發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌

1、1,第三章 發(fā)酵工業(yè)原料及其處理,第一節(jié) 培養(yǎng)基的成分及來源第二節(jié) 培養(yǎng)基的類型及選擇第三節(jié) 淀粉水解糖的制備第四節(jié) 發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌,2,1、培養(yǎng)基如何分類？ 在發(fā)酵生產(chǎn)中常用的固體還是液體培養(yǎng)基？2、說說培養(yǎng)基的六大營養(yǎng)要素？,復(fù)習(xí),根據(jù)培養(yǎng)基的用途(特殊用途)不同，可將培養(yǎng)基分成：孢子\種子\發(fā)酵 增殖、選擇和鑒別培養(yǎng)基,根據(jù)培養(yǎng)基狀態(tài)不同，可將培養(yǎng)基分成： 固體、液體和

2、半固體培養(yǎng)基,根據(jù)營養(yǎng)物質(zhì)的來源不同，培養(yǎng)基可分為： 天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基,3,1、由于雜菌的污染，使生物反應(yīng)中的基質(zhì)或產(chǎn)物因雜菌的消耗而損失，造成生產(chǎn)能力的下降； 2、由于雜菌所產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物，或在染菌后改變了培養(yǎng)液的某些理化性質(zhì)，使產(chǎn)物 的提取和分離變得困難，造成收率降低或使產(chǎn)品的質(zhì)量下降；3、雜菌會(huì)大量繁殖，會(huì)改變反應(yīng)介質(zhì)的PH值，從而使生物反應(yīng)發(fā)生異常變化；4、雜菌可能會(huì)分解產(chǎn)物，從而使

3、生產(chǎn)過程失??；5、發(fā)生噬菌體污染，微生物細(xì)胞被裂解，而使生產(chǎn)失敗，等等,在發(fā)酵生產(chǎn)中，為什么要進(jìn)行滅菌操作？,問題1,4,為防止雜菌的污染，整個(gè)生化生產(chǎn)過程哪些需要注意滅菌？,培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備、空氣、菌種制作,問題2,滅菌的定義滅菌利用物理和化學(xué)的方法殺滅或除去物料及設(shè)備中一切生命物質(zhì)的過程。消毒是指用物理或化學(xué)的方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物，一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死芽孢。,5,發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌,一、滅菌的原理和

4、方法二、濕熱滅菌原理三、培養(yǎng)基的濕熱滅菌方式四、滅菌時(shí)間計(jì)算與影響因素,6,消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中均有廣泛應(yīng)用。 消毒是指用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽孢。例如，用于消牛奶、啤酒和釀酒原汁等的巴氏消毒法，是將物料加熱至60℃維持30min，以殺死不耐高溫的物料中的微生物營養(yǎng)細(xì)胞。 滅菌是用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢

5、子。 消毒不一定能達(dá)到滅菌要求，而滅菌則可達(dá)到消毒的目的,消毒與滅菌的區(qū)別,7,一、滅菌的原理和方法,（一）化學(xué)試劑滅菌法,（二）射線滅菌法,（三）干熱滅菌法,化學(xué)試劑：甲醛、乙醇或新潔爾滅、高錳酸鉀等 適用范圍：環(huán)境空氣、皮膚及器械的表面消毒,電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)適用范圍：無菌室、接種箱,常用烘箱，滅菌條件為在160℃下保溫1h 適用范圍：金屬或玻璃器皿,8,◎常用化學(xué)消毒劑及其使用方法,9,◎. 電磁波、射線滅菌

6、法.,原理：利用高能電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子可以起到滅菌的作用。 波長在(2.1-3.1) ×10-7 m的紫外線 表面或空氣滅菌。 波長在(0.06-1.4) ×10-7 m的 X 射線/γ射線(Co60) 在 工業(yè)上還少采用。,,穿透力差,,設(shè)備投資高,10,（四）濕熱滅菌法,（五）過濾除菌法,（六）火焰滅菌法,利用飽和蒸汽進(jìn)行滅菌、條件為：12

7、1℃，30min 。由于蒸汽有很強(qiáng)的穿透力，冷凝時(shí)放出大量的潛熱，來源方便，價(jià)格低廉，滅菌效果好，是目前最基本的適合培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌方法。適用范圍：廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)設(shè)備及培養(yǎng)基的滅菌 。例：高壓滅菌鍋,利用過濾方法阻留微生物 適用范圍：制備無菌空氣,酒精燈火焰 。方法簡單、滅菌徹底，但適用范圍有限適用范圍：接種針、玻璃棒、三角瓶口,11,接種針、試管口皮膚表面無菌室、接種箱培養(yǎng)基的滅菌空氣,過濾除菌法火焰滅菌法濕熱滅

8、菌法射線滅菌法化學(xué)試劑滅菌法,營養(yǎng)細(xì)胞、芽孢、病毒或孢子？,比較各種微生物對熱的抵抗能力大小,滅菌方法連線題,12,二、濕熱滅菌原理,濕熱滅菌原理,滅菌條件,滅菌不利方面,同時(shí)也會(huì)破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，甚至?xí)a(chǎn)生不利于菌體生長的物質(zhì)。因此，在工業(yè)培養(yǎng)過程中，除了盡可能殺死培養(yǎng)基中的雜菌外，還要盡可能減少培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的損失 。,由于蒸汽具有很強(qiáng)的穿透能力，而且在冷凝時(shí)會(huì)放出大量的冷凝熱(潛熱) ，很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺死各種微生

9、物。,121℃，30min。,13,1、衡量熱滅菌指標(biāo),致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時(shí)間：在此溫度下，殺死全部微生物所需要的時(shí)間。熱阻：對熱的抵抗力，指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時(shí)間。相對熱阻：幾種微生物對熱的相對抵抗能力。指微生物在某一特定條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。,14,微生物對熱的抵抗力稱為熱阻（heat resistance）,,15,某些微生物的相對

10、熱阻。,說說芽孢或孢子的熱阻要比營養(yǎng)細(xì)胞的熱阻大的原因？,從表中可看出,16,芽孢或孢子的熱阻要比生長期營養(yǎng)細(xì)胞的熱阻大得多，這是由于芽孢或孢子內(nèi)吡啶二羧酸含量對熱阻的增加有關(guān)。另外，芽孢子中蛋白質(zhì)含水量較營養(yǎng)細(xì)胞低（特別是游離水分少），也是芽孢耐熱強(qiáng)的一個(gè)原因。圖FS7954芽孢桿菌的芽孢在不同溫度下的死亡情況。,,嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線,17,微生物的熱死規(guī)律和影響滅菌的因素,在發(fā)酵工業(yè)中，對培

11、養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌，廣泛使用濕熱滅菌法。工廠里，蒸汽比較容易獲得，控制操作條件方便，是一種簡單而又價(jià)廉、有效的滅菌方法。用濕熱滅菌的方法處理培養(yǎng)基，其加熱受熱時(shí)間與滅菌程度和營養(yǎng)成分的破壞都有關(guān)系。營養(yǎng)成分的減少將影響菌種的培養(yǎng)和產(chǎn)物的生成，所以滅菌程度和營養(yǎng)成分的破壞成為滅菌工作中的主要矛盾，恰當(dāng)掌握加熱受熱時(shí)間是滅菌工作的關(guān)鍵。,受熱時(shí)間如何確定？,18,1、 微生物的死亡速率：對數(shù)殘留定律,微生物受熱死亡的原因，主要是因高溫使微

12、生物體內(nèi)的一些重要蛋白質(zhì)，如酶等，發(fā)生凝固、變性，從而導(dǎo)致微生物無法生存而死亡。微生物受熱而喪失活力，但其物理性質(zhì)不變。,19,在一定溫度下，微生物的受熱死亡遵照分子反應(yīng)速度理論。在滅菌過程中，微生物的死亡速率與任一瞬時(shí)殘存的活菌數(shù)成正比,對數(shù)殘留定律。,數(shù)學(xué)表達(dá)式：,- dN/d? = ?N,N ：培養(yǎng)基中活的微生物個(gè)數(shù)； ? ：時(shí)間（s）; ? ：比死亡速率（s-1） (死亡速率常數(shù))dN/d? ： 微生物的瞬間變化率，即死亡

13、速率,20,若開始滅菌（? = 0）時(shí)，培養(yǎng)基中活的微生物數(shù)為N0,? =( 2.303 logN0/N )/?,- dN/d? = ?N,lnN/N0 = - ??,積分,2.303logN0/N = ??,,or,,21,各種微生物在同樣的溫度下K值是不同的，K值愈小，則此微生物愈耐熱。在121度，枯草桿菌FS5230的K為0.047s-1，梭狀芽孢桿菌PA3679的K值為0.03 s-1 ，請問哪一種微生物更耐熱?,上式是計(jì)算滅

14、菌的基本公式，滅菌速度常數(shù)K是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據(jù)。,? = (2.303 logN0/N) /?,22,可見滅菌時(shí)間取決于污染程度(N0)、滅菌程度（殘留菌數(shù)N）和?值,在培養(yǎng)基中有各種各樣的微生物，不可能逐一加以考慮。一般只考慮芽孢細(xì)菌和細(xì)菌的芽孢數(shù)之和作為計(jì)算依據(jù)。滅菌程度，即殘留菌數(shù)，如果要求完全徹底滅菌，即N = 0，則? 為∞，上式無意義，事實(shí)上也不可能。一般取N = 0.001，即1000次滅菌中有1

15、次失敗。,? = (2.303 logN0/N) /?,23,例：有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，在121溫度下進(jìn)行實(shí)罐滅菌。原污染程度為每1mL有2*105個(gè)耐熱細(xì)菌芽孢，121度時(shí)滅菌速度常數(shù)為1.8min-1。求滅菌失敗機(jī)率為0.001時(shí)所需要的滅菌時(shí)間。,解： N0=40× 106× 2× 105=8× 1012（個(gè)） Ns=0.001（個(gè)）

16、 K= 1.8min-1,24,連續(xù)滅菌（連消）,連續(xù)滅菌的滅菌時(shí)間，仍可用滅菌公式計(jì)算，但培養(yǎng)基中的含菌數(shù)，應(yīng)改為每單位體積(1mL)培養(yǎng)基的含菌數(shù)，則滅菌公式變換為下式,式中 c0—單位體積培養(yǎng)基滅菌前的含菌數(shù)，個(gè)／mL ;cs—單位體積培養(yǎng)基滅菌后的含菌數(shù)，個(gè)／mL。,25,【例】若將上例中的培養(yǎng)基采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為131℃，此溫度下滅菌速率常數(shù)為15min-1，求滅菌所需的維持時(shí)間。解,26,2、

17、滅菌的溫度和時(shí)間,上面說過，當(dāng)培養(yǎng)基被加熱滅菌時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)這樣的矛盾，這就是，加熱時(shí)，微生物固然會(huì)被殺死，但培養(yǎng)基中的有用成分也會(huì)隨之遭到破壞，那么有何良策可以既達(dá)到滅菌要求，同時(shí)又不破壞或盡可能少破壞培養(yǎng)基中的有用成分呢？ 實(shí)踐證明，在高壓加熱的情況下，培養(yǎng)基中的氨基酸和維生素極易被破壞，如在121℃，僅20min，就有59%的賴氨酸和精氨酸及其他堿性氨基酸被破壞，蛋氨酸和色氨酸也有相當(dāng)數(shù)量被破壞。因此，必須選擇一個(gè)既能滿

18、足滅菌需要，又可使培養(yǎng)基的破壞盡可能養(yǎng)活的滅菌工藝條件。,27,微生物的受熱死亡屬于單分子反應(yīng)，其滅菌速率常數(shù)K與溫度之間的關(guān)系可用阿累尼烏斯公式表示：,K—滅菌速度常數(shù)（s-1），也稱反應(yīng)速度常數(shù)或比死亡速度常數(shù).,A — 比例常數(shù) E — 殺死細(xì)菌所需的活化能，(?E) （×4.18 J/mol） T — 絕對溫度，(K)R — 氣體常數(shù)，[1.978×4.18 J/(mol·K)]e —

19、2.71 (exp),28,A ′— 比例常數(shù)；E′ — 分解活化能，(?E′) （×4.18 J/mol）;T — 絕對溫度，(K)R — 氣體常數(shù)，[1.978×4.18 J/(mol·K)]e — 2.71 (exp),,滅菌時(shí)，培養(yǎng)基成分分解速率常數(shù)K`與溫度之間的關(guān)系也可用阿累尼烏斯公式表示：,29,?1= A e,R T1,E,－—,?2= A e,－—,E,R T2,相除取對數(shù)

20、,,ln,?2,,?1,=,E 1 1,R T1 T2,,,－,〔 〕,,在滅菌時(shí)，當(dāng)溫度變化，菌死亡速率常數(shù)?和培養(yǎng)基成分破壞速率常數(shù)?′都變化。溫度由T1升高到T2，?值分別為：,同樣，滅菌時(shí)培養(yǎng)基成分的破壞也可得類似關(guān)系：,ln,?2 ′,?1 ′,,=,〔 〕,R T1 T2,E ′1 1,,,,,30,上面兩式相除，得,31,32,通過實(shí)驗(yàn)

21、測定可知： 滅菌時(shí)殺死微生物的活化能大于培養(yǎng)基成分的破壞活化能值，因此：,結(jié)論1：當(dāng)滅菌溫度上升時(shí)，微生物死亡速率的提高要超過培養(yǎng)基成分的破壞速率的增加。,33,從上述的分析可知，在熱滅菌過程中，同時(shí)會(huì)發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞這兩種過程，且這兩種過程的進(jìn)行速度都隨溫度的升高而加速，但微生物的死亡速率隨溫度的升高更為顯著。因此，可選擇合適的滅菌溫度和時(shí)間來調(diào)和二者之間的矛盾。,再看表滅菌溫度、時(shí)間與營養(yǎng)成分破壞量

22、的關(guān)系（N/No=0.001）,34,由此可見，若要減少營養(yǎng)成分的破壞，可升高溫度滅菌。結(jié)論2：在滅菌時(shí)選擇較高的溫度、較短的時(shí)間，這樣便既可達(dá)到需要的滅菌程度，同時(shí)又可減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失。,問題,滅菌要達(dá)到殺死99.99%的細(xì)菌芽孢，有兩種方法可以采用，一種是118滅菌15min，另一種是128滅菌5min。哪一種方法好，為什么？,答：從理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐都可證明，在滅菌過程中，同時(shí)會(huì)發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞這兩種過程，且

23、這兩種過程的進(jìn)行速度都隨溫度的升高而加速，但微生物的死亡速率隨溫度的升高更為顯著。因此，對于同一滅菌效果，選擇較高的溫度、較短的時(shí)間，這樣便既可達(dá)到需要的滅菌程度，同時(shí)又可減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失。,35,3、影響滅菌的因素,培養(yǎng)基中氫離子濃度對滅菌的影響 培養(yǎng)基中氫離子濃度直接影響滅菌的效果。培養(yǎng)基的 酸堿度越大，所需殺滅微生物的溫度越低。,pH 6.0 ～ 8.0 ，微生物最耐熱；pH ＜6.0 ，氫離子易滲入微生物

24、細(xì)胞內(nèi)，從而改變細(xì)胞的生理反應(yīng)，促使其死亡。所以，培養(yǎng)基pH值愈低，滅菌所需的時(shí)間愈短。,36,微生物細(xì)胞中水分對滅菌的影響細(xì)胞含水越多，蛋白質(zhì)變性的溫度越低微生物細(xì)胞菌齡對滅菌的影響老細(xì)胞水分含量低、低齡細(xì)胞水分含量高培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對滅菌的影響培養(yǎng)基中微生物數(shù)量對滅菌的影響,37,為什么說培養(yǎng)基中脂肪、糖分和蛋白質(zhì)的含量越 高，滅菌溫度就得相應(yīng)高些 ？,問題,問題,滅菌的徹底與否應(yīng)以殺死營養(yǎng)細(xì)胞為準(zhǔn)還是殺死細(xì)菌孢為

25、標(biāo)準(zhǔn)，為什么？,答：培養(yǎng)液中油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)會(huì)增加微生物的耐熱性，高濃度有機(jī)物會(huì)包于細(xì)胞周圍形成一層薄膜，影響熱的傳遞；因此，在固形物含量高的情況下，滅菌溫度可高些。高濃度鹽類、色素能削減其耐熱性 。,38,答：泡沫中的空氣形成隔熱層,使傳熱困難，熱難穿透過去殺滅微生物。因而有時(shí)需要在培養(yǎng)基中加入消泡沫劑以減少泡沫的產(chǎn)生，或適當(dāng)提高滅菌溫度，延長滅菌時(shí)間。,問題,在滅菌過程中，為什么說培養(yǎng)基發(fā)生泡沫對滅菌很不利？,39,問

26、題,答：蒸汽滅菌過程中，溫度的控制是通過控制罐內(nèi)的蒸汽壓力來實(shí)現(xiàn)。壓力表顯示的壓力應(yīng)與罐內(nèi)蒸汽壓力相對應(yīng)，即壓力表的壓力所對應(yīng)的溫度應(yīng)是罐內(nèi)的實(shí)際溫度。但是如果罐內(nèi)空氣排除不完全，壓力表所顯示的壓力就不單是罐內(nèi)蒸汽壓力，還包括了空氣分壓，因此，此時(shí)罐內(nèi)的實(shí)際溫度就低于壓力表顯示壓力所對應(yīng)的溫度，以致造成滅菌溫度不夠而滅菌不徹底,在滅菌過程中，為什么要排除罐內(nèi)空氣？,40,培養(yǎng)基的PH值越低，滅菌所需的時(shí)間就愈短。（ ）,問題判斷,

27、在實(shí)際生產(chǎn)中，不宜采用嚴(yán)重霉腐的腐敗的水質(zhì)，是因?yàn)槠湮⑸飻?shù)量多，影響滅菌效果。（ ）,微生物含水量越多，滅菌時(shí)間就得越長。（ ）,年輕細(xì)胞比年老細(xì)胞更易殺死。（ ）,在滅菌過程中，充分?jǐn)嚢韪欣跍缇?。?）,41,三、生產(chǎn)上培養(yǎng)基的滅菌方法,（一）分批滅菌　　概念：先將輸料管內(nèi)的污水放凈并沖洗干凈將配制好的培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐、種子罐或補(bǔ)料罐，用蒸汽直接加熱，達(dá)到滅菌要求的溫度和壓力后維持一定時(shí)間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫

28、度，這一工藝過程稱分批滅菌（實(shí)罐滅菌）　　優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備要求低，操作簡便　　　　缺點(diǎn)：營養(yǎng)成份有損失　　　　　　　罐利用率低　　　　　　　不能采用高溫快速滅菌工藝,42,43,操作,1、在進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌之前，通常應(yīng)先把發(fā)酵罐的分空氣過濾器滅菌并用無菌空氣吹干。若已先行空罐滅菌，此步可不進(jìn)行,2、預(yù)熱 向夾套或蛇管中通入蒸汽，間接將培養(yǎng)基加熱至70℃左右。作 用： 利于糊化；減少冷凝水的生成；減輕噪音,44,3、開啟蒸汽

29、管，向培養(yǎng)基中通入蒸汽，升溫。4、罐壓達(dá)1kg/cm2 ( 0.1 MPa)時(shí)，按裝在發(fā)酵罐封頭的接種管、補(bǔ)料管、消泡劑管等應(yīng)排汽。5、保溫 調(diào)節(jié)好各進(jìn)汽和排汽閥門，使罐壓和溫度保持在一穩(wěn)定水平，維持一定時(shí)間。,在保溫階段，凡進(jìn)口在培養(yǎng)基液面下的各管道都應(yīng)通入蒸汽；在液面上的其余管道則應(yīng)排放蒸汽，這樣才能保證滅菌徹底，不留死角。,45,6、保溫結(jié)束后，依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥；待罐內(nèi)壓力降至0.5kg/cm2左右時(shí)，向罐內(nèi)通入無菌

30、空氣，向夾套或蛇管中通入冷水，使培養(yǎng)基降至所需溫度。,通入無菌空氣的作用：加速降溫；保持罐內(nèi)正壓,46,事故,2002年9月5日衡陽市某啤酒廠釀造車間一臺(tái)容積100m3的不銹鋼發(fā)酵糖在清洗過程中發(fā)生收縮變形而吸癟，造成直接經(jīng)濟(jì)損失22萬元的重大設(shè)備事故。,47,50m3發(fā)酵罐失穩(wěn)事故分析,1事故情況 1998年安陽市某化工廠車間一臺(tái)50m3發(fā)酵罐在空罐消毒后水冷卻過程中突然失穩(wěn)。無傷亡事故，直接經(jīng)濟(jì)損失20余萬元。2事故原因分

31、析 現(xiàn)場勘察發(fā)現(xiàn)，該罐進(jìn)汽口和出汽門閥門關(guān)閉。冷卻水閥門敞開。這說明，失穩(wěn)是在冷卻過程中發(fā)生的。 許用壓力計(jì)算 100℃以下罐體就會(huì)承受外壓。外壓值等于大氣壓與水的飽和蒸汽壓之差。70℃以下水的飽和蒸汽壓與罐內(nèi)負(fù)壓值見附表。 實(shí)測筒體許用外壓力0.0832MPa。 比較上表不難看出，當(dāng)罐內(nèi)溫度降到60 ℃以下后，罐體失穩(wěn)隨時(shí)都有可能發(fā)生。,48,3、分批滅菌的注意事項(xiàng)1）各路蒸汽進(jìn)口要暢通

32、，防止短路逆流；罐內(nèi)液體翻動(dòng)要?jiǎng)×?，以使罐?nèi)物料達(dá)到均一的滅菌溫度。2）排氣量不宜過大，以節(jié)約蒸汽3）滅菌將要結(jié)束時(shí)，應(yīng)立即引入無菌空氣以保持罐壓，然后開夾套或蛇管冷卻，以避免罐壓迅速下降產(chǎn)生負(fù)壓而吸入外界空氣，或引起發(fā)酵罐破壞。4）在引入無菌空氣前，罐內(nèi)壓力必須低于過濾器壓力，否則培養(yǎng)基將倒流入過濾器。,49,過程包括：升溫、保溫和冷卻等三個(gè)階段。各階段對滅菌的貢獻(xiàn)：20%、75%、5%,0,圖為培養(yǎng)基間歇滅菌過程中的溫度變化

33、情況,50,V = V加熱 + V維持 + V冷卻,RT2 (E –2RT)V 加熱 = ———————— · t 加熱 (T-T0)E2,RT2 (E –2RT)V 冷卻 = ———————— · t 冷卻 (T-T0)E2,51,R ：氣體常數(shù)；= 1. 986 [ 卡/克分子·K]E ：耐熱孢

34、子致死的活化能；= 65000 [卡/克分子]T：滅菌維持溫度； 121℃ （393 K）T0：開始計(jì)算滅菌效果的溫度；100℃ （373 K）,52,例 1）小型發(fā)酵罐在120℃滅菌維持15分鐘，由100℃ （100℃以下滅菌效果不計(jì)）加熱至120℃的時(shí)間為5分鐘，由120℃冷卻到100℃的時(shí)間為3分鐘，計(jì)算總的滅菌時(shí)間。,1.986×3932(65000 – 2×1.986 ×393)V加熱 =

35、 ————————————————× 5 = 1.15 (393-373) × 650002,RT2 (E –2RT)V 加熱 = ———————— · t 加熱 (T-T0)E2,53,1.986×3932(65000 – 2×1.986 ×393)V冷卻 = ———

36、—————————————× 3 = 0. 69 (393-373) × 650002,V = V加熱 + V維持 + V冷卻 = 1.15 + 15 + 0.69 = 16.6 (min),RT2 (E –2RT)V 冷卻 = ———————— · t 冷卻 (T-T0)E2,54,例 ２

37、）　　　如果滅菌條件不變，大罐由100℃加熱到120℃需24分鐘；冷卻至100℃的時(shí)間為16分鐘；求大罐的維持時(shí)間。,1.986×3932(65000 – 1.986 ×393)V加熱＋ V冷卻 = ————————————————× （２４ ＋１６） 　　　　　　 (393-373) × 650002　　　　　　　　　?。剑?２min,

38、則大罐維持時(shí)間　V維持 = V?。╒加熱＋V冷卻）　　　　　　　　　　?。?6.6 – 9.2 = 7.4 min,55,在不同規(guī)模的發(fā)酵罐中達(dá)到同樣滅菌效果所需時(shí)間,發(fā)酵罐規(guī)模（升） １２０℃維持時(shí)間（分） 200 17. 5 500 12. 6

39、 5000 11. 3 50000 8. 8,,,,56,在實(shí)際生產(chǎn)中，也可能遇到所供蒸汽不足、溫度不夠高的情況，這時(shí)可以適當(dāng)延長滅菌時(shí)間。 生產(chǎn)上甚至有100℃蒸煮而達(dá)到徹底滅菌的實(shí)例。如要做固體曲而沒有高溫蒸汽時(shí)，可將原料用100蒸汽蒸30min，殺死其中的營養(yǎng)細(xì)胞，但

40、孢子與細(xì)菌的芽孢沒有被殺死。將蒸過的原料置于室溫下過夜，未被殺死的孢子便發(fā)芽生長，芽孢發(fā)育成營養(yǎng)細(xì)胞，再30min便可殺死。如此連續(xù)反復(fù)進(jìn)行2-3次，亦可達(dá)到徹底滅菌的目的。,從以上分析可知，滅菌過程中加熱和保溫階段的滅菌作用是主要的，而冷卻階段的滅菌作用是次要的，一般很小。此外，還應(yīng)指出的是，應(yīng)當(dāng)避免長時(shí)間的加熱階段，因?yàn)榧訜釙r(shí)間過長，不僅破壞營養(yǎng)物質(zhì)，而且也有可能引起培養(yǎng)液中某些有害物質(zhì)的生成，從而影響培養(yǎng)過程的順利進(jìn)行。,57,5

41、8,問題,在實(shí)際生產(chǎn)中，如果遇到所供蒸汽不足，如何有用100℃蒸煮而達(dá)到徹底滅菌？,家用土蒸鍋對食用菌三級種進(jìn)行滅菌？,59,(二)培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌（連消）,將配置好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置輸送的同時(shí)進(jìn)行加熱、保溫、和冷卻而進(jìn)行滅菌。,60,連續(xù)滅菌時(shí)，培養(yǎng)基可在短時(shí)間內(nèi)加熱到保溫溫度，并且能很快地被冷卻因此可在比間歇滅菌更高的溫度下進(jìn)行滅菌。而由于滅菌溫度很高，保溫時(shí)間就相應(yīng)地可以很短,極有利于減少培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)的破壞。,

42、培養(yǎng)基連續(xù)滅菌過程中的溫度的變化,61,連續(xù)滅菌的基本設(shè)備有哪些 ？,問題,62,●配料預(yù)熱罐：配料罐將培養(yǎng)基預(yù)熱60-70℃，防止培養(yǎng)基在殺菌時(shí)料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲?！襁B消塔（加熱塔）：使高溫蒸汽與培養(yǎng)基迅速接觸混和，使培養(yǎng)基迅速升高到滅菌溫度（126-132 ℃）?！窬S持罐：使培養(yǎng)基在滅菌溫度下保持5-7min，以達(dá)到滅菌的目的； ●冷卻管：將培養(yǎng)基迅速冷卻到40-50 ℃，輸送到滅菌后的發(fā)酵罐內(nèi)。,1、連消

43、塔式滅菌流程,63,發(fā)酵罐,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,蒸汽,蒸汽,冷卻水,無菌培養(yǎng)基,配料罐,泵,加熱塔,維持罐,冷卻管,可在專門的預(yù)熱罐，也可用配料罐兼作溫 度：一般預(yù)熱至70℃左右預(yù)熱的物料用泵泵入連消裝置輸料泵： 常用 旋渦泵、往復(fù)泵、螺桿泵,①預(yù)熱,64,旋渦泵,往復(fù)泵,螺桿泵,65,②加熱,物料泵入加熱器，培養(yǎng)基與蒸汽混合，溫度迅速上升至130～140℃常用連消裝置有三類： 套管式連消器汽液混合

44、式連消器噴射式加熱器,66,套管式連消塔,上疏下密，45°小孔，孔徑6毫米左右培養(yǎng)液流動(dòng)線速度小于0.1m/s ; 在管內(nèi)逗留時(shí)間為15～20秒,67,汽液混合式連消器,68,③保溫,保溫設(shè)備 （維持設(shè)備） 保溫材料包裹兩種形式：罐式；管式,69,維持罐,70,培養(yǎng)基的平均停留時(shí)間,? = V / FM,---平均停留時(shí)間 （s）V--- 維持罐的體積 （ m3）FM --- 培養(yǎng)基的流量 （m3/s）,71,N

45、ote: 培養(yǎng)基在維持罐的流動(dòng)不可能非常均勻，可能產(chǎn)生溝流，造成一部分培養(yǎng)基在罐內(nèi)的停留時(shí)間少于平均值。為保證滅菌徹底，在設(shè)計(jì)罐式維持器時(shí)，通常取平均停留時(shí)間的3～5倍。,經(jīng)驗(yàn)： 在滅菌溫度為130℃時(shí)，實(shí)際平均時(shí)間可取10分鐘；在140℃時(shí)則可取3～4分鐘。,72,管式維持器,在設(shè)計(jì)管式維持設(shè)備時(shí)，須采用停留時(shí)間分布的概念，而不能采用單純的停留時(shí)間。,73,圓管內(nèi)不同流動(dòng)形式流體的速度分布情況,湍流 Vave

46、rage = 0.82 Vmax,活塞流 Vaverage = Vmax,粘滯流 Vaverage = 0.5 Vmax,74,在管式維持器中，若培養(yǎng)基流動(dòng)為活塞流，可根據(jù)維持管的內(nèi)徑、培養(yǎng)基的流量求出管長。,但實(shí)際上培養(yǎng)基不可能呈活塞流，當(dāng)培養(yǎng)基處于粘滯留狀態(tài)時(shí)，管內(nèi)速度呈拋物線，管中心部位的最大流速為平均流速的2倍；若以平均流速確定管長，則會(huì)造成邊緣部分的培養(yǎng)基過熱（加熱過長）。,確定維持管的長度，應(yīng)采用擴(kuò)散模型 ( D

47、ispersion model) . （復(fù)雜，略）,75,④冷卻,噴淋冷卻器板式冷卻器真空冷卻器,76,噴淋冷卻器,結(jié)構(gòu)簡單；廣泛使用,77,噴射加熱-真空冷卻連續(xù)滅菌流程,78,,,,,,,,,,,,,,,噴射加熱連續(xù)滅菌流程,滅菌介質(zhì),原料介質(zhì),蒸汽,T=140度,,,保溫段,真空,流程中采用了蒸汽噴射器，它使培養(yǎng)液與高溫蒸汽直接接觸，從而在短時(shí)間內(nèi)可將培養(yǎng)液急速升溫至預(yù)定的滅菌溫度然后在該溫度下維持一段時(shí)間滅菌，滅菌后的培

48、養(yǎng)基通過一膨脹閥進(jìn)入真空冷卻器急速冷卻，從圖中可以看出，由于該流程中培養(yǎng)基受熱時(shí)間短，營養(yǎng)物質(zhì)的損失也就不很嚴(yán)重，同時(shí)該流程保證了培養(yǎng)基物料先進(jìn)先出，避免了過熱或滅菌不徹底等現(xiàn)象。,2、噴射加熱連續(xù)滅菌流程,79,1 噴嘴 2 吸入口 3 吸入室 4混合噴嘴 5 混合段 6擴(kuò)大管,噴射加熱器,80,81,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,薄板換熱器連續(xù)滅菌流程,進(jìn)料 35℃,100 ℃

49、,120 ℃,維持罐120 ℃,蒸汽147 ℃,120 ℃,55 ℃,出料35 ℃,水20 ℃,31 ℃,流程中采用了薄板換熱器作為培養(yǎng)液的加熱和冷卻器，蒸汽在薄板換熱器的加熱段使培養(yǎng)液的溫度升高，經(jīng)維持段保溫一定時(shí)間后，培養(yǎng)基在薄板換熱器的冷卻段進(jìn)行冷卻，從而使培養(yǎng)基的預(yù)熱、加熱滅菌及冷卻過程可在同一設(shè)備內(nèi)完成。,3.板式換熱式連續(xù)滅菌流程,82,,該流程的加熱和冷卻時(shí)間比噴射加熱連續(xù)滅菌流程要長些，但由于在培養(yǎng)基的預(yù)熱過程同時(shí)也起到

50、了滅菌后培養(yǎng)基的冷卻，因而節(jié)約了蒸汽和冷卻水的用量。,分別說出優(yōu)點(diǎn),83,板式換熱器,體積小，換熱效率高；但流動(dòng)阻力較大,84,板式換熱器,85,板式換熱器原理圖,86,連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)保留較多的營養(yǎng)質(zhì)量容易放大，較易自動(dòng)控制；糖受蒸汽的影響較少；縮短滅菌周期；發(fā)酵罐利用率高，蒸汽負(fù)荷均勻。缺點(diǎn)設(shè)備比較復(fù)雜，投資較大。,87,連消注意事項(xiàng)：1）連消前，應(yīng)先進(jìn)行空罐、維持罐（管）、冷卻系統(tǒng)的滅菌；2）確保管路無滲

51、漏；3）當(dāng)培養(yǎng)基含有較大固體顆?；蛴休^多泡沫時(shí)，采用連消容易發(fā)生滅菌不徹底。,88,連續(xù)滅菌和分批滅菌比較具有很多優(yōu)點(diǎn)，尤其是當(dāng)生產(chǎn)規(guī)模大時(shí)，優(yōu)點(diǎn)更為顯著當(dāng)培養(yǎng)基中含有固體顆?；蚺囵B(yǎng)基有較多泡沫時(shí)，以采用分批滅菌為好，因?yàn)樵谶@種情況下用連續(xù)滅菌容易導(dǎo)致滅菌不徹底。對于容積小的發(fā)酵罐，連續(xù)滅菌的優(yōu)點(diǎn)不明顯，而采用分批滅菌比較方便。,可采用高溫短時(shí)滅菌，培養(yǎng)基受熱時(shí)間短，營養(yǎng)成分破壞少，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)率。發(fā)酵罐利用率高

52、；蒸汽負(fù)荷均衡；采用板式換熱器時(shí)，可節(jié)約大量能量；適宜采用自動(dòng)化控制，勞動(dòng)強(qiáng)度小。,分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較,89,間歇滅菌或連續(xù)滅菌都有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，現(xiàn)比較如下 ：,加熱器、維持罐（管）和冷卻器以及發(fā)酵罐等都應(yīng)先進(jìn)滅菌,由表可見，無論在理論上或者在實(shí)踐上，與間歇滅菌過程相比，連續(xù)滅菌的優(yōu)點(diǎn)十分明顯。因此，連續(xù)滅菌越來越多地被用于培養(yǎng)基的滅菌。,90,四、發(fā)酵設(shè)備滅菌,（1）發(fā)酵罐滅菌（空消） 滅菌壓力：0.

53、147—0.18MPa，45—60min。 注意事項(xiàng)：空消后，先用無菌空氣保壓，滅菌的培養(yǎng) 基、相關(guān)物料輸入罐內(nèi)后，打開冷卻系統(tǒng)進(jìn)行冷卻。,91,（2）附屬設(shè)備的滅菌,分空氣過濾器：發(fā)酵罐滅菌之前滅菌，滅菌后空氣吹干備用。補(bǔ)料系統(tǒng)：根據(jù)補(bǔ)料不同而異。補(bǔ)料管路：與補(bǔ)料罐同時(shí)滅菌，保溫時(shí)間1小時(shí)。消沫劑系統(tǒng)：蒸汽壓力0.15MPa，保溫30分鐘。消沫劑管路：與補(bǔ)料罐同時(shí)滅菌，保溫時(shí)間1小時(shí)。移種管路：蒸汽壓力0