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1、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法一、標(biāo)本制作一、標(biāo)本制作可制作涂片、印片、細(xì)胞單層培養(yǎng)物、組織切片,經(jīng)適當(dāng)固定或不固定,作免疫熒光染色用。二、熒光抗體染色方法二、熒光抗體染色方法(一)直接法1染色切片經(jīng)固定后,滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)如1:8或1:16的熒光抗體(如兔抗人γ球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等),在室溫或37℃染色30min,切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi),防止干燥。2洗片傾去存留的熒光抗體,將切片浸入pH7.4或pH7.2
2、PBS中洗兩次,攪拌,每次5min,再用蒸餾水洗1min,除去鹽結(jié)晶。3用50%緩沖(0.5molL碳酸鹽緩沖液pH9.0~9.5)甘油封固、鏡檢4對(duì)照染色①正常免熒光血清染色,如上法處理切片,結(jié)果應(yīng)為陰性。②染色抑制試驗(yàn)(一步法):將熒光抗體和未標(biāo)記的抗體球蛋白或血清(相同)等量混合,如上法處理切片。結(jié)果應(yīng)為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致,可用鹽水代替未標(biāo)記抗血清,染色結(jié)果應(yīng)為陽性。此法結(jié)果較二步法穩(wěn)定。③類屬抗原
3、染色試驗(yàn),前面已作敘述。直接法比較簡單,適合做細(xì)菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)的抗原,特異性高而敏感性較低。(二)間接法(1)切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的濕度,37℃作用30min。然后用0.01mollpH7.2PBS洗兩次,10min,用吸水吸去或吹干余留的液體。(2)補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作1:10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)
4、合反應(yīng)試管法所測(cè)定的結(jié)果,按2單位的比例,用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法:即在pH7.4、0.1molL的磷酸緩沖鹽水中,溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。(3)抗補(bǔ)體熒光抗體:在免疫血清效價(jià)為1:4,補(bǔ)體為2單位的條件下,用補(bǔ)體染色法測(cè)定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià),然后按染色效價(jià)1:4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。2方法步驟(1)涂片或切片固定。(2)吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋之免疫血清及補(bǔ)體之等量混合液(此
5、時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都稀釋一倍)滴于切片上,37℃作用30min,置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。(3)用緩沖鹽水洗2次,攪拌,每次5min,吸干標(biāo)本周圍水液。(4)滴加經(jīng)過適當(dāng)稀釋之抗補(bǔ)體熒光抗體30min,37℃,水洗同(3)。(5)蒸餾水洗1min,緩沖甘油封固。3對(duì)照染色(1)抗原對(duì)照。(2)抗血清對(duì)照:用正常兔血清代替免疫血清。(3)滅活補(bǔ)體對(duì)照:將補(bǔ)體經(jīng)56℃30min處理后,按補(bǔ)體同樣比例稀釋,與免疫血清等量混合后,進(jìn)行補(bǔ)體法染
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