免疫熒光檢查

1、,歡迎各位同仁,光 臨,,,免疫熒光技術在某些皮膚病中 的 應 用主講人：周桂芝,概 述,抗原與相應的抗體接觸后，立即結合而形成不易分離的抗原抗體復合物。在結合之前，先使抗體（或抗原）與某些顯色劑偶聯(lián)，則形成的抗原抗體復合物由不可見成為可見，從而可以確定組織中是否存在某種抗原（或抗體），這就是免疫病理技術的基本原理。根據抗體（或抗原）標記物的不同分為免疫熒光技術和免疫酶標技術。,免疫熒光技術的發(fā)展,· 1941年

2、由Coons首先建立了免疫熒光技術 · 1961年 由Kaskin首先將該技術應用到皮膚科 · 1963年 Burnham等報告了紅斑狼瘡病人表皮、 真皮間基底膜IgG、C3沉積 · 1964年 Beutner和Jordon利用免疫熒光技術研究天皰瘡 · 1967年 區(qū)分出大皰性類天皰瘡 · 70年代開始應用免疫電鏡去認識大皰性皮膚病,,近來，皮膚病理工作者應

3、用免疫熒光技術對大皰性皮膚病、紅斑狼瘡、扁平苔癬、銀屑病、皮膚血管炎等免疫病理特征進行了研究，并已廣泛應用于常規(guī)病理診斷、鑒別診斷及指導治療。,,缺點：（1）標記的熒光極易褪色，不能長久保存。（2）影響熒光強度的因素很多，而且判斷陽性熒光與非特異性熒光有一定的主觀性。（3）陽性熒光細胞無法與常規(guī)石臘切片對照觀察，組織學定位困難。（4）需要較好的冰凍切片機和熒光顯微鏡等，因此它的應用受到一定的限制。,免疫熒光技術,（一）原理：

4、 將熒光色素（異硫氰酸熒光素）與特異性抗體以化學的方法結合起來，即為熒光抗體，再用這種熒光抗體作為一種試劑，在特定的條件下浸染標本，與標本中相應的抗原結合。在組織中形成含有熒光標記的抗體—抗原復合物，再用熒光顯微鏡觀察標本。,,（二）方法： 1、直接法（DIF）：用熒光素標記的特異性抗體來檢查未知抗原。如組織中存有相應的抗原，便結合，形成復合物。

5、 抗原 標記抗體 玻片 標記抗原抗體復合物,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,優(yōu)點：（1）方法簡單，需時短。（2）特異性強。 缺點：（1）不能用

6、已知抗原檢查未知抗體。（2）為了檢查各種抗原，需要準備多種特異性熒光抗體。（3）敏感性較差。,,2、間接法（IIF）：用熒光標記的抗體來檢查未知抗原或未知抗體。 抗原 抗原抗體

7、 復合物 未標記抗體 玻片 抗原抗體復合物 標記抗體 雙抗體復合物,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

8、,,,,,,,,優(yōu)點：（1）既能檢查未知抗原，也能檢查未知抗體。（2）用一種標記抗體，能檢查多種抗體復合物。（3）敏感性高。 缺點：（1）由于參加的因素多，受干擾的機會也多，故結果有時判斷困難。（2）方法較麻煩，時間較長。,,3、補體熒光抗體法：用熒光素標記的抗補體抗體檢測未知抗原或未知抗體。

9、 抗原+抗體 +補體

10、 復合物 抗原 抗體 補體 抗原+抗體+補體復合物 抗補體標記抗體 熒光標記補體復合物,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,優(yōu)點：

11、 具有間接法的一些優(yōu)點。缺點： 非特異性熒光更多。,在皮膚病中的應用,免疫熒光檢查，對某些皮膚病已成為一種極重要的臨床和組織學檢查的補充方法，既能檢查血清，又能檢查活體標本。,（一）標本,1、血清標本：取血2ml，不加抗凝劑，室溫下放置片刻，凝固 離心 分離出血清 冷凍保存。 2、皮膚活檢標本：進行皮膚活檢時，其所取標本部位的選擇十分重要，直接關系到免疫病理的結果如何。,

12、,,,,皮膚病免疫熒光,,,,,（二）皮膚病,1、紅斑狼瘡：在目前紅斑狼瘡的診斷和研究中，直接免疫熒光（DIF）已成為一種重要的手段。 （1）狼瘡帶試驗（LBT）：用直接免疫熒光法來確定DLE皮損，SLE皮損及正常皮膚的表皮、真皮交界處免疫球蛋白和補體的沉積。一般沉積抗體是以IgM、IgG、C3為主，IgA少，呈線狀或帶狀或顆粒狀。有時真皮內血管壁上可有IgG、IgM沉積。,（2）LBT診斷價值：,①LBT是診斷LE的重要檢測方

13、法，具很高的特異性，SLE皮損部位LBT陽性率為90%，未受累皮膚為54%，DLE皮損處為90%。如果LBT（+）可以確診LE，因此能將臨床上與LE相似的其他皮膚病鑒別。但是LBT（-）也不能排除LE，因LE患者的LBT不是百分之百的陽性。,,②LBT可用于SLE與DLE的鑒別診斷。 ③對無皮損的SLE，LBT有助于診斷。 ④LBT對SLE與其他抗核抗體陽性疾病作鑒別時，具有參考價值。 ⑤狼瘡帶假陽性。,,狼瘡帶對治療

14、敏感，經大約6個月治療后，LBT可轉變?yōu)殛幮裕ㄑ獌瓤贵w陰轉可很快，但皮損內抗體消失慢），SLE病情加重LBT由陰性轉為陽性。（Ig沉積在基底細胞的半橋粒、基底板內及真皮內的纖維成份中）,,2、天皰瘡： DIF 患者幾乎百分之百均可查到表皮細胞間抗體，呈魚網狀沉積，主要為IgG，約30—50%病人可有IgM、IgA。未治療的病人伴C3。紅斑型天皰瘡除了在表皮出現(xiàn)細胞間IgG抗體外，23-80%的病人伴有基底膜抗體沉積。

15、,,IIF 查病人血清，約80—90%天皰瘡病人有循環(huán)的抗表皮細胞間抗體，主要是IgG。病人血清中抗細胞間抗體的滴度與病情的活動性有密切關系?？贵w滴度1:20—1:40為低滴度，1:80—1:160為中等滴度，1:320以上為高滴度。應每2-3周做一次IIF，直至病情減輕，以后每3—6個月復查一次。,,IgA天皰瘡： 為表皮內嗜中性細胞增多，臨床表現(xiàn)為角層下膿皰病樣皮膚病和皰疹樣天皰瘡，免疫病理為表皮細胞間IgA沉

16、積，少數病人伴IgG、C3沉積。僅為細胞間IgA沉積或主要為IgA，那么IgA天皰瘡診斷成立。50%的病人有循環(huán)IgA抗體結合在表皮細胞間，但滴度低。,,副腫瘤型天皰瘡： 伴惡性疾病特征，常伴腫瘤為非何杰金氏淋巴瘤，慢性淋巴細胞白血病、腸腺瘤等，皮損為多形性瘙癢性丘疹、鱗屑，水皰，有時似多形紅斑，組織學為表皮基底層上棘層松懈，角質形成細胞壞死，角化不良，表現(xiàn)為天皰瘡和多形紅斑的特征，DIF 細胞間Ig

17、G+，伴有或不伴有C3沉積，同時基底膜有C3或IgG沉積。IIF 有抗表皮細胞間抗體和抗基底膜抗體。,,3、大皰性類天皰瘡（BP） DIF 在皮損周圍的皮膚基底膜有線狀IgG（95%），C3（100%）沉積，陽性率為95%--100%。少數病人可有IgM沉積。（沉積在透明板和基底細胞下方） IIF 約70—80%病人血清中有IgG抗基底膜循環(huán)抗體。抗體滴度與病情活動性之間似無明顯關系。,,4、&

18、#160; 皰疹樣皮炎（DH） DIF 非受損皮膚真皮乳頭部有顆粒狀IgA沉積。陽性率為95%，抗體沉積最常見為顆粒型，而連續(xù)線型少見。個別病人除IgA沉積外還伴有C3沉積。（顆粒狀IgA沉積在真皮乳頭彈力纖維原纖維） IIF 循環(huán)抗基底膜抗體陰性?？蛊交〖饶gA循環(huán)抗體陽性（80%）。,,5、 線狀IgA大皰性皮?。↙ABD） DIF IgA在基底膜呈線狀沉積，陽性率1

19、00%，1/3病人可有IgM、C3沉積。 IIF 約7—33%病人血清中有循環(huán)抗體IgA，抗原為97KD（沉積在致密板的兩側，即透明層和致密板下區(qū)）,,6、  妊娠皰疹（HG） 為在妊娠期出現(xiàn)的特殊類型的大皰性類天皰瘡。 DIF 基底膜C3線狀沉積，陽性率100%，約30—50%病人也可伴有基底膜IgG線狀沉積。（沉積在透明層） IIF 未查到循環(huán)抗體。

20、,,7、獲得性大皰性表皮松懈癥（EBA） DIF 基底膜IgG、C3沉積,陽性率100%,少數伴IgA、IgM沉積(沉積在透明層) IIF 循環(huán)抗基底膜IgG抗體陽性率25—60%。(沉積在基底板下),,,幾種大皰性皮膚病的鑒別診斷,1、BP與EBA鑒別：（1） 臨床特征（2）免疫電鏡和免疫印跡 （3）鹽分離皮膚法：①鹽分離正常皮膚作底物，IIF，EBA抗體與真皮側起反應，BP抗體與表皮側

21、起反應。 ② 鹽分離損害周圍皮膚，DIF,,2、BP與HG鑒別： BP，70%IIF可查到IgG抗基底膜循環(huán)抗體，而大多數HG病人查不到循環(huán)抗體，HG病人血清含補體結合的循環(huán)抗BMZ抗體（又稱HG因子），用IIF很難檢出。,,3、線狀IgA大皰性皮膚病與DH鑒別： 線狀IgA大皰性皮膚病，DIF檢查基底膜處IgA線狀沉積，循環(huán)抗體為IgA，而DH是真皮乳頭顆粒狀IgA沉積。,大皰性皮膚病抗體沉積部位

22、超微結構圖,圖1、正常表皮基底膜超微結構,圖2、表皮基底膜顯示自身抗體結合部位的超微結構,,,圖3、 大皰性皮膚病自身抗體沉積部位及抗原分子量,圖4、尋常型天皰瘡(DIF),,圖5、尋常型天皰瘡(IIF),,圖6、IgA天皰瘡(DIF),,圖7、大皰性類天皰瘡(DIF) IgG沉積,,圖8、大皰性類天皰瘡(DIF) C3沉積,,圖9、線狀IgA大皰性皮膚病(DIF) IgA沉積,,圖10、獲得

23、性大皰性表皮松懈癥鹽分離正常皮膚(IIF) IgG沉積在真皮側,,圖11、大皰性類天皰瘡鹽分離正常皮膚(IIF) IgG沉積在表皮側,,圖12、紅斑狼瘡(DIF) IgM帶狀沉積,,少見大皰性皮膚病例介紹,例1患者 女 43歲，干部 口腔潰瘍，疼痛3個月。 口腔雙側頰粘膜后側及舌左側緣表淺潰瘍，左側頰粘膜潰瘍約0.5×0.3cm，未見水皰。,圖13,,圖14,,圖15,,例2,患者

24、 男 21歲 農民主訴：全身反復起水皰3年，復發(fā)加重1個月現(xiàn)病史：3年前雙足起水皰，易破潰，3天后泛發(fā)全身，用激素治療后消退，但停藥后復發(fā)，反復治療達2年余，至5個月前停藥，又復發(fā)，收入院治療。皮膚科檢查：四肢軀干廣泛密集分布豆大丘疹，水皰，皰壁緊張，尼氏征（-），頭皮散在淡紅色斑塊，軀干散在大小不一淡白色斑片，口腔粘膜（-）。病理檢查：表皮下水皰，皰底真皮淺層散在嗜酸性粒細胞。膠原纖維水腫，血管擴張。 DI

25、F 表皮基底膜IgG、C3強陽性沉積，IgM、IgA弱陽性。,圖16,,圖17,,圖18,,圖19,,圖20,,圖21,,圖22,,參 考 文 獻,1、Inter J Dermatol 1993;32(3):153-1612、Dermatologic cinic 1994;12(1):133-1423、Dermatologic cinic 1993;11(3):399-4184、J of Cutan Pathol 19