雙水相萃取資料

1、雙水相萃取技術(shù) ( aqueous two-phase extraction ),主要內(nèi)容：一、雙水相萃取的基本理論二、雙水相萃取工藝流程操作三、影響雙水相的因素四、雙水相萃取的應(yīng)用五、雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展,,雙水相萃取現(xiàn)象最早是1896年由Bei jerinck在瓊脂與可溶性淀粉或明膠混合時發(fā)現(xiàn)的，這種現(xiàn)象被稱為聚合物的“不相溶性” (incompatibility)。20世紀(jì)60年代瑞典Lund大學(xué)的Albertsso

2、n P A及其同事們最先提出雙水相萃取技術(shù)并做了大量的工作。70年代中期西德的Kula M R和Kroner K H等人首先將雙水相系統(tǒng)應(yīng)用于從細(xì)胞勻漿液中提取酶和蛋白質(zhì)，大大改善了胞內(nèi)酶的提取效果。,前 言,一、雙水相萃取的基本理論,1、雙水相體系的組成2、雙水相萃取的特點3、雙水相萃取原理,1、雙水相體系的組成,雙水相體系的主要成因——聚合物的不相溶性,雙水相現(xiàn)象是當(dāng)兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽溶于同一溶劑時，由于聚合物

3、之間或聚合物與鹽之間的分子空間阻礙作用，無法相互滲透，當(dāng)聚合物或無機(jī)鹽濃度達(dá)到一定值時，就會分成不互溶的兩相，因為使用的溶劑是水，所以稱為雙水相。,① 聚合物∕聚合物雙水相,當(dāng)2種聚合物混合時，由于2種聚合物間存在較強(qiáng)的斥力或空間阻礙，使2者無法相互滲透，不能形成均一相，故達(dá)到平衡后形成兩相，這2種聚合物分別位于互不相溶的兩相中，即形成聚合物/聚合物雙水相體系。,聚合物雙水相形成機(jī)理,兩種聚合物,,相互混合,,,混合,體系熵的增加,兩個

4、因素,分子間作用力,分離（聚合物的不相容性）,,分相,,富含不同聚合物的兩相,形成雙水相的雙聚合物體系很多，如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纖維素(methylcellulose)/葡聚糖等。雙水相萃取中常采用的雙聚合物系統(tǒng)為PEG/Dx，該雙水相的上相富含PEG，下相富含Dx。,②聚合物∕無機(jī)鹽雙水相

5、,某些聚合物溶液和一些無機(jī)鹽溶液相混時，在一定濃度下，由于鹽析作用，也會形成兩相，即聚合物/ 無機(jī)鹽雙水相體系，常用的無機(jī)鹽有磷酸鹽和硫酸鹽。除高聚物、無機(jī)鹽外，能形成雙水相體系的物質(zhì)還有高分子電解質(zhì)、低分子量化合物。,各種類型的雙水相體系,雙水相的形成,在聚合物∕鹽或聚合物∕聚合物系統(tǒng)混合時，會出現(xiàn)兩個不相混溶的水相,,,PEG = 聚乙二醇(polyethylene glycol),Kpi = 磷酸鉀,DX = 葡聚糖(dextr

6、an),2、雙水相體系的特點,優(yōu)點：,操作條件溫和，在常溫常壓下進(jìn)行。兩相的界面張力小，一般在10-4N/cm量級，兩相易分散。兩相的相比隨操作條件而變化。,易于連續(xù)操作，處理量大，適合工業(yè)應(yīng)用。兩相的溶劑都是水，上相和下相的含水量高達(dá)70%～90%，不存在有機(jī)溶劑殘留問題。,缺點：,成相聚合物的成本較高，且高聚物回收困難。水溶性高聚物大多數(shù)粘度較大，不易定量控制。易乳化，相分離時間較長。影響因素復(fù)雜。,3、雙水相萃取原理,

7、(1) 分配系數(shù) 雙水相萃取與一般的水-有機(jī)物萃取的原理相似, 都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。當(dāng)萃取體系的性質(zhì)不同, 物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后, 由于分子間的范德華力、疏水作用、分子間的氫鍵、分子與分子之間電荷的作用, 目標(biāo)物質(zhì)在上、下相中的濃度不同, 從而達(dá)到分離的目的。,其分配規(guī)律服從Nernst分配定律，即K=Ct/Cb，其中Ct、Cb分別為上相和下相的濃度，K為分配系數(shù)。各種物質(zhì)的分配系數(shù)K是不一樣的，因而雙水相體系

8、對生物物質(zhì)的分配具有很大的選擇性。 系統(tǒng)固定時,分配系數(shù)K為一常數(shù), 與溶質(zhì)的濃度無關(guān)。當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后， 在上相和下相間進(jìn)行選擇性分配，這種分配關(guān)系與常規(guī)的萃取分配關(guān)系相比，表現(xiàn)出更大或更小的分配系數(shù)。,(2) 萃取率 當(dāng)某一物質(zhì)A的水溶液, 用有機(jī)溶劑萃取時, 則萃取率E應(yīng)該等于: 有機(jī)相中被萃取物的量 兩相中被萃取物的量,,,×100%,E=,萃取率反應(yīng)了物

9、質(zhì)被萃取的完全程度。 雙水相萃取是一種可以利用較為簡單的設(shè)備，并在溫和條件下進(jìn)行簡單操作就可獲得較高收率和純度的新型分離技術(shù)。,雙水相體系中相關(guān)的計算公式為：R=Vt／Vb，K=Ct／Cb，G=1/RK，Y=（1+1／RK）-1 ×100％式中：R－相比；Vb－下相體積，mL；Vt－上相體積，mL； K－分配系數(shù)；Cb－下相溶質(zhì)的質(zhì)量濃度，g／mL；Ct －上相溶質(zhì)的質(zhì)量濃度，g／mL；G－上、下相溶質(zhì)的

10、質(zhì)量比；Y－萃取率，％。,(3) 雙水相相圖制作,以PEG4000∕硫酸銨雙水相體系為例,①建立PEG4000的吸光度-質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,②建立硫酸銨的電導(dǎo)率-質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,③建立PEG4000∕硫酸銨雙水相相圖,約取5mL20%的PEG4000溶液溶于50mL的離心管里面,用100μL移液器逐滴加入40%的硫酸銨溶液,振蕩混勻直至出現(xiàn)渾濁，將混合液放在離心機(jī)上離心5min,溶液分層后分別取其上、下相各1克稀釋100倍,并測其電導(dǎo)

11、率記錄數(shù)據(jù)。再取溶液上下相的溶液各1克溶于100mL容量瓶中，測定其吸光度并記錄數(shù)據(jù)。,接著在混合液中加入一定量的去離子水至渾濁變澄清，再次逐滴加入硫酸銨溶液至出現(xiàn)渾濁且半分鐘內(nèi)渾濁不變化，重復(fù)上述步驟。根據(jù)測量數(shù)據(jù)作出PEG4000∕硫酸銨溶液的雙水相相圖。,圖中的曲線為雙結(jié)線(Binodal)，雙結(jié)線以下的區(qū)域為均相區(qū)，以上的區(qū)域為兩相區(qū)，也稱為工作區(qū)。連接雙結(jié)線上兩點的直線稱為系線(Tie一line，簡稱TL)，表示了雙水相體系達(dá)

12、到相平衡時上、下相組成和總組成的關(guān)系。,雙水相體系的雙結(jié)線模型,系線上的各點上下相的組成相同，而體積不同，上下相的體積比近似服從杠桿原理，即： Vt/Vb=Ab/At 其中， Vt/Vb分別為上相和下相體積，Ab/At分別為A點與B點和A點與T點之間的距離。,雙水相體系的雙結(jié)線模型,雙水相體系的雙結(jié)線模型,系線長度通過下式計算：,△代表上下相的濃度差。一般情況下，體系對被分配物質(zhì)的處理能力與系線長度成正比。,雙水相體系的

13、雙結(jié)線模型,系線越長，界面張力就越大，兩相間的性質(zhì)差別就越大，被分配物質(zhì)在相間分配系數(shù)K亦越大;反之就越小。當(dāng)系線長度趨向于零即接近于臨界點 (criticalpoini，簡稱Cp)時，兩相差別消失，界面張力為零，體系成為均一的一相。,a,雙節(jié)線,系線,b,雙節(jié)線,,均相區(qū),,均相區(qū),兩相區(qū),兩相區(qū),系線,,,臨界點,,,二、雙水相萃取工藝流程操作,工藝流程主要由三部分組成：,目標(biāo)產(chǎn)物的萃取聚合物（PEG)的循環(huán)無機(jī)鹽的循環(huán),雙水相

14、萃取工藝流程圖,,,,上相,,,萃取液,PEG無機(jī)鹽,｝,ATPE,相似相溶原理,相體系回收示意圖,PEG的循環(huán) 在大規(guī)模雙水相萃取過程中，成相材料的回收和循環(huán)使用，不僅可以減少廢水處理的費(fèi)用，還可以節(jié)約化學(xué)試劑，降低成本。PEG回收有2種方法：一種即前面所述的加入鹽使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入富鹽相來回收PEG，一種是將PEG通過離子交換樹脂，洗脫劑先洗出PEG，再洗出蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在常用的方法是將第1步萃取的PEG相或除去部分蛋白質(zhì)的PEG相循

15、環(huán)利用。,無機(jī)鹽的循環(huán) 一種方法是將無機(jī)鹽相冷卻，如將含磷酸鈉的鹽相冷卻到6℃，使鹽結(jié)晶析出，然后用離心機(jī)分離收集；另一種是用電滲析法、膜分離法回收鹽類或除去PEG相的鹽。雙水相萃取所用的設(shè)備一般都是其他兩相體系如水和有機(jī)溶劑體系所通用的設(shè)備，有商業(yè)化的混合器和沉淀器系統(tǒng)以及離心分離機(jī)已成功應(yīng)用于雙水相萃取。,盡管剛開始應(yīng)用時，大多數(shù)雙水相萃取是間歇式的，但此技術(shù)更適合于錯流萃取的連續(xù)生產(chǎn)，這樣可有效利用空間和時間，尤其是在與其

16、他分離技術(shù)如凝膠過濾、膜分離等相結(jié)合使用時。1988 年，Hustedt 等人證明在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模上可將雙水相體系用于連續(xù)錯流萃取延胡索酸酶和青霉素配基轉(zhuǎn)移酶。,三、影響雙水相萃取的因素,影響雙水相萃取平衡的主要因素有：組成雙水相體系的高聚物類型、高聚物的平均分子量和分子量分布、高聚物的濃度、成相鹽和非成相鹽的種類、鹽的離子濃度、pH值、溫度等。,1）聚合物的類型,不同聚合物的水相系統(tǒng)顯示出不同的疏水性，聚合物的疏水性按下列次序遞增：葡萄

17、糖硫酸鹽糖＜葡萄糖＜羥丙基葡聚糖＜甲基纖維素＜聚乙二醇＜聚丙三醇，這種疏水性的差異對目的產(chǎn)物的作用是重要的。,2）聚合物及其相對分子質(zhì)量,不同聚合物的水相系統(tǒng)，疏水性不同；同一聚合物，疏水性隨分子量增加而增加，其大小的選擇取決于萃取過程的目的和方法，在PEG/Dex體系中，PEG分子量的減少，會使萃取液在兩相中的分配系數(shù)增大，當(dāng)PEG的分子量增加時，在質(zhì)量濃度不變的情況下，親水性蛋白質(zhì)不再向富含PEG相中聚集而轉(zhuǎn)向另一相。,在雙水相系統(tǒng)

18、中，界面張力很低并且隨雙曲線長度呈指數(shù)規(guī)律的增大。當(dāng)系統(tǒng)組成處于臨界點時，系線長度為零，上下相組成相同，萃取液均勻地分配在兩相中，分配系數(shù)K=1。當(dāng)成相聚合物的總濃度或聚合物/鹽混合物的總濃度增加時，系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點，系線長度增大，兩相性質(zhì)的差別也增大，同時萃取液在兩相中界面張力的差別增大，使其趨于向一側(cè)分配，即K值或增大超過1，或減小低于1。,3）聚合物的濃度,4）溫度的影響,溫度的變化影響相物理性質(zhì)的變化，例如粘度和密度等，從而影響萃

19、取液的分配。但總的來說，溫度對分配系數(shù)的影響是通過對相圖的影響來間接達(dá)到的。在臨界點附近，溫度對相圖的影響最顯著，對分配系數(shù)的影響最強(qiáng)。當(dāng)遠(yuǎn)離臨界點時，溫度對相圖的影響較小，分配系數(shù)對溫度的變化也不敏感。這是由于遠(yuǎn)離臨界點時，成相聚合物的濃度增大，對萃取液的穩(wěn)定作用增強(qiáng)。,但一般來說，當(dāng)雙水相系統(tǒng)離雙節(jié)線足夠遠(yuǎn)時，溫度的影響很小，1-2度的溫度改變不影響目標(biāo)產(chǎn)物的萃取分離。 大規(guī)模雙水相萃取操作一般在室溫下進(jìn)行，不需冷卻。這是基

20、于以下原因： (l)常溫下，溶液的粘度較低，容易分相 (2)成相聚合物PEG對某些具有生物活性溶質(zhì)如蛋白質(zhì)有穩(wěn)定的作用，常溫下蛋白質(zhì)一般不會發(fā)生失活、變性。 (3)常溫操作節(jié)省冷卻費(fèi)用。,溫度對雙水相系統(tǒng)的影響,體系pH值會影響溶液分子中可離解基團(tuán)的離解度，從而改變分子表面的電荷數(shù)來影響分配。同時PH值還會影響緩沖離子如HPO42-、PO43-等的分配，以改變相間電位來達(dá)到改變分配系數(shù)的目的。另外在研究分配系數(shù)與pH值

21、的關(guān)系時，若加入不同種類的中性鹽，由于電位差的不同，其相應(yīng)關(guān)系也不同。,5）PH值的影響,6）無機(jī)鹽的濃度,鹽的正、負(fù)離子在兩相間分配系數(shù)不同，兩相間形成電位差，從而影響帶電生物大分子的分配。無機(jī)鹽濃度的不同能改變兩相間的電位差。,利用雙水相萃取技術(shù)分離純化時，其選擇雙水相體系的一般原則是:(l)目標(biāo)產(chǎn)物在兩相中有較大的分配系數(shù)(2)能保持具有生物活性溶質(zhì)的活性(3)體系易于分相，可利用靜止或者離心沉降法進(jìn)行分相(4)降低操作成

22、本，采用廉價的雙水相體系來萃取分離,綜合利用以上因素，可通過實驗確定最佳雙水相萃取系統(tǒng)。以PEG/硫酸銨雙水相體系萃取一種蛋白質(zhì)為例：（1）固定硫酸銨為某一濃度，用梯度濃度的聚乙二槨與其形成一系列雙水相體系，萃取分離蛋白質(zhì)，分別測量上、下相蛋白質(zhì)的含量，確定PEG的最佳濃度。（2）選取（1）中的最佳PEG濃度，在此濃度下與梯度濃度的硫酸銨形成雙水相體系，進(jìn)行蛋白質(zhì)的萃取分離，測定上、下相中蛋白質(zhì)的含量，確定出最佳的硫酸銨濃度。,（3

23、）在（1）和（2）的基礎(chǔ)上，選用最佳的PEG濃度和硫酸銨濃度組成雙水相體系，在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的PH范圍，用一系列不同PH值的緩沖液調(diào)節(jié)雙水相體系的酸堿環(huán)境，測定上、下相中蛋白質(zhì)的含量，確定出最佳的PH范圍。（4）在最佳PEG濃度、硫酸銨濃度和PH值的基礎(chǔ)上，用相同的方法得到最適宜的溫度。,四、雙水相萃取的應(yīng)用,雙水相萃取自發(fā)現(xiàn)以來，無論在理論上還是實踐上都有很大的發(fā)展，在最近幾年中更為突出，在若干生物工藝過程中得到了應(yīng)用，其中有： 分

24、離和提取各種蛋白質(zhì)（酶） 提取抗生素和分離生物粒子 天然產(chǎn)物的分離提取 基因工程藥物的分離與提取,五、雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展方向,新型雙水相體系的開發(fā)——降低分離成本 用變性淀粉取代葡聚糖 用羥基纖維取代聚乙二醇,親和雙水相萃取技術(shù) 親和雙水相萃取技術(shù)是指在成相高聚物上偶聯(lián)親和性配基，以提高溶質(zhì)的分配系數(shù)。 利用金屬離子和蛋白質(zhì)中精氨酸、組氨酸的親和作用,新型功能雙水相體系,高速逆流雙水相色譜,高速