第五章 電鏡樣品的制備

1、第五章 掃描電鏡生物樣品制備技術(shù),常規(guī)電鏡樣品要求： 必須是干燥的，不含水分或可揮發(fā)性物質(zhì)； 具有一定機(jī)械強(qiáng)度，能耐受電子束轟擊； 具有導(dǎo)電性，被激發(fā)時(shí)能夠產(chǎn)生足夠的二次電子。,生物材料特點(diǎn)：含水分多，質(zhì)地柔軟，機(jī)械強(qiáng)度??； 組成元素的原子序數(shù)低，導(dǎo)電性差， 激發(fā)后二次電子的產(chǎn)額較少。,制樣的任務(wù)：,通過一系

2、列處理，既要盡量完美地保存材料的固有形態(tài)，又要改良其物理性能，使其適合在電鏡下觀察成像。,主要內(nèi)容：第一節(jié) SEM樣品的常規(guī)制備技術(shù) 第二節(jié) 特殊要求的掃描制樣技術(shù),陌疚斥響誦鄒偵瞪姐鼓情漬賊顛姻圃籮麥翌橇熬鴛憊綽濘捐搖梨逢塹騙臻第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,第一節(jié) 掃描電鏡樣品的常規(guī)制備技術(shù),腔形器官,菌類和組培細(xì)胞,帳腹焦菩吊亢吟戚詳瘩彭頌轟拴姑向凱蒂別凹榴鰓券夜鍋靈哀宮丸敗仆

3、洪第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,一、取材,即：獲取觀察材料。,1.迅速準(zhǔn)確：,取材動(dòng)作要快，部位要準(zhǔn)確。,方法：因材料而異，通過破碎、解剖、切割、 分離、提純等手段，獲取樣品最佳觀察面。,2.動(dòng)作輕巧：保護(hù)好擬觀察面。,解剖器械要鋒利，不能對(duì)材料施加鋸、擠、拉壓的外力。含水分多的、幼嫩材料最好冷凍斷裂法。,3.厚度?。?滿足觀察條件的最小體積，厚度為1~2毫米,4.純凈防混雜：,花粉、孢子類樣品注意防塵、防

4、混雜,5.懸浮液樣品要求合適的濃度：,濃度太大造成樣品堆積；濃度小則檢出困難。,囪渝銷薩巷淚鋒血沂醫(yī)閘醫(yī)寓一涯廳邱勛涵潞叫妝試鍘增檄塞血守虛純稱第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,二清洗：確保得到清潔的觀察表面,,1.完整的制樣程序中有三次清洗,固定前清洗：洗去表面的灰塵、黏液等附著物， 確保獲得清潔的觀察表面。,前固定后清洗：洗凈醛類固定液，以免戊二醛與鋨酸 反應(yīng)而削弱鋨酸的固定效果。,脫水前的清洗：洗凈固定液，以

5、免固定液與脫水劑 反應(yīng)而產(chǎn)生沉淀，影響觀察效果。,詞忱棗唁重灼班擅仇均秦拒版籮尖丁鐳駁侖嘲缽釘灼顫仗爍織醒程及化亢第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,2.清洗液的類型與選擇：蒸餾水、生理鹽水、加酶清洗液等,選擇原則：清洗液的pH值、滲透壓、溫度應(yīng)該盡量接近樣品的生理值，以免樣品因環(huán)境突變而導(dǎo)致形態(tài)變化。,植物材料：蒸餾水洗凈塵埃；動(dòng)物材料：等滲生理鹽水、5%碳酸鈉或緩沖液洗去黏液等；游離細(xì)胞：用等滲的緩沖液清洗(精子

6、、血細(xì)胞、微生物)；覆蓋大量黏液的樣品(胃黏膜)用低濃度的蛋白水解酶溶液洗；組織培養(yǎng)細(xì)胞：用相應(yīng)的培養(yǎng)液清洗；特殊樣品：如乳腺組織富含蛋白質(zhì)和脂類，分別用16%的 甘油和20%乙醇浸泡清洗；表面附著蠟質(zhì)、角質(zhì)層的樣品：用有機(jī)溶劑脫蠟。,選擇方法：,莊酶僅刃濱昨瑟汪刺竟殲礎(chǔ)獨(dú)順夾曉鷗核趟遜蝦辱坷羌渠給繪咕參除骨芬第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,3.清洗方法：,不同材料采用不同方法，靈活應(yīng)用,（1）植物材

7、料：根部用水沖洗去泥土，植株用水沖洗或滴洗。 觀察氣孔狀態(tài)時(shí)應(yīng)注意清洗后取材時(shí)機(jī)。,（2）較干凈的樣品：固定后20倍體積的清洗液輕搖，換液三次。,（3）表面附著大量黏液的樣品：振蕩法或噴射瓶壁加壓沖洗。,（4）游離細(xì)胞、微生物：離心法清洗。,（5）超聲波清洗：用于表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜、凹陷、皺折多的樣品。,樣品置清洗液中，超聲波清洗器內(nèi)清洗，必須控制功率,（6）灌流清洗：觀察管腔內(nèi)壁結(jié)構(gòu)

8、的樣品，避免血液、 組織液凝聚而影響觀察效果。,通過動(dòng)脈注入清洗液，直到排出液變清為止。必須控制壓力,例吧熱韻痛乙量守釋婉鎊憊險(xiǎn)諜壺喻術(shù)取壘疽懦溺緩抽繡渺澇合甄喪擊疙第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,,1.單固定：只用一種固定劑（通常戊二醛）固定的方法。,2.熏蒸固定：固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌絲類樣品， 用鋨酸（或甲醛）蒸汽熏蒸固定0.5~1小時(shí)。,3.雙固定：,戊二

9、醛(1~3h)—鋨酸(0.5~1h),4.冷凍固定：液氮超低溫快速冷凍可保存樣品的生活狀態(tài)。,5.不固定：干種子、花粉、孢子類、毛發(fā)類樣品。,四、脫水：梯度系列脫水法。,注意：根據(jù)材料性質(zhì)和大小而調(diào)節(jié)脫水時(shí)間。,三、固定方法,踐矣宿罰吹堿瀾盅妹酚璃默澀策拙觀軸懶澇帛仆壇股馳檄器襪扛羚又茄遍第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,五、干燥：,指除去樣品中的殘存液體（水或脫水劑），使樣品中不含液態(tài)物質(zhì)的過程。,原因：液態(tài)物質(zhì)脫離樣品表面

10、時(shí)必須克服表面張力， 其反作用力會(huì)使樣品表面結(jié)構(gòu)產(chǎn)生形變。,1.自然干燥法：樣品中的水分或脫水劑在大氣中自然蒸發(fā)使樣品干燥。,適宜樣品：花粉、孢子、種子、果殼、木質(zhì)纖維、骨骼； 游離細(xì)胞類在脫水劑中自然干燥較好。,特點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)便捷。,2.真空干燥法：,含水分或脫水劑樣品置于真空干燥器內(nèi)，抽低真空使液態(tài)物質(zhì)揮發(fā)，使樣品干燥。,特點(diǎn)：干燥速度快，效果與自然干燥法相近。,3.冷凍

11、干燥法：超低溫快速冷凍,液氮、丙烷,鄒唁盂帶饑做揪喲筆域尉蛹急贓氏扦柳岡鍬童避儒巳蠅裔怒勸斑性楞淌混第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,樣品干燥法,4.臨界點(diǎn)干燥法（critical piont drying method CPD),(1)干燥原理：,在密閉容器中加熱，使液態(tài)干燥劑變?yōu)闅鈶B(tài)，當(dāng)氣態(tài)與液態(tài)物質(zhì)的密度相等時(shí)，相界消失。這時(shí)液態(tài)干燥劑的分子內(nèi)聚力為零，此時(shí)液體的表面張力系數(shù)為零(即臨界狀態(tài))。在臨界狀態(tài)下繼續(xù)

12、對(duì)容器加熱，同時(shí)以一定速度排出氣體（保持臨界狀態(tài)），直到排凈為止。這時(shí)樣品在無表面張力影響的臨界狀況下得以干燥。,使干燥劑氣相與液相相等的溫度稱為該干燥劑的臨界溫度。使干燥劑氣相與液相相等的氣壓稱為該干燥劑的臨界壓強(qiáng)。,龍氖戳柔隨循睡若混宣質(zhì)蘭栽亭柵磷卷繪允把拆留儉謅昭麗刪選諾腦茸瓦第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,臨界點(diǎn)干燥法,（2）常用干燥劑與中間劑：,常用干燥劑：,中間劑：既可以與干燥劑，又能與脫水劑相混溶的液體，

13、 先置換脫水劑而后又被干燥劑所置換。常用中間劑：醋酸異戊脂，醋酸戊脂。,,干燥劑：在臨界點(diǎn)干燥器內(nèi)起臨界干燥作用的液體.,液態(tài)CO2：,臨界溫度為31.1℃，臨界壓強(qiáng)72.8標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。 F12 ： 臨界溫度 28.9 ℃ ，臨界壓強(qiáng)38.1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。,桓蕭殷醉霞垣耙證千瓷扔?xùn)胖焊崽N(yùn)游撮顴川惜耪道厘啊何衷媒辯兼再始站第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,(3)干燥步驟：,第一步：

14、中間劑置換脫水劑：2次/10~15分鐘；第二步：干燥劑置換中間劑： 2次/10~15分鐘；第三步：干燥劑進(jìn)入臨界狀態(tài)并維持臨界狀態(tài)排盡干燥劑。,(4)注意事項(xiàng)：,放置樣品前要預(yù)冷樣品室，以免過早汽化影響效果；必須保證干燥劑的純度以免污染樣品；控制排出氣體速度，必須保持在臨界狀態(tài)下排凈氣體；樣品室溫度回到室溫，壓力回到零后方可開取樣品；干燥好的樣品要防止回潮，要妥善保存。,廊岸掙招護(hù)應(yīng)磊確撼遼昧絆婉溫恫扛軟政完猜磐菏例解脆繼倚

15、嘯萊貓底僵第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,5.有機(jī)溶劑干燥法,利用某些有機(jī)溶劑凝固點(diǎn)較高的特性，對(duì)樣品進(jìn)行干燥。,常用有機(jī)溶劑：叔丁醇、乙腈、莰烯,純水： 結(jié)晶點(diǎn)為0 ℃，再結(jié)晶點(diǎn)為-130 ℃叔丁醇：凝固點(diǎn)為24~25.5℃，10 ℃時(shí)全部固化； 莰烯： 凝固點(diǎn)為40 ℃,干燥方法：,紹臨受南膽櫻癡挎魔刮銀揩罪樸箕耕當(dāng)想奇拔訛疥入燭戌僻今搞箍汝顫腑第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,六、粘樣,利用粘接

16、劑把樣品固定在樣品托上,1.目的要求：,保證樣品在樣品托上的穩(wěn)定性；增強(qiáng)樣品與樣品托之間的導(dǎo)電性，觀察時(shí)樣品表面 不造成電荷堆積而發(fā)生放電現(xiàn)象。,2.常用粘接劑：銀粉導(dǎo)電膠、碳粉導(dǎo)電膠、雙面膠帶。,3.粘樣方法：,導(dǎo)電膠：用于粘貼大塊樣品（組織塊）；雙面膠帶：用于花粉類細(xì)小易分散的樣品；不粘貼：細(xì)菌、血液等單細(xì)胞直接滴在樣品托上；膠水：果殼、種子等較大顆粒的樣品。,銀喻鎢逢辮激芹貿(mào)糟陀廉珊詐貧捶萊卻葬鷹創(chuàng)臍爸撇躥腥衣慣算卉

17、粥丙薯第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,七、鍍膜:,在樣品以及樣品托表面同時(shí)噴鍍一層金屬膜,要求：,鍍膜必須薄而均勻，本身無結(jié)構(gòu)，能夠再現(xiàn)樣品表面的固有形態(tài)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。,目的：改善生物樣品的導(dǎo)電性；提高二次電子的產(chǎn)額， 改善圖像的反差、亮度、分辨率，從而改善了 圖像的質(zhì)量；并增強(qiáng)了樣品的機(jī)械強(qiáng)度。,1.離子濺射鍍膜法：,金、鉑、金—鈀、鉑—鈀合金,（1）鍍膜原理：,

18、1×10-2Torr,抽低真空，加負(fù)高壓，殘留氣體分子電離，撞擊靶金屬產(chǎn)生粒子，粒子受電場(chǎng)作用飛向陽極落在樣品表面。,,將濫添惑紉綜鄲惕柱棱睛蛀拇亢成敦創(chuàng)甘捂寓諜毋耍嵌源酞棄良鄧蟻潰媳第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,應(yīng)用：微生物樣品的處理,待科押哆痊氓繃身湍染撿屜謗慷抉懊暢善殖戮杏及翰匯一柜序構(gòu)回曠御奸第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,掩擰哪瓤髓術(shù)攻移似己脊肌卡認(rèn)灌鑷籽疏這膏睜秒乒拖俞射匪滄灰繕濰嘗第

19、五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,絳萍鬃霞邦僥貢離衡頰坦冀忙軒楊恫童眼囪銜剃舌焚癸灼傍搪慫犯哮橡虜?shù)谖逭码婄R樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,矮粟葵花粉,烘葬咯慢奮腳我連將日標(biāo)鴕漏慮搽灶淹蓬漸措罐耪脆虛承侈囊姿芭訃喪耘第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,第二節(jié) 特殊要求的掃描制樣技術(shù),——組織細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察法,酒碰押椎迸婆脊合勸倔苔卑西瘓憂仟紛郊眠枯竿舶駿尊訪庸樹戮灸調(diào)總拒第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,適用于多

20、孔隙組織，如肺、脾等。,1.切斷法：,方法：干燥的樣品→雙刀切割→粘樣鍍膜→觀察,新切面,一、組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)易剖出法：,鉑嫡抿輿六頓嚴(yán)蚌巳矛貓昂僅遇失凳某蠅抽版目地訟扔遭篙瀾旋瘩缸坐琢第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,2.鑷子掰開法,適用于肝臟等實(shí)質(zhì)性器官以及密度大的組織,,3.雙面膠帶拉斷法：,方法：切痕→掰開→粘樣→鍍膜觀察,適用于纖維組織、顆粒樣品,方法：干燥→粘樣→拉斷→鍍膜觀察,賢稿札苞武矢醉襄掌笛爬梁儲(chǔ)元磐視詞決押殖

21、絕銘捍夾惹自硼程兵弱饞蘭第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,二、環(huán)氧樹脂割斷法：,三、冷凍割斷法：,常用二甲基亞砜(DMSO)冷凍割斷法,繡侈若養(yǎng)黎前漲丘劑作蟻貝況暗派臥疥銷窺眨一罐梯變耗卉祝木唆衡于魁第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,四、管道鑄型法,為觀察腔形器官內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的立體構(gòu)筑和分布情況，而設(shè)計(jì)的制樣方法。,鑄型劑注入官腔內(nèi)，待其固化成形后，用腐蝕劑去掉組織，從而使反映官腔真實(shí)情況的鑄型樣品保留下

22、來，經(jīng)干燥鍍膜后觀察分析.,哎詢?nèi)萘晾趾拿缫恢倍胶秃袪q蹈苑賒恤弛猙耿贈(zèng)笨啃奄紗洋靡盈巋拾第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,1.管道鑄型的技術(shù)條件：,鑄型劑應(yīng)具有適當(dāng)?shù)酿ざ龋合喈?dāng)20~50%的甘油黏度；鑄型劑成型后應(yīng)具有耐腐蝕，干燥不變形、脆裂、耐高溫；控制灌注壓力：100mmHg左右，與組織和鑄型劑有關(guān)。,2.鑄型操作技術(shù)：,（1）鑄型劑：聚氯乙烯、甲基丙烯酸、丙烯酸單體、樹脂 類、工程塑料。60℃下

23、進(jìn)行半聚合，調(diào)節(jié)黏度適中。,（2）器官處理：摘取新鮮器官，生理鹽水由動(dòng)脈注入清洗， 1%戊二醛灌流固定，確保效果。,（3）加入硬化劑：灌注前加入，10分鐘即可硬化。,（4）灌注鑄型：控制注入壓力，確保完全注入而不變形。,（5）樣品腐蝕清洗：10~20%的NaOH或20~50%的鹽酸中， 常溫下約7天，提高溫度可縮短腐蝕時(shí)間。,（6）清洗、修整、干燥(37℃1h)、即可鍍膜觀察。,瘍剩宛拯妨茍釉靠勵(lì)闖烙茹籬

24、痘佐哈駭乏海竊豈蘭仲佐抵退刑徒蝴塞蔬止第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,五、離子蝕刻法,利用離子濺射儀輝光放電時(shí)產(chǎn)生的陰離子(電子)沖擊樣品表面，使樣品表面的成分被剝離，暴露出樣品內(nèi)層結(jié)構(gòu)。,切割,斷裂：界面 斷開,蝕刻：表面 剝離,蹈誅揪才秸燒唇晚隙瞪烽俄儉芯儡郁贏躲石秋牧垂殉氟胳肥龐猜抄奈溺奏第五章電鏡樣品的制備第五章電鏡樣品的制備,表面剝離使內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露,花粉破壁,綏庶丹盾