胰腺癌雙向凝膠電泳技術(shù)平臺的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)以其高通量等優(yōu)勢為我們探尋基因功能的奧秘提供了一種新的思路和研究手段。蛋白質(zhì)組研究在特定事件或環(huán)境下某個細胞或某種組織的基因組表達的全部蛋白質(zhì)，旨在列出全部蛋白質(zhì)的細目，弄清楚每一個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能及蛋白質(zhì)群體內(nèi)的相互作用，對比疾病和健康狀態(tài)下它們的表達水平的變化。每一種生命運動形式都是特定蛋白質(zhì)群體在不同時間和空間出現(xiàn)并發(fā)揮功能的結(jié)果，因而蛋白質(zhì)組研究是我們理解細胞功能和疾病發(fā)生、發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)。 雙向凝膠電泳

2、技術(shù)自其誕生起已被廣泛的應(yīng)用于分析細胞、組織、體液中蛋白質(zhì)的組成，以及分離蛋白質(zhì)復(fù)合物，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用和代謝過程。其原理是第一向基于蛋白質(zhì)等電點的不同，用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同，用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜的蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。隨著技術(shù)的日新月異，雙向電泳技術(shù)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要支撐技術(shù)之一，在尋找腫瘤標(biāo)志物方面具有重要意義。 由于胰腺位置隱蔽，胰腺癌臨床癥狀不典型，同時

3、又缺少敏感和特異性的診斷指標(biāo)，導(dǎo)致胰腺疾病胰腺癌的早期診斷極為困難，已嚴(yán)重威脅人類的健康和生命。因此，發(fā)現(xiàn)新的敏感和特異性的胰腺癌標(biāo)記物進行早期腫瘤的篩查，發(fā)現(xiàn)新的有效的治療性分子靶點，成為當(dāng)前胰腺癌研究的主要方向。 本文從三個方面分別探討了雙向凝膠電泳技術(shù)平臺的建立，以及雙向電泳在胰腺癌研究中的初步應(yīng)用等問題。 第一部分：雙向凝膠電泳技術(shù)體系的建立 目的：建立起適用于細胞、組織、體液、血清等多種樣品的雙向凝膠電

4、泳技術(shù)平臺，并進行部分拓展實驗。 方法：通過對多種樣品的預(yù)處理實驗、雙向電泳和后續(xù)分析鑒定的流程進行了優(yōu)化，建立了一套較為標(biāo)準(zhǔn)化的基于雙向電泳的蛋白質(zhì)組實驗方案。對常規(guī)雙向電泳技術(shù)進行了拓展，嘗試了一種多根IPG膠條在一塊凝膠上進行SDS-PAGE方法。并對差異凝膠電泳的條件進行了初步摸索。 結(jié)果：建立起適用于細胞、組織、體液、血清等多種樣品的雙向凝膠電泳技術(shù)體系。能夠有效去除大多數(shù)電泳干擾物質(zhì)，提高蛋白的抽提率，并可以

5、有效的提高電泳的分辨率和重現(xiàn)性。 結(jié)論：通過對雙向電泳各步驟的實驗探討和優(yōu)化，建立起適合于分析細胞、組織、體液、血清等多種樣品的雙向電泳流程，為進一步開展基于雙向電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分：利用雙向電泳技術(shù)構(gòu)建人正常胰液蛋白表達譜 目的：建立并優(yōu)化人胰液蛋白質(zhì)組的雙向凝膠電泳分離方法。 方法：通過比較幾種常用的體液處理方法，確定了一種適于人胰液的蛋白樣品處理方法。經(jīng)過一維等電聚焦和二維SD

6、S-PAGE電泳后，有效分離了人胰液蛋白質(zhì)組。 結(jié)果：通過優(yōu)化胰液蛋白質(zhì)提取、上樣量和固相IPG膠條分離范圍的選擇等步驟，建立了人胰液雙向凝膠電泳的方法，并獲得了分辨率較高、重復(fù)性較好的雙向凝膠電泳圖譜。 結(jié)論：丙酮沉淀與雙向凝膠電泳技術(shù)的結(jié)合是研究人胰液蛋白質(zhì)組的一種有效的方法。胰液雙向凝膠電泳方法的優(yōu)化可為今后開展疾病相關(guān)的胰液蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。 第三部分：利用雙向凝膠電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)胰腺癌與正常胰腺組

7、織的差異表達蛋白。 目的：分析并發(fā)現(xiàn)胰腺癌與正常胰腺組織的差異表達蛋白。 方法：結(jié)合雙向凝膠電泳和基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)等蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)研究了八對胰腺導(dǎo)管癌(PDAC)及相應(yīng)正常胰腺組織樣品。 結(jié)果：獲得了分辨率較高、重復(fù)性較好的雙向凝膠電泳圖譜；發(fā)現(xiàn)了48種差異表達蛋白質(zhì)——其中36種蛋白質(zhì)在PDAC明顯表達上調(diào)，12種蛋白質(zhì)在PDAC中明顯表達下調(diào)。其中18種蛋白已經(jīng)被報道