培養(yǎng)基的配制與滅菌

1、實驗一培養(yǎng)基的配制與滅菌,一 實驗?zāi)康?了解培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制過程。了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關(guān)準備工作及操作方法。,二 實驗原理,人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個良好的營養(yǎng)條件。培養(yǎng)基是按照微生物生長發(fā)育的需要，用不同組分的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。,營養(yǎng)六要素,碳源：提供微生物繁殖所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)。用途：糖、蛋白質(zhì)、核酸合成。

2、氮源：提供微生物繁殖所需氮元素的營養(yǎng)物質(zhì)。用途：蛋白質(zhì)、核酸合成。能源：提供微生物生命活動最初能量來源的營養(yǎng)物或輻射能。生長素：微生物生長必需，但又不能自行合成的有機物。無機鹽：提供微生物繁殖所需各種重要元素。水分：水是保證生命活動重要的介質(zhì)。,培養(yǎng)基的種類,據(jù)組成成分可分為: 1. 合成培養(yǎng)基：由各種純化學物質(zhì)按一定比例配制而成。（

3、如葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基、淀粉硝酸鹽培養(yǎng)基等。） 2. 半合成培養(yǎng)基：有一部分純化學物質(zhì)和另一部分天然物質(zhì)配制而成。（如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。） 3. 天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機物配制而成。 （如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。）,

4、,從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為 1. 液體培養(yǎng)基：不加凝固劑（常用凝固劑為瓊脂）的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。 2. 固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入2%左右的凝固劑的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基或農(nóng)副產(chǎn)品培養(yǎng)基。 3. 半固體培

5、養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2-0.5%凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。,按照培養(yǎng)基的用途，可將其分為：,加富培養(yǎng)基：加富培養(yǎng)基是指在普通培養(yǎng)基里加過血、血清、動物（或植物）組織液或其他營養(yǎng)物質(zhì)（或生長因子）的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，用以培養(yǎng)某種或某類營養(yǎng)要求苛刻的異養(yǎng)微生物選擇培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基是根據(jù)某種或某一類群微生物的特殊營養(yǎng)需要或?qū)δ撤N化合物的敏感性不同而設(shè)計出來的一類培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中

6、分離出來。鑒別培養(yǎng)基：普通培養(yǎng)基中加入能與某種代謝產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)的指示劑或化學藥品，從而產(chǎn)生某種明顯的特征性變化，以區(qū)別不同的微生物,,配制培養(yǎng)的各類營養(yǎng)物質(zhì)和容器等含有各種微生物 微生物生長繁殖： 消耗養(yǎng)分 改變培養(yǎng)的酸堿度 產(chǎn)生毒素或者抑制物,培養(yǎng)基滅菌,滅菌方法,加熱滅菌干熱滅菌濕熱滅菌 過濾除菌 輻射滅菌放射線輻照滅菌紫外線滅菌 化學藥品滅菌,加熱滅菌——干熱滅菌,干熱滅菌是利用

7、高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高（160～170℃），時間要長（1～2h），但干熱滅菌溫度不能超過180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。,濕熱滅菌,高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間

8、的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。,在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大，三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，

9、從而增加滅菌效力。,1g水在100℃時，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時可放出2.26kJ(千焦)的熱量。,,因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓，所以，當水蒸氣中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。,,,一般培養(yǎng)基用0.1Mpa，121.5℃,15～30min可達到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。,過濾除菌,不能用加熱滅菌的液體物質(zhì)（如維生素、血清），一般可用細菌過濾器進行除菌

10、。,紫外線滅菌法,紫外線滅菌是用紫外線燈進行的。波長為200-300nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。紫外線殺菌機理主要是因為它誘導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成過氧化氫（H2O2）。O3和H2O2均有殺菌作用。紫外線穿透力

11、不大，所以，只適用于無菌室，接種箱，手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。紫外線燈距照射物以不超過1.2m為宜。,,為了加強紫外線滅菌效果，在打開紫外燈以前；可在無菌室內(nèi)(或接種箱內(nèi))噴灑3%～5%石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細菌。無菌室內(nèi)的桌面、凳子可用2%～3%的來蘇爾擦洗，然后再開紫外燈照射，即可增強殺菌效果，達到滅菌目的。,,,化學藥品滅菌,微生物實驗室中常用的化學殺菌劑有升汞、甲醛、高錳

12、酸鉀、酒精、碘酒、龍膽紫、石炭酸、漂白粉、新潔爾滅、煤酚皂溶液，它們有的是殺菌劑，有的是抑菌劑。,三 實驗材料,藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O等。高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫干熱滅菌箱、超凈工作臺。其它：天平、牛角匙、電爐、1MHCl、1MNaOH、pH試紙、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、玻璃珠、三角瓶、帶塞子的無菌試管、無棉塞的空試管、培養(yǎng)皿

13、、吸管、各種包裝紙、防水紙、標簽等。,四 實驗步驟,6. 加塞7. 包扎8. 滅菌9. 擱置斜面10. 無菌檢查,稱量溶化調(diào)pH過濾分裝,,稱量：按照配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，加熱溶解。調(diào)pH值：用1MNaOH或1MHCl調(diào)pH，用pH試紙對照。加瓊脂溶化：加熱過程中要不斷攪拌，可適當補水。分裝：注意不要污染棉塞。包扎成捆，掛上標簽（必須用鉛筆寫

14、），注明何種培養(yǎng)基。滅菌備用：培養(yǎng)基滅菌后必須在370C下恒溫培養(yǎng)24h，確定無菌生長，方可使用。,幾種常用培養(yǎng)基配方,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方如下： 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g

15、 水 1000ml pH 7.4～7.6。,高氏Ⅰ號培養(yǎng)基配方如下： 可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO3 1gK2HPO4·3H2O 0.5gMgSO4·7H2O

16、 0.5gFeSO4·7H2O 0.01g 瓊脂 15～25g 水 1000mL pH 7.4～7.6,,馬鈴薯培養(yǎng)基配方： 馬鈴薯 200g葡萄糖 20g瓊脂

17、 l5～20 g蒸餾水 l000mL pH 自然,,阿斯畢無氮培養(yǎng)基：甘露醇（或蔗糖、葡萄糖） 10gKH2PO4 0.2gMgSO4.7H2O 0.2gNaCl

18、 0.2gCaSO4.2H2O 0.1gCaCO3 5g瓊脂 20g 水 1000mlPH 自

19、然,五 注意事項,在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內(nèi)冷空氣要盡可能排除完；易燃易爆物品（如：硝化甘油、硝化纖維、黃磷、紅磷、乙醚、汽油及可燃性氣體等）不能用高壓滅菌法滅菌；當含鹽類的液體和含鹽的瓊脂中大量的鹽類潑灑在工作腔體，要立即換水，沖洗腔體，仔細擦干鍋蓋墊圈上的水滴。否則它們會帶來腐蝕和變質(zhì)。要檢查壓力表上的指數(shù)為“0Mpa”后才能打開鍋蓋。外來物質(zhì)（金屬、液體）不能堵塞通風孔，否則會引起裝置故障、起火、短路。,,蛋白胨很

20、易吸濕，在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴防藥品混雜，一把牛交匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。瓶蓋也不要蓋錯。在瓊脂溶化過程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上以免污染棉塞而引起污染。分裝量根據(jù)試管大小和實際需要而定，固體培養(yǎng)基裝量約為管高的1/5，液體培養(yǎng)基的裝量約為管高的1/4，三角瓶的裝量不超過瓶體的1/2

21、 。,六 思考題,1.為什么濕熱滅菌比干熱滅菌法更有效？2.在配制培養(yǎng)基的操作過程要注意哪些問題？3.高壓蒸汽滅菌時，為什么要先將滅菌鍋鍋內(nèi)的冷空氣完全排盡？,一、自生固氮菌的分離純化,1、富集培養(yǎng)（下周上課時自帶土壤——偏堿性土壤）一組5人，每人做1皿（共5皿，滅菌時5個一包）；需要1瓶阿斯畢培養(yǎng)基倒平板（100ml左右）2、劃線分離每人做2皿（共10皿，滅菌時10個一包）；需要2瓶阿斯畢培養(yǎng)基倒平板（200ml左右）

22、3、斜面保藏每人保藏2根斜面（共10根）.配培養(yǎng)基時做好10根阿斯畢無氮培養(yǎng)基斜面。,二、土壤平板稀釋計數(shù),1、梯度稀釋（下周自帶10g以上的土壤）一個帶玻璃珠的250ml三角瓶，內(nèi)裝90ml蒸餾水；6個裝有9ml蒸餾水用于梯度稀釋的18*180試管；1ml移液管1支。2、涂平板 5個人每人做1個濃度，每個濃度做3個重復(fù)，即每個濃度涂3皿（共15皿，滅菌時6個一包，9個一包）需要3瓶牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒平板（300