脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究

1、1,脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究,生理學(xué)與病理生理學(xué)系 林 岷,2,概述脂肪肝的病因脂肪肝的發(fā)病機(jī)制脂肪肝實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒎椒ㄖ靖蔚脑\斷脂肪肝的防治,3,概 述,,4,脂肪肝是僅次于病毒性肝炎的第二位常見肝病，是二十一世紀(jì)肝病領(lǐng)域面臨的新挑戰(zhàn)。對(duì)于脂肪肝的防治不僅是一個(gè)醫(yī)學(xué)問題，更是一個(gè)社會(huì)問題。脂肪肝已成為消化、內(nèi)分泌、營(yíng)養(yǎng)、心血管等多學(xué)科共同關(guān)注的問題。,5,2011年7月 重慶 第四屆全國(guó)脂肪性肝病學(xué)術(shù)

2、會(huì)議 解放軍302醫(yī)院病理診斷與研究中心主任、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士生導(dǎo)師趙景民教授指出，未來(lái)十年，我國(guó)將由“病毒性肝炎大國(guó)”轉(zhuǎn)為“脂肪性肝病大國(guó)”，應(yīng)高度重視脂肪性肝病的防治 。,6,正常肝臟,脂肪肝,7,脂肪肝大體標(biāo)本切面,8,大泡、小泡性肝脂肪變混雜,小泡性肝脂肪變,9,重度肝脂肪變，脂變肝細(xì)胞達(dá)90%,10,脂肪肝基本概念,狹義的定義 肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量（主要是甘油三酯TG）＞肝臟

3、濕重的5%，或肝組織學(xué)上每單位面積＞30%的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性時(shí)，稱為脂肪性肝病(fatty liver disease ，F(xiàn)LD)，簡(jiǎn)稱脂肪肝。,11,脂肪肝基本概念,廣義的定義 脂肪肝是遺傳－環(huán)境－代謝應(yīng)激相關(guān)因素所致的，病變主體在肝小葉，以肝細(xì)胞脂肪變性為主的的臨床病理綜合征,12,脂肪肝的分類,根據(jù)起病方式及病程分類 急性脂肪肝：小泡性 慢性脂肪肝：大泡性或混合性,,13,脂

4、肪肝的分類,根據(jù)病因分類 酒精性脂肪性肝?。╝lcoholic fatty liver disease,AFLD)非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD),酒精性脂肪肝（AFL）酒精性肝炎酒精性肝纖維化酒精性肝硬化,單純性脂肪肝（NAFL）脂肪性肝炎（NASH）脂肪性肝纖維化和肝硬化,14,NASH，脂變＞50%，匯管區(qū)中度

5、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（HE×50),15,脂肪肝的流行病學(xué)調(diào)查 及預(yù)后,非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）：80%酒精性脂肪性肝?。ˋFLD）：5%其余的是藥物性、中毒性、遺傳性、自身免疫性等脂肪肝,16,NAFLD的流行病學(xué)及預(yù)后,歐美、日本成人NAFLD檢出率20～33％，其中至少10~15%為NASHNAFLD已成為西歐、美國(guó)、澳大利亞、日本第一大慢性肝病及肝酶異常的首要病因

6、亞太地區(qū)NAFLD檢出率12～24％,17,NAFLD的流行病學(xué)及預(yù)后,代謝綜合征（MS）可使NAFLD患病風(fēng)險(xiǎn)增加4~11倍NAFLD可使糖尿病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加3.8~11倍肥胖者： NAFL發(fā)生率60~90%，NASH為20~25%，肝硬化2~8%糖尿病和高脂血癥患者NAFLD檢出率分別為21~78%、27~92%,肥胖2型糖尿病患者可達(dá)50%~70%，且多為中度以上,18,流行病學(xué),研究顯示：2型糖尿病患者是脂肪肝的高

7、發(fā)人群,2型糖尿病患者患NASH危險(xiǎn)性比一般人高2.6倍,19,中國(guó)脂肪肝的流行病學(xué)調(diào)查 范建高，世界華人消化雜志，01年第1期；中華消化雜志，02年第2期,818名北京市干部：18.3%4009名上海市職員：12.8%1050名北京市職工：11.0％1119名南京市干部：10.2%11372名紹興市職工：9.58%3015名杭州市工人：5.2%4100名大慶油田工人：5.15%四川10個(gè)寺廟和尚：0.27%

8、來(lái)自廣州的一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)3年的隊(duì)列研究顯示，2003年NAFLD患病率為16.3%，而2008年則高達(dá)20.5%,20,2011年，北京地壇醫(yī)院副院長(zhǎng)、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博導(dǎo)成軍教授對(duì)北京市居民（3762名）FLD患病率及其危險(xiǎn)因素流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示： 北京市常住居民 FLD——35.1% NAFLD——31.0% AFLD——4.1% ——在過(guò)去的7~10年，中國(guó)發(fā)達(dá)地區(qū)

9、成人脂肪肝患病率增加了一倍,21,NAFLD的預(yù)后,NAFL近期預(yù)后良好NAFL有12~40%患者8~13年進(jìn)展為NASHNASH約有25%患者在8~13年發(fā)展為脂肪性肝硬化脂肪性肝硬化患者發(fā)生原發(fā)性肝細(xì)胞癌、肝功能衰竭的概率高達(dá)30~40%,22,NAFLD相關(guān)腫瘤,2014年上海國(guó)際消化系統(tǒng)疾病會(huì)議： 福建漳州報(bào)道1例手術(shù)證實(shí)NAFLD相關(guān)肝癌，癌旁組織并無(wú)肝硬化。 美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究

10、院的Bin Gao教授也有類似的報(bào)道 提示：NAFLD可以不經(jīng)過(guò)肝纖維化、肝硬化就發(fā)生肝癌 有研究表明， NAFLD與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，包括直腸癌、乳腺癌等，也是目前研究的一項(xiàng)熱點(diǎn),23,24,酒精性肝病ALD的流行病學(xué)及預(yù)后,歐美國(guó)家嗜酒人群中ALD患病率高達(dá)84%，其中20~30%發(fā)展為肝硬化在美國(guó)，ALD為慢性肝病最常見病因，每年 1.5~2萬(wàn)人死于ALD我國(guó)居民ALD發(fā)病率為4~5

11、%，北方＞南方女性對(duì)酒精敏感性高，但由于男性嗜酒者多見，ALD男女比例約2:1,25,酒精性肝病ALD的診斷標(biāo)準(zhǔn)第一條：,有長(zhǎng)期飲酒史，一般超過(guò)5年， 折合乙醇量≥40g/d，女性≥20g/d； 或2周內(nèi)有大量飲酒史（＞80g/d）,26,酒精量： 飲酒量×酒精度（%）×0.8,以56度二鍋頭為例 飲用180ml就超過(guò)80g 飲用700ml就超過(guò)300g*喜力啤酒1

12、000ml——40g,27,ALD的流行病學(xué)及預(yù)后,酒精量＞80~160g/d，其發(fā)生率增長(zhǎng)5~25倍 酒精量＞300g/d，8天后就出現(xiàn)酒精性脂肪肝AFLD比NAFLD 患者10年內(nèi)肝硬化發(fā)生率顯著增高（20%對(duì)1%） **美國(guó)胃腸病學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì)，男性平均每天飲用80g酒精，可能在10年內(nèi)發(fā)生肝硬化，而女性消耗同等量酒精，5年內(nèi)就發(fā)生肝硬化,28,脂肪肝的病因,29,一、營(yíng)養(yǎng)性因素1、肥胖病 NAFLD最常見和

13、最肯定的病因 肥胖伴酗酒者脂肪肝發(fā)生率達(dá)90%以上2、胃腸外營(yíng)養(yǎng) 全胃腸外營(yíng)養(yǎng)持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變和NASH3、營(yíng)養(yǎng)不良 蛋白質(zhì)攝入不足或吸收不良，或膽堿、卵磷脂等缺乏,30,二、化學(xué)性致病因素,1、工業(yè)毒物 苯、二氯甲烷、二氯乙烯、鋇鹽等 NAFL CCl4、砷化物、三氯甲烷、磷等

14、 肝細(xì)胞壞死合并脂肪變2、藥物 長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素、大量四環(huán)素、雌激素制劑、氨甲喋呤、胺碘酮等3、酒精中毒：90%酒精在肝臟轉(zhuǎn)化為乙醛,,,31,三、內(nèi)分泌代謝因素,1、糖尿病 2型糖尿病50~70%合并脂肪肝，且大多為中度或中度以上的脂肪肝 NAFLD與胰島素抵抗（IR）、高胰島素血癥有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)2、高脂血癥 關(guān)系最密切的是高甘油三酯血癥，脂

15、肪肝發(fā)病率為60~80%，常伴有肥胖和糖尿病3、皮質(zhì)醇增多癥、妊娠等亦可導(dǎo)致脂肪肝,32,四、生物性致病因素,肝炎病毒HBV和HCV感染可引起脂肪肝 特別是HCV感染患者中80%伴脂肪肝五、遺傳因素 先天性代謝性肝病：肝豆?fàn)詈俗冃?、半乳糖血癥、 肝糖原貯積病等 遺傳易感性：肥胖、糖尿病、原發(fā)性高脂血癥六、其他

16、 免疫性疾病如SLE、自身免疫性肝炎等 部分病因不明脂肪肝——隱源性脂肪肝,33,酒精中毒、肥胖、糖尿病 ——脂肪肝的三大病因,34,脂肪肝的發(fā)病機(jī)制,,35,1998年Day提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)第一次打擊 各種病因作用 肝細(xì)胞脂肪代謝異常，肝內(nèi)脂肪沉積第二次打擊 肝細(xì)胞脂肪變性

17、 脂肪性肝炎、肝纖維化,,氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞因子等作用下,,36,NAFLD的發(fā)病機(jī)制,脂質(zhì)代謝障礙激素的作用： 胰島素抵抗（IR） 瘦素抵抗氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化損傷細(xì)胞因子的作用,,第一次打擊,,第二次打擊,,,,,,37,肝臟在脂肪代謝中占據(jù)中心地位,饑餓,脂庫(kù)脂肪動(dòng)員,脂肪酸,肝臟,,,,β-氧化,酮體,肝外組織（腦、肌肉）利

18、用,,輸出,飽食,葡萄糖代謝,乙酰CoA,,,合成,脂肪酸、膽固醇,VLDL （TG+膽固醇+磷脂+載脂蛋白）,脂肪組織貯存,,,,輸出,,38,β-氧化,脂肪酸,脂酰輔酶A,線粒體β-氧化,乙酰輔酶A,三羧酸循環(huán),酮體,肝外組織,氧化供能,,,,左旋肉堿,,,,,39,脂質(zhì)代謝障礙,1、血中游離脂肪酸（FFA）增加2、碳水化合物攝取過(guò)多3、肝細(xì)胞線粒體β-氧化障礙4、VLDL合成障礙,,40,胰島素抵抗（IR） NA

19、FLD的發(fā)病機(jī)制,定義：指胰島素作用的靶組織或靶器官（主要是肝臟、肌肉和脂肪組織）對(duì)胰島素生物作用的敏感性下降，即正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)原因：胰島素生物活性下降，或靶器官、靶組織上的受體障礙及受體下調(diào)，或受體后缺陷，對(duì)胰島素表現(xiàn)為一定的抵抗性，敏感性下降**IR是代謝綜合征的“共同土壤”,41,胰島素是調(diào)節(jié)脂肪合成的主要激素胰島素,胰島素抵抗（IR） NAFLD的發(fā)病機(jī)制,脂肪組織內(nèi)

20、的激素敏感性脂肪酶,脂肪動(dòng)員,,,（-）,（-）,脂肪組織內(nèi)的脂蛋白脂酶,脂肪酸進(jìn)入脂肪組織合成與貯存,,,（+）,（+）,血中游離脂肪酸,,,,42,IR,胰島素抵抗（IR） NAFLD的發(fā)病機(jī)制,激素敏感性脂肪酶（TG脂酶）活性增強(qiáng),脂肪動(dòng)員,,,脂蛋白脂酶活性降低,脂肪組織合成與貯存,,,血中游離脂肪酸,,,,,,肝內(nèi)TG合成,,,入肝,脂肪肝,,43,瘦素是肥胖基因（ob基因）表達(dá)的蛋白質(zhì)類激素，

21、主要由白色脂肪組織分泌合成作用：抑制食欲、減少能量攝入、抑制脂肪合成、 增加能量消耗 **瘦素抵抗患者 （1）食欲增強(qiáng)，脂肪合成增多，肥胖 （2）高瘦素血癥，干擾胰島素的生理功能，誘 導(dǎo)IR ，促進(jìn)肝內(nèi)脂肪貯積,瘦素抵抗 NAFLD的發(fā)病機(jī)制,,44,氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化損傷 NAFLD的發(fā)病

22、機(jī)制,肝組織內(nèi)脂肪酸和TG增多 線粒體β-氧化速度代償性 活性氧（ROS） ROS,,,,,激活磷脂酶A2 膜磷脂 花生四烯酸 PG、LT等 激活NF-κB： 細(xì)胞因子表達(dá)增強(qiáng) TNFα、IL-8等,O·2 OH· 1O2 H2O2,,脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)

23、,,,,炎癥反應(yīng),,,,,+不飽和脂肪酸,45,細(xì)胞因子的作用 NAFLD的發(fā)病機(jī)制,,肝組織脂肪酸、ROS增多,激活Kupffer細(xì)胞,釋放大量細(xì)胞因子如TNFα、TGF-β1、PDGF等,肝細(xì)胞炎癥、壞死、肝纖維化,,,,46,細(xì)胞因子的作用 NAFLD的發(fā)病機(jī)制,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1） 肝纖維化主要始動(dòng)因子之一 TGF-β1 肝星狀細(xì)胞（H

24、SC）活化增殖 肌成纖維細(xì)胞并分泌膠原纖維血小板衍生生長(zhǎng)因子 （PDGF） 目前已知的HSC最強(qiáng)的絲裂原，能刺激HSC活化增殖轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生,,,,,47,酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制,長(zhǎng)期大量攝入酒精是導(dǎo)致ALD的主要原因酒精對(duì)肝臟直接毒性作用氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化的作用細(xì)胞因子的作用,第一次打擊,第二次打擊,,,,48,

25、酒精對(duì)肝臟直接毒性作用 AFLD發(fā)病機(jī)制,乙醇,乙醛,乙酸,,乙醇脫氫酶ADH,微粒體乙醇氧化酶系MEOS,,NAD+,NADH,,乙醛脫氫酶,NAD+,NADH,,促進(jìn)自由基產(chǎn)生，促進(jìn)膜的脂質(zhì)過(guò)氧化與丙二醛（MDA）等形成加合物 損傷肝臟抑制VLDL合成 肝內(nèi)TG轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，肝TG堆積,乙醛,,,,NADH/NAD+ 抑制線粒體三羧酸循環(huán)

26、 β-氧化 肝內(nèi)TG堆積,,,,,,,49,氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷 AFLD發(fā)病機(jī)制,酒精含量高時(shí)，其代謝主要由微粒體乙醇氧化酶系（MEOS）起作用MEOS主要成分為細(xì)胞色素P450 2E1（CYP2E1），在酒精誘導(dǎo)下活化，產(chǎn)生大量ROS，引發(fā)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化，造成肝組織炎癥、細(xì)胞損傷,50,細(xì)胞因子的作用 AFLD發(fā)病機(jī)制,ROS等激

27、活Kupffer細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子如TGF-β1、PDGF等 促進(jìn)肝纖維化** TNFα在ALD中占重要地位 長(zhǎng)期大量飲酒 腸道菌群過(guò)度生長(zhǎng)，腸粘膜屏障通透性 腸細(xì)菌移位 腸源性內(nèi)毒素血癥 激活Kupffer細(xì)胞釋放大量TNFα 組織炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞凋亡、壞死 激活

28、中性粒細(xì)胞，增加ROS的生成,,,,,,,,,,,51,脂肪肝實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒎椒?52,理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?與人類疾病特征相似病變有一定發(fā)展過(guò)程，與人類發(fā)病過(guò)程相似形成率高，動(dòng)物死亡率低，重復(fù)性好造模方法簡(jiǎn)單易行，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員無(wú)傷害造模停止后組織學(xué)病變逆轉(zhuǎn)緩慢，便于藥物干預(yù)研究,,,53,脂肪肝實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?NAFLDAFLD,特殊品系脂肪肝動(dòng)物模型營(yíng)養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動(dòng)物模型毒物或藥物性脂肪肝動(dòng)物模型體外誘導(dǎo)模型復(fù)合模型,

29、急性酒精性肝病動(dòng)物模型慢性酒精性肝病動(dòng)物模型體外誘導(dǎo)模型,,,,,,,,54,特殊品系脂肪肝動(dòng)物模型 NAFLD模型 （基因突變或基因敲除）,1、ob/ob小鼠、db/db小鼠（或fa/fa大鼠）ob/ob小鼠—ob基因自發(fā)突變db/db小鼠—db基因自發(fā)突變fa/fa大鼠—fa基因自發(fā)突變,,,瘦素受體缺乏,瘦素抵抗,,瘦素缺乏,,**可出現(xiàn)與人類NAFLD相似的特征： 過(guò)度攝食、肥胖、

30、高脂血癥、高胰島素血癥等,55,特點(diǎn)：該模型雖有明顯的IR，但不能自發(fā)地由單 純性脂肪肝發(fā)展為NASH、肝纖維化解決方案：+蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食、 或內(nèi)毒素、或酒精、或高脂飲食、或再灌 注損傷方可演變?yōu)镹ASH、肝纖維化意義：研究由肝脂肪變向NASH進(jìn)展、 NASH向 纖維化進(jìn)展的良好

31、模型,56,特殊品系脂肪肝動(dòng)物模型 NAFLD模型,2、幼齡內(nèi)臟脂肪變小鼠（JVS）模型 ——系統(tǒng)性肉毒堿缺乏模型表現(xiàn)：出生3~28天，小鼠生長(zhǎng)緩慢，肝腫大，肝 細(xì)胞脂肪變性機(jī)理：肉毒堿是轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化 所必須的物質(zhì)。,57,特殊品系脂肪肝動(dòng)物模型 NAFLD模型,3、FLS小鼠模型

32、 1999年Soga等用同系交配法建立了一種無(wú)過(guò)度攝食、不出現(xiàn)肥胖和糖尿病而伴有脂肪肝的新品種。 表現(xiàn)：新生的FLS小鼠的肝細(xì)胞內(nèi)即有細(xì)小的脂肪顆粒聚集，隨年齡增長(zhǎng)進(jìn)行性加重，肝臟 TG含量較同齡小鼠升高5倍，伴ALT和AST增高、炎癥反應(yīng)，而血脂無(wú)異常。 12個(gè)月多自發(fā)形成肝細(xì)胞癌（HCC），但未見肝硬化意義：可作為人類非肥胖、糖尿病而伴有脂肪肝和人類NASH相關(guān)HCC機(jī)制研究的模型,58,特殊

33、品系脂肪肝動(dòng)物模型 NAFLD模型,特殊品系動(dòng)物模型因基因突變或缺失，引起脂肪代謝障礙，能自發(fā)形成脂肪肝缺點(diǎn)： 1、可建立先天性和幼年型脂肪肝模型，但不適于后天營(yíng)養(yǎng)障礙所致的脂肪肝的研究 2、多缺乏NASH和肝纖維化的自然演變過(guò)程，僅適合NAFLD特定發(fā)病機(jī)制的研究3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成本高，來(lái)源較困難，死亡率高，缺乏廣泛應(yīng)用的可行性,,59,營(yíng)養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動(dòng)物模型 NAFLD模型,1、蛋氨酸-膽堿

34、缺乏（MCD）飲食模型 ——國(guó)際上經(jīng)典的NASH動(dòng)物模型機(jī)理：蛋氨酸、膽堿缺乏導(dǎo)致線粒體β-氧化障礙、 VLDL合成減少表現(xiàn)：MCD飲食小鼠，2周后形成NASH， 肝內(nèi)可見活化的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，伴NF-κB激活、炎性細(xì)胞因子、粘附分子等表達(dá)增加，12W出現(xiàn)肝纖維化特點(diǎn)：MCD飲食模型有明顯的氧化應(yīng)激、線粒體損傷及細(xì)胞凋亡；與人類NAS

35、H相比，動(dòng)物多出現(xiàn)ALT過(guò)高、TG過(guò)低、不引起IR等表現(xiàn),60,意義：用于NSAH及肝纖維化的機(jī)制及藥物篩選、藥物干預(yù)研究，并為非肥胖而伴NASH等特殊脂肪營(yíng)養(yǎng)障礙疾病提供研究思路缺點(diǎn)：MCD飲食價(jià)格昂貴，且不符合人類膳食結(jié)構(gòu),61,營(yíng)養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動(dòng)物模型 NAFLD模型,2、高脂飲食（HFD）模型　 ——國(guó)內(nèi)最常用的模型配方：多種，構(gòu)造原理基本一致，主要差別在于飲食中脂肪占供能物質(zhì)的比例不等

36、（10%~71%），含或不含高碳水化合物特點(diǎn)： A、造模周期長(zhǎng)，約4~12W，甚至半年，成功率高 B、病變有一定的發(fā)展過(guò)程，在發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)上與人類NAFLD 最相似，且多合并肥胖、IR等,62,高脂飲食常用配方,A、華天懿等：高脂飼料喂養(yǎng)大鼠12W 基礎(chǔ)飼料50% +豬油10%+奶粉10%+雞蛋30%表現(xiàn)：大鼠第2W 開始體重增長(zhǎng)加速，至第4W 體重已明顯高于對(duì)照組，肝TG、膽固醇明顯增加，肝細(xì)胞脂

37、肪變。意義：與兒童單純性肥胖癥的自然發(fā)病過(guò)程相似，對(duì)該病及并發(fā)的脂肪肝的防治研究有一定的意義,63,高脂飲食常用配方,B、祁培宏等：普通飼料喂養(yǎng)大鼠1W，再用脂肪乳劑灌胃4W 乳清酸5 %+膽固醇10% +豬油20%+蛋黃粉1%表現(xiàn)：肝臟體積變大，濕重增加，色黃，切面油膩；HE染色肝細(xì)胞呈大泡性脂肪變，血清、肝臟TG、膽固醇顯著升高,64,高脂飲食常用配方,C、徐正婕、鐘嵐、范建高等：HFD飼養(yǎng)雄性SD大鼠 標(biāo)準(zhǔn)

38、飼料88 %+豬油10%+膽固醇2%表現(xiàn)： 4 w出現(xiàn)肝脂肪變；8 w呈現(xiàn)單純性脂肪肝；12 w形成NASH，伴ALT水平升高；24 w出現(xiàn)明顯竇周纖維化；36~48 w纖維化加劇意義：本模型與人類肥胖癥合并高脂血癥及脂肪肝的病例極為相似，可用于血脂調(diào)整藥物防治動(dòng)脈粥樣硬化和脂肪肝的藥理研究,65,高脂飲食常用配方,D、美國(guó)Charles等：高脂液體飼料喂養(yǎng)SD大鼠 脂肪71 %+碳水化合物11%+蛋白18%表現(xiàn)：3

39、周可形成全小葉肝細(xì)胞脂肪變，伴有TNFa和I型膠原mRNA 的表達(dá)增強(qiáng)，可誘發(fā)線粒體損傷和氧化應(yīng)激意義：造模方法簡(jiǎn)單，所需時(shí)間較短，與人體高脂血癥性脂肪肝機(jī)制相似，是一種用于該病研究的經(jīng)典模型缺點(diǎn)：每天灌胃較為繁瑣，操作不當(dāng)可引起動(dòng)物窒息死亡,66,營(yíng)養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動(dòng)物模型 NAFLD模型,3、高糖飲食大鼠模型 高蔗糖/果糖飲食 **在Wistar大鼠的飲用水中加入10%蔗糖，48小時(shí)內(nèi)即能在其體

40、內(nèi)觀察到脂肪酸合成增加 **SD大鼠在含蔗糖70%的飲食喂養(yǎng)后出現(xiàn)肥胖，2~3周可形成脂肪肝，并伴有參與脂肪合成的酶類增加，雄性鼠肝損傷更為嚴(yán)重意義：形成機(jī)制與部分人群，尤其是女性不良飲食習(xí)慣導(dǎo)致的脂肪肝相似。但是雄性鼠比雌性鼠對(duì)高糖誘導(dǎo)的肝損傷具有更高的易感性,67,營(yíng)養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動(dòng)物模型 NAFLD模型,4、禁食后高糖飼料誘發(fā)大鼠脂肪肝模型**Leclercq等將雄性Wister大鼠禁食48h后給予高糖飼料，

41、2d后大鼠肝內(nèi)脂肪含量較正常增加235%，呈現(xiàn)肝細(xì)胞單純性脂肪變性意義：禁食后再進(jìn)食導(dǎo)致脂肪肝的可能機(jī)制為肝臟合成脂肪酸和脂肪酸的循環(huán)失衡，TG的合成和分泌失衡,68,營(yíng)養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動(dòng)物模型 NAFLD模型,5、玉米油注射大鼠脂肪肝模型 墨西哥Terrazos—Luch等采用皮下注射玉米油的方法建立大鼠脂肪肝模型6、全胃腸外營(yíng)養(yǎng)（TPN）脂肪肝模型 予成年大鼠深靜脈插管，導(dǎo)管接電腦輸液泵，將營(yíng)養(yǎng)液

42、以3ml/h的滴速持續(xù)滴注。靜脈營(yíng)養(yǎng)液中非蛋白能量占33%以上，1W后大鼠肝臟即出現(xiàn)明顯的脂肪變性。 此造模方法時(shí)間短、成功率高，但操作復(fù)雜，限制了實(shí)驗(yàn)的廣泛應(yīng)用,,69,毒物或藥物性脂肪肝動(dòng)物模型 NAFLD模型,1、四氯化碳（CCl4）誘發(fā)模型　 CCl4 0.5ml/kg，每周3次，大鼠皮下注射 表現(xiàn)：短時(shí)間內(nèi)即可觀察到中央靜脈周圍中重度大泡性肝細(xì)胞脂肪變，伴炎癥及壞死；6W可出現(xiàn)肝纖維

43、化；12W可見肝硬化。機(jī)理：CCl4誘導(dǎo)CYP2E1激活及嚴(yán)重脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)造成肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能破壞優(yōu)缺點(diǎn)：模型復(fù)制率100%，但死亡率高達(dá)20~40%,70,毒物或藥物性脂肪肝動(dòng)物模型 NAFLD模型,2、四環(huán)素誘發(fā)模型　 *雄性大鼠一次性口服四環(huán)素1 g/kg，在24h即可見肝細(xì)胞小泡性脂肪變，并伴膽固醇、TG合成增加及脂肪酸β-氧化受抑制。 *另有報(bào)道，經(jīng)四環(huán)素單次誘導(dǎo)即可使肝臟TG水平

44、增加270%，并出現(xiàn)小泡性脂變。機(jī)理：四環(huán)素沉積于肝細(xì)胞線粒體，抑制線粒體DNA復(fù)制，干擾mRNA翻譯成載脂蛋白，繼而影響肝內(nèi)TG的轉(zhuǎn)運(yùn)及線粒體脂肪酸的β-氧化,71,毒物或藥物性脂肪肝動(dòng)物模型 NAFLD模型,藥物或毒物誘導(dǎo)模型具有成型時(shí)間短、方法簡(jiǎn)便、病變明顯等特點(diǎn) 但其發(fā)病機(jī)制、病理、病理生理改變與人類常見脂肪肝類型差異較大，未出現(xiàn)肥胖和IR，且動(dòng)物肝損傷嚴(yán)重，死亡率高,,72,體外誘導(dǎo)模型

45、 NAFLD模型 ——肝細(xì)胞株脂肪變性模型,**2002年日本Okamoto等，用含有1 mmol／L油酸的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)人HepG2細(xì)胞24h，成功地建立了一個(gè)體外的脂肪肝模型，細(xì)胞內(nèi)TG增加**以正常成人肝細(xì)胞株（L-02）等為材料，在培養(yǎng)液中加入不同濃度的TG、油酸、亞油酸、花生四烯酸等脂質(zhì)建立體外脂肪肝模型意義：應(yīng)用此模型可在細(xì)胞水平進(jìn)行脂肪

46、肝發(fā)病機(jī)制及干預(yù)治療的體外研究,73,復(fù)合模型 NAFLD模型,目的：在基因模型的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)、藥物誘發(fā)模型，試圖使新模型的表型與人類NAFLD更接近，并能反映疾病從單純性脂肪肝向NASH進(jìn)展，NASH向肝纖維化進(jìn)展的過(guò)程常見復(fù)合模型：ob/ob小鼠+MCD飲食，db/db小鼠+MCD飲食，fa/fa大鼠+HFD等意義：復(fù)合模型均可產(chǎn)生IR、肥胖以及NASH和纖維化，最大程度地模

47、擬了人類NAFLD的復(fù)雜性，病理變化顯著，是一種極具潛力的NASH模型,,74,急性酒精性肝病動(dòng)物模型 AFLD模型,健康成熟雄性Wistar或SD大鼠， 自由飲水+普通飼料 1、56度白酒灌胃，每次7ml/kg，每日2次 2、腹腔注射一定濃度乙醇，每次20ml/kg，每日2次 1~2W后成功復(fù)制大鼠急性酒精性肝損傷模型，表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。 灌胃法明顯優(yōu)

48、于腹腔注射法，后者死亡率高，且不符合人類的飲酒習(xí)慣,75,慢性酒精性肝病動(dòng)物模型 AFLD模型,1、酒精液體飲料模型 A、大鼠模型：Keegan等在飲水中加40%酒精，29W后實(shí)驗(yàn)鼠出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變、炎癥、壞死和中央靜脈周圍硬化優(yōu)點(diǎn)：造模方法簡(jiǎn)單，與人類酒精性肝病相近缺點(diǎn)：耗時(shí)長(zhǎng)，且大鼠厭酒，攝入量難以控制 B、微豬模型：固體飼料+占每日熱量40%的酒精飲料，1個(gè)月后血ALT升高，12個(gè)月后出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變，局

49、灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)及中央靜脈周圍纖維化優(yōu)點(diǎn)：微豬可隨意食用酒精飲料，與人類酒精性肝損傷較接近和較自然的動(dòng)物模型缺點(diǎn)：造模時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用較高,76,慢性酒精性肝病動(dòng)物模型 AFLD模型,2、酒精灌胃模型 A、Tsukamato-French大鼠模型Tsukamato-French等給SD大鼠手術(shù)植入胃管，持續(xù)注入含酒精的液體食料，維持大鼠血中200～300mg/dl的酒精濃度。表現(xiàn)：造模3個(gè)月，成功的建立了從肝細(xì)胞脂肪

50、變性、小葉中央壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)至肝纖維化的進(jìn)行性酒精性肝損傷模型優(yōu)點(diǎn)：可完全控制酒精和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入量，且病變符合進(jìn)行性酒精性肝損傷的演變規(guī)律缺點(diǎn)：造模技術(shù)復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)設(shè)備較昂貴、強(qiáng)制性持續(xù)注入含酒精食料，不符合人類脂肪肝形成過(guò)程,77,酒精灌胃模型,B、美國(guó)Iimuro等選用年齡和體重匹配的雌性和雄性Wister大鼠，酒精灌胃（11-12g/kg/d）4W，雌性大鼠血清AST高于雄性大鼠，肝組織脂肪變、炎癥及壞死亦以雌性鼠發(fā)展

51、更快、更嚴(yán)重，累及全小葉，說(shuō)明雌性大鼠對(duì)乙醇導(dǎo)致的肝損傷更敏感 C、范建高等在大鼠高脂飲食基礎(chǔ)上，用60%的酒精15mg/kg灌胃，每日2次，3個(gè)月后出現(xiàn)輕、中度肝細(xì)胞脂肪變，6個(gè)月時(shí)出現(xiàn)中度以上脂肪變、局灶性炎癥伴肝細(xì)胞壞死和纖維化,78,慢性酒精性肝病動(dòng)物模型 AFLD模型,3、 Liber-Decarli大鼠模型 Liber和Decarli配制出含酒精和全營(yíng)養(yǎng)素的液體食料：糖類47%（其中36%的熱量

52、由酒精代替），蛋白質(zhì)18%，脂肪35%，及適量的維生素和無(wú)機(jī)鹽。 造模大鼠只喂該食料，酒精攝入量達(dá)12～18g/kg，造模4W即出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞脂肪變性。 優(yōu)點(diǎn)：Liber-Decarli液體食料已商品化出售，還可用于小鼠、家兔、豚鼠等。該模型簡(jiǎn)便易行，費(fèi)用低，形成率高及穩(wěn)定性好,79,體外誘導(dǎo)模型 AFLD模型,2010年廖于等用含0.28%乙醇的培養(yǎng)液，培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞株（L-

53、02）。誘導(dǎo)、傳代至第30代（Ld30，6天為一周期），L-02細(xì)胞發(fā)生脂肪變，細(xì)胞內(nèi)TG顯著增加，即AFLD模型成功建立。,80,我們的造模方法,1、NAFLD大鼠模型 20%玉米油（高溫煮沸）+80%普通飼料，自由飲用清水。 大鼠進(jìn)食量多，體重增加明顯。 6W后肝組織內(nèi)彌漫性細(xì)胞脂肪變性，部分肝組織出現(xiàn)點(diǎn)狀或灶狀壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血清TG、AST、ALT，肝臟TG均顯著增高。造模成功。,

54、81,我們的造模方法,2、高脂-酒精混合性脂肪肝大鼠模型 高脂飼料（同上），56度白酒灌胃（10ml/kg），每日1次，自由飲用清水。 **6W后，血清TG、AST、ALT，肝臟TG均顯著增高，肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯，壞死灶多見，部分可見纖維組織增生。 脂肪肝復(fù)制成功率100%，脂肪性肝炎發(fā)生率45%優(yōu)點(diǎn)：兩種模型，均是模擬現(xiàn)代人類飲食結(jié)構(gòu)的改變及脂肪肝的成因，符合人類脂肪肝的演變過(guò)程，方法簡(jiǎn)單

55、易行，原料價(jià)廉易得，耗時(shí)較短，成功率高。,82,高脂+酒精組，大泡、小泡性脂變混雜，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),高脂+酒精組，電鏡下肝細(xì)胞間膠原纖維增生,83,脂肪肝的診斷,,84,脂肪肝的診斷,影像學(xué)檢查：B超、CT 組織病理學(xué)診斷 肝活檢是脂肪肝診斷及分級(jí)的金標(biāo)準(zhǔn) 實(shí)驗(yàn)室檢查中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組 2010年在原來(lái)的診療指南（2006年）基礎(chǔ)上進(jìn)行修訂，新制定了NAFLD與酒精性肝病的診療指南,85

56、,關(guān)于脂肪肝組織標(biāo)本染色,大多數(shù)脂肪肝肝內(nèi)沉積的脂肪為TG，普通HE染色顯示肝細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，一般無(wú)需特殊染色小泡性脂肪肝，空泡不明顯，需作冷凍切片油紅O染色顯示纖維結(jié)締組織，以診斷纖維化：Masson三色染色、VG染色、網(wǎng)狀纖維染色（Gordon-Sweets銀染法）,,86,小泡性脂變，微小脂泡被油紅O染成紅色（油紅O×300）,,87,酒精性肝硬化，小結(jié)節(jié)性，肝細(xì)胞脂變，纖維間隔寬（Masson×4

57、0）,88,實(shí)驗(yàn)室檢查,影響脂肪肝形成的指標(biāo) 脂肪肝形成后的指標(biāo)變化,,89,影響脂肪肝形成的指標(biāo),1、血脂類 血清總膽固醇（TC）、TG、游離脂肪酸（FFA）等 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)可直接測(cè)定肝勻漿中的TC、TG2、胰島素抵抗（IR） 血糖、胰島素等3、其他 瘦素、TNFα（或可溶性腫瘤壞死因子受體sTNFR）等,90,脂肪肝形成后的指標(biāo)變化,1、肝酶類 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨

58、酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）等2、氧化應(yīng)激指標(biāo)過(guò)氧化水平：丙二醛（MDA）、ROS抗氧化水平：超氧化物歧化酶（SOD）、 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）**動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可直接測(cè)定肝勻漿中的各指標(biāo),91,脂肪肝形成后的指標(biāo)變化,3、纖維化指標(biāo)A、血清透明質(zhì)酸（HA） 最具有臨床實(shí)用價(jià)值的一個(gè)指標(biāo)，在纖維化早期即顯著升高，可反映肝纖維化的程度、活動(dòng)

59、性B、膠原及代謝物 血清Ⅲ型前膠原氨基端肽（ PⅢP）：肝硬化早期↑ 血清Ⅲ型前膠原（PCⅢ）：與肝纖維化程度正相關(guān) Ⅳ型和Ⅰ型膠原等C、細(xì)胞因子： TGFβ1、PDGF等,92,脂肪肝的防治,,93,一、預(yù)防為主戒除劣習(xí)、合理膳食、合理運(yùn)動(dòng)、心情健康,,,94,二、去除病因，控制原發(fā)病 輕中度單純性脂肪肝可恢復(fù)正常三、藥物治療1、改善IR（胰島素增敏劑） 雙胍類、噻唑烷二酮（羅格列酮等）、脂聯(lián)素等

60、2、調(diào)整血脂紊亂（降脂藥物） 辛伐他汀、立普妥（阿托伐他汀）、非諾貝特等3、減少腸源性內(nèi)毒素血癥 抗生素：新霉素、多粘菌素B,95,4、減少活性氧的損傷作用（抗氧化劑） GSH前體藥：N-乙酰半胱氨酸（NAC）、 S-腺苷甲硫氨酸 VitE、VitC、普羅布考、水飛薊素（益肝靈）5、修復(fù)細(xì)胞生物膜（生物膜保護(hù)劑） 易善復(fù)（肝得?。?、細(xì)胞因子