免疫熒光雙標(biāo)法應(yīng)用于小鼠表皮干細胞分子標(biāo)記的篩選.pdf

1、研究背景：
　　 皮膚是人體最大的組織器官，它有很強的自我更新能力和損傷后修復(fù)能力，其關(guān)鍵就在于表皮干細胞(epidermal stem cells，ESCs)的存在。此外，已有研究證明表皮干細胞對腫瘤的發(fā)生起始和基因治療有著靶向作用，并可能成為腫瘤治療的關(guān)鍵。因此，表皮干細胞一直是近年來研究的熱點。而如何從皮膚組織中將表皮干細胞進行分離、純化和培養(yǎng)，是進行表皮干細胞研究的最基本條件。目前學(xué)術(shù)界仍沒有公認(rèn)的表皮干細胞特異性標(biāo)記物

2、，因此其表面分子標(biāo)記物的確定是一個必要而且關(guān)鍵的研究環(huán)節(jié)。標(biāo)記滯留細胞(label retaining cell，LRCs)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種鑒定成體干細胞及其定位的方法：其原理就是選取5-溴，2-脫氧尿嘧啶（5-bromodeoxyuridine，BrdU）作為示蹤劑，利用其可與內(nèi)源性胸腺嘧啶核苷競爭摻入S期（DNA合成期）單鏈DNA核苷酸序列中的特點，通過皮下或腹腔注射的方法，引入外源性特異抗原BrdU，在組織增殖期將Brd

3、U標(biāo)記到細胞中。由于成體干細胞有慢細胞周期、半保留復(fù)制以及不對稱分裂等特點，通過利用特異性的抗BrdU抗體，檢測到的BrdU陽性細胞就是標(biāo)記滯留細胞。有研究已經(jīng)證實，這些標(biāo)記滯留細胞就是表皮干細胞。
　　 目的：用標(biāo)記滯留細胞(LRCs)以及免疫熒光雙標(biāo)記方法進行小鼠表皮干細胞(ESCs)可靠分子標(biāo)記的篩選，為進一步分離和研究表皮干細胞提供線索和基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、選擇出生5d的昆明小乳鼠進行腹腔注射

4、5-溴，2-脫氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine，BrdU)，隔日注射，連續(xù)7d。
　　 2、于注射后7d、30d、60d、90d殺死小鼠并褪毛，取下老鼠背部皮膚，保存于液氮罐中。
　　 3、將標(biāo)本制成冰凍切片及石蠟切片。
　　 4、在注射后7d、30d、60d、90d的石蠟切片上進行BrdU染色。
　　 5、選取注射后第90天的冰凍切片，分別進行BrdU與整合素β1、P63和CD34的雙重

5、免疫熒光標(biāo)記，觀察這些標(biāo)記物與BrdU的符合度。
　　 6、在熒光顯微鏡下(200×)隨機選取視野，觀察每組標(biāo)本中的隨機10個視野并計數(shù)其中的陽性細胞數(shù)，最后計算出每組標(biāo)本平均陽性細胞數(shù)目及平均陽性細胞百分比。
　　 結(jié)果：
　　 1、隨著注射BrdU時間的延長，石蠟切片中BrdU陽性細胞數(shù)逐漸減少，但減少到90天后就維持在一個相對穩(wěn)定的數(shù)量不再減少。90天后的石蠟切片免疫組化結(jié)果顯示：有少數(shù)陽性細胞存在于小鼠皮

6、膚上皮細胞中，這些陽性細胞主要位于毛囊的隆突部位，皮膚基底層中也有少數(shù)陽性細胞散落。
　　 2、免疫熒光雙標(biāo)的結(jié)果顯示：Brdu與整合素β1雙標(biāo)陽性的細胞占所有整合素β1陽性細胞的81％，占所有Brdu陽性細胞的94％；Brdu與P63雙標(biāo)陽性的細胞占所有P63陽性細胞的65％，占所有Brdu陽性細胞的86％；Brdu與CD34雙標(biāo)陽性的細胞占所有CD34陽性細胞的30％，占所有Brdu陽性細胞的62％。
　　 結(jié)論：<