體蛋白和毒素等蛋白質(zhì)而引起的蛋白尿。 常見(jiàn)于腎盂，輸尿管，膀胱，尿道的炎癥，腫瘤，結(jié)石。,圖譜表現(xiàn),細(xì)菌菌體蛋白和毒素在電泳實(shí)驗(yàn)中因其蛋白分子量及所帶電荷與人體蛋白差異較大，在特定的實(shí)驗(yàn)條件下常不出現(xiàn)于電泳板的蛋白譜帶可視范圍內(nèi)其鑒別關(guān)鍵在于將混入尿內(nèi)的血液成分蛋白定性且