車前草多糖對雞新城疫疫苗免疫效果的研究.pdf

1、近年來畜禽傳染病嚴(yán)重危害畜牧產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，尤其是病毒性傳染病，迄今，疫苗預(yù)防是對其控制最重要的措施。許多疫苗依賴佐劑來增強(qiáng)抗原的免疫抗原性或改變宿主的保護(hù)性應(yīng)答類型。佐劑是先于抗原或與抗原同時應(yīng)用時能增強(qiáng)抗原物質(zhì)免疫原性，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，或改變機(jī)體免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)，單獨(dú)使用時一般無免疫原性。佐劑在免疫中的作用主要是提升機(jī)體免疫系統(tǒng)對抗原韻免疫應(yīng)答反應(yīng)，包括增強(qiáng)免疫反應(yīng)強(qiáng)度和反應(yīng)的持久性。近年來，研究發(fā)現(xiàn)植物多糖具有免疫佐劑的作用，

2、能夠增強(qiáng)疫苗的免疫效果，促進(jìn)機(jī)體特異性免疫與非特異性免疫、細(xì)胞免疫與體液免疫。植物多糖類佐劑具有天然、低毒、無藥物殘留等優(yōu)點(diǎn)，在使用安全性方面具有優(yōu)勢。但目前能夠應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中的植物多糖類佐劑不多，尋找一種資源豐富的植物多糖類佐劑以滿足生產(chǎn)實踐需要迫在眉睫。
　　車前草是車前草科植物，廣布全世界，有三屬約270種，在我國僅有車前屬，共18種。車前草在我國分布極廣，是一味傳統(tǒng)中藥，具有清熱、涼血、解毒、利尿等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)的研究

3、表明，車前草含有豐富的生物活性成分，如多糖類、黃酮類、熊果酸及苷類等。多糖是車前草發(fā)揮生物活性的主要物質(zhì)。Berit等(1995)對車前草中具有生物活性的多糖進(jìn)行分離，并探明其部分結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，有L-阿拉伯糖(20％)，D-半乳糖(28％)，D-葡萄糖(6％)，D-甘露糖(2％)，L-鼠李糖(4％)，D-葡萄糖酸(31％)及少量D-木糖和炭藻糖，主要以B-1，4連接為主鏈，2和3位含側(cè)鏈。目前關(guān)于車前草多糖作為免疫增強(qiáng)劑的研究顯有報道。

4、本課題采用車前草多糖作為新城疫疫苗佐劑，研究車前草多糖的免疫增強(qiáng)作用。
　　1.車前草多糖提取純化工藝及生物學(xué)活性的研究
　　采用超聲輔助提取法提取車前草多糖，根據(jù)單因素試驗，篩選出影響多糖提取的岡素及水平，通過均勻設(shè)計方法進(jìn)行因素及水平的優(yōu)化，確定最佳提取工藝為:超聲時間60min、溫度60攝氏度、料液比1∶30，提取率為75.88mg/g。對提取的車前草粗制多糖進(jìn)行純化，采用三氯乙酸法脫蛋白，脫蛋白率為52.1％，采用活

5、性炭脫色，脫色率為82.3％。對車前草理化性質(zhì)的分析:車前草多糖為黃褐色粉末狀物質(zhì);可溶于水、稀酸、稀堿;不溶于乙醇、石油醚、丙酮、正丁醇等有機(jī)溶劑;含有還原糖;不含淀粉、單糖和二糖;車前草多糖溶液PH為7.8。車前草多糖具有體外清除自由基的作用，車前草多糖濃度70μg/ml時對·OH-的清除率為41.1％;濃度為125μg/ml時對O2-·清除率為37.2％;濃度為160μg/mll時對NO2-·清除率為72.5％。
　　2.車

6、前草多糖對雛雞生長增重、生理生化指標(biāo)及免疫器官指數(shù)的影響
　　用車前草多糖溶液連續(xù)6天飼喂雛雞，對照組飼喂等量生理鹽水，并于給藥后第5(D5)、10(D10)、15(D15)、20(D20)、28(D28)天，采樣進(jìn)行生長增重、血常規(guī)、生理生化指標(biāo)、免疫器官臟器指數(shù)測定及免疫器官組織學(xué)觀察。結(jié)果顯示:隨著日齡增加，在D10、D15、D20、D28天，車前草多糖組雛雞體重分別為214.35g、359.71g、633.44g、826.

7、52g極顯著的高于空白對照組;在給藥后第D5～D15天車前草多糖組RBC(1.84～2.45×1012/L)顯著高于空白組RBC(1.40～2.14×1012/L)，(P＜0.05);在給藥后第D28天車前草多糖組WBC（258.8×109/L）顯著高于空白組WBC(128.1×109/L)，(P＜0.05);在給藥后第D10～D28天，車前草多糖組GOT(131.9～27.57IU/L)和GPT(8.53～16.99IU/L)顯著或極

8、顯著地高于空白對照組GOT(27.2～19.67IU/L)和GPT(2.58～5.87IU/L），(P＜0.05，P＜0.01);在D5～D28天車前草多糖組AKP(10.47～10.15IU/L)和PCa(1.59～1.01 mmol/ml)與空白對照組AKP（7.54～3.4IU/L）和PCa(1.31～1.07 mmol/ml)差異不顯著;在D5～D28天車前草多糖組胸腺指數(shù)（2.04±0.28～2.93±0.23）、脾臟指數(shù)（1

9、.2±0.14～1.90±0.12）與法氏囊指數(shù)（4.11±0.46～5.98±0.25）顯著或極顯著地高于空白對照組胸腺指數(shù)（1.38±0.24～2.40±0.31）、脾臟指數(shù)(1.06±0.32～1.52±0.28）與法氏囊指數(shù)(2.54±0.77～4.47±0.29)，(P＜0.05，P＜0.01);觀察脾臟組織切片時發(fā)現(xiàn)，給藥后D5～D20天，車前草多糖組的雛雞脾臟紅髓淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均較對照組多;觀察胸腺組織切片時發(fā)

10、現(xiàn)，給藥后D10～D20天，車前草多糖組的胸腺小葉面積均大于對照組;觀察法氏囊組織切片時發(fā)現(xiàn)，給藥后D10～D28天時車前草多糖組的腔上囊小節(jié)顯著大于對照組。以上結(jié)果證明車前草多糖能夠促進(jìn)雛雞生長增重，促進(jìn)器官發(fā)育及提高免疫水平。
　　3.車前草多糖對新城疫疫苗免疫效果的影響
　　將320羽1日齡雛雞隨機(jī)分為7組，即:雞新城疫(ND)疫苗免疫組、ND疫苗+車前草多糖（50mg/ml）組、ND疫苗+車前草多糖(25mg/ml)

11、組、ND疫苗+車前草多糖(12.5mg/ml)組，同時設(shè)立ND疫苗+黃芪多糖(1.5g/ml)組、ND疫苗+地塞米松(2.5mg/ml)組和健康組為對照，于首次注射后第7(D7)、14(D14)、21(D21)、35(D35)天，每組隨機(jī)抽取雛雞采樣，測定臟器指數(shù)、血凝抑制抗體效價、外周血T淋巴細(xì)胞增殖率及外周血T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+的比值。臟器指數(shù)的結(jié)果顯示:車前草多糖50mg/ml劑量組胸腺指數(shù)（6.45±0.24～3.07±

12、0.17）、脾臟指數(shù)（3.12±0.11～2.05±0.11）與法氏囊指數(shù)（7.66±0.09～3.31±0.13）及黃芪多糖組胸腺指數(shù)（6.07±0.56～3.24±0.22）、脾臟指數(shù)（3.31±0.42～2.11±0.16）與法氏囊指數(shù)（8.06±0.09～3.45±0.16）顯著或極顯著的高于ND免疫組胸腺指數(shù)（4.23±0.13～2.77±0.12）、脾臟指數(shù)（2.28±0.11～1.83±0.12）與法氏囊指數(shù)（5.86±0

13、.45～2.97±0.12），(P＜0.05，P＜0.01)。抗體效價的結(jié)果顯示:車前草多糖50mg/ml(11.25～9.50)、25mg/ml(10.25～8.75)、12.5mg/ml(10.00～8.50)劑量組及黃芪多糖組(11.25～9.50)在D14～D28極顯著的高于ND免疫組(8.75～6.75)，(P＜0.01);地塞米松組(5.33～5.00)在D14～D35極顯著的低于ND免疫組(8.75～6.75)，(P＜0.

14、01)。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的結(jié)果顯示:車前草50mg/ml劑量組（2.1733±0.042～2.0623±0.061）及黃芪多糖組（2.0678±0.059～2.0267±0.099）在D7～D28天，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均極顯著的高于ND疫苗組(1.8967±0.031～1.7213±0.084)，(P＜0.01);地塞米松組(1.5633±0.045～1.5723±0.045)在D7～D21極顯著的低于ND免疫組（1.8967±0.031～

15、1.7213±0.084），(P＜0.01)。CD4+/CD8+比值的結(jié)果顯示:車前草多糖50mg/ml劑量組（1.9186±0.035～1.8013±0.028）在D7～D35天CD4+/CD8+的比值極顯著或顯著的高于ND疫苗組（1.6417±0.02～1.3507±0026），(P＜0.01，P＜0.05);車前草多糖25mg/ml（2.0347±0.035～1.7573±0.028）、12.5mg/ml劑量組（2.070±0.0

16、61～1.7487±0.02）和黃芪多糖組（2.0263±0.043～1.7620±0.03）在D14～D35天CD4+/CD8+的比值極顯著高或顯著高于ND疫苗組(1.5867±0.04～1.3507±0026)，(P＜0.01，P＜0.05);:車前草多糖50mg/ml劑量組（1.9186±0.035～2.0697±0.036）在D7～D21天CD4+/CD8+的比值顯著的高于黃芪多糖組（1.7710±0.006～1.7593±0.